專利名稱：Trichoderma reesei木聚糖酶的制作方法
政府贊助的研究和發(fā)展不適用。
背景技術(shù)：
木材的復(fù)雜結(jié)構(gòu)包括纖維素，半纖維素和木質(zhì)素，以及其它次要成分。木質(zhì)素和纖維素與半纖維素相結(jié)合，并且可能部分共價(jià)鍵合纖維素與半纖維素兩者。在造紙工藝中，通常從木漿中去除木質(zhì)素，因?yàn)槠鋷砗稚?，降低了?qiáng)度并且給最終產(chǎn)品帶來其它不期望的特征。能夠用很多方法實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的去除。
通過化學(xué)制漿(例如Kraft方法)最初從木漿中去除大部分木質(zhì)素。在接下來的漂白過程中，化學(xué)紙漿常常與氯和其它去木質(zhì)化學(xué)品反應(yīng)進(jìn)一步去除木質(zhì)素，并且然后與漂白劑反應(yīng)來修飾來自紙漿的木質(zhì)素，給出穩(wěn)定的變白的紙漿。但是，從環(huán)境角度出發(fā)不期望用氯處理，因?yàn)楫a(chǎn)生的排放物含有大量有毒化合物(例如氯化酚類)?？紤]到用含氯化學(xué)品漂白的紙漿引起的環(huán)境有害作用，驅(qū)使工業(yè)尋求可替代的漂白方法。
文獻(xiàn)中描述過利用木聚糖酶和來自真菌和細(xì)菌來源的其它酶來增強(qiáng)去木質(zhì)作用和增白(brightening)，同時(shí)減少或消除氯化合物的使用的嘗試。但是，現(xiàn)有酶體系通常不容易實(shí)現(xiàn)半纖維素的降解或去木質(zhì)作用達(dá)到充分的程度。通過應(yīng)用另外的木聚糖酶可以提高半纖維素的降解和去木質(zhì)作用的程度，所述另外的木聚糖酶以不同的方式裂解木聚糖或者與其它木聚糖酶，半纖維素酶，其它酶，或者甚至化學(xué)品協(xié)同作用。
已經(jīng)鑒定和表征了多種來自真菌和細(xì)菌微生物的木聚糖酶(參見，例如，美國(guó)專利5,437,992；Coughlin，M.P.上文；Biely，P.等，Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reeseiCellulases and Other Hydrolases，Espoo 1993，P.Souminen和T.Reinikainen編著，F(xiàn)oundation for Biotech nical and IndustrialFermentation Research 8125-135(1993))。特別地，已經(jīng)在T.reesei中鑒定了三種具體的木聚糖酶(XYL-I，XYL-H，和XYL-III)(Tenkanen，等，Enzyme Microb.Technol.14566(1992)；Trrnen，等，Bio/Technology 101461(1992)；和Xu，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.49718(1998))。
盡管文獻(xiàn)中描述過很多種木聚糖酶，但是依然存在鑒定在與動(dòng)物飼料，谷物加工，生物燃料，洗滌，織物護(hù)理，化學(xué)品，植物加工，和對(duì)紙漿和紙去木質(zhì)和增白相關(guān)的應(yīng)用中更有效的新的木聚糖酶的需要。
發(fā)明概述申請(qǐng)人鑒定了cDNA克隆，其編碼這里指定為XYL-IV的新的木聚糖酶并且與前面描述的木聚糖酶具有一定序列同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼XYL-IV的DNA的分離的核酸分子。在某些方面，所述分離的核酸包括編碼具有圖2所示氨基酸序列(SEQ ID NO2)的XYL-IV的DNA，或者與這樣的編碼核酸序列互補(bǔ)。優(yōu)選地，編碼XYL-IV蛋白質(zhì)的DNA來自微生物，優(yōu)選來自真菌或細(xì)菌。優(yōu)選地，所述DNA來自絲狀真菌例如木霉屬(Trichodermaspp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，鐮孢屬(Fusarium spp.)，青霉屬(Penicillium spp.)，或者膠霉屬(Gliocladium spp.)，更優(yōu)選來自木霉屬(Trichoderma spp)。還優(yōu)選所述DNA包括SEQ ID NO1的核苷酸序列?；蛘撸鯠NA與SEQ ID NO1的核苷酸序列具有至少50％，60％，或70％，優(yōu)選至少85％或90％的序列同一性，或者包括SEQID NO1核苷酸序列的衍生物，其中所述DNA編碼裂解木聚糖，支化木聚糖或木寡糖(xylooligosaccharides)的XYL-IV蛋白質(zhì)。包括這樣的DNA的載體，轉(zhuǎn)化有這樣的載體的宿主細(xì)胞，以及這樣的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)酵肉湯也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了部分或全部分離的XYL-IV蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述XYL-IV來自微生物，優(yōu)選來自真菌或細(xì)菌。優(yōu)選地，所述XYL-IV來自絲狀真菌，更優(yōu)選來自絲狀真菌例如木霉屬(Trichoderma spp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，鐮孢屬(Fusariumspp.)，青霉屬(Penicillium spp.)，或者膠霉屬(Gliocladium spp.)，最優(yōu)選來自木霉屬(Trichoderma spp)。特別地，本發(fā)明提供了分離的天然序列XYL-IV，其在一個(gè)實(shí)施方案中，包括包含圖2的第1-465位殘基(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述XYL-IV包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少50％或70％，優(yōu)選至少85％或90％序列同一性，或者包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的衍生物，其中XYL-IV裂解木聚糖。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了制備XYL-IV蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)獲得用包括編碼XYL-IV蛋白質(zhì)的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)在適合表達(dá)并且任選地適合XYL-IV蛋白質(zhì)分泌的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(c)從含有XYL-IV蛋白質(zhì)的發(fā)酵肉湯回收。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與XYL-IV蛋白質(zhì)或者其結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的抗體。任選地，所述抗體是單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用XYL-IV蛋白質(zhì)或者編碼XYL-IV蛋白質(zhì)的DNA的方法。
附圖的簡(jiǎn)要描述


圖1說明在混合碳源上培養(yǎng)之后從Trichoderma reesei RNA獲得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2說明來自Trichoderma reese的新XYL-IV的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3說明沿著
圖1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)限制酶切位點(diǎn)的位置。
圖4說明HexA3Xyl3的有效水解。數(shù)值來自表5。
圖5說明通過XYL-IV自木聚糖，MeGIcA-木聚糖和黑麥的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)產(chǎn)生還原糖。每一種木聚糖以5g/L存在，并且反應(yīng)在40℃和pH4下進(jìn)行。
圖6a和6b說明XYL-IV和XYL-I及-II每一種的協(xié)同作用。
作為還原糖(圖6a)和游離的木糖(圖6b)測(cè)定產(chǎn)物。數(shù)值來自表6。
圖7a-d說明XYL-I和XYL-IV逐步作用中的協(xié)同作用。在圖7a和7b中，底物是MeGIcA-木聚糖。在圖7c和7d中，底物是黑麥阿拉伯木聚糖。數(shù)值來自表7。
本發(fā)明的詳細(xì)描述定義應(yīng)該注意，如在該說明書和附加的權(quán)利要求書中使用的，除非另有明確說明，單數(shù)形式“一個(gè)”，“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，關(guān)于含有“化合物”的組合物包括兩種或多種化合物的混合物。還應(yīng)該注意，除非另有明確說明，術(shù)語“或者”一般以其包括“和/或”的意義被使用。
“木聚糖酶”指來自微生物例如真菌，細(xì)菌，或者來自植物或動(dòng)物的蛋白質(zhì)或多肽的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)域，并且其具有在木聚糖碳水化合物骨架(包括支化的木聚糖和木寡糖)的一個(gè)或多個(gè)不同的位點(diǎn)催化裂解木聚糖的能力。在一定條件下，木聚糖酶也可以催化從較小的單元合成糖例如木聚糖或木寡糖。文獻(xiàn)中已知來自T.Reesei的三種具體的木聚糖酶。
如這里所使用的，“XYL-IV”指具有木聚糖酶活性的酶，并且其一般在其天然或野生形式?jīng)]有纖維素結(jié)合域。本發(fā)明的XYL-IV包括包含圖2的第1-465位殘基(SEQ ID NO2)的蛋白質(zhì)，與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少50％或70％，優(yōu)選至少85％或90％序列同一性的蛋白質(zhì)，或者SEQ ID NO2的氨基酸序列的衍生物，其中XYL-IV裂解木聚糖。本發(fā)明提供的XYL-IV具體排除三種已知的T.Reesei木聚糖酶，它們被稱為XYL-I，XYL-II(屬于糖基水解酶家族11)，和XYL-III(屬于糖基水解酶家族10)，并且描述于Trrnen，等和Xu，等，上文。相信XYL-IV以和三種已知的T.Reesei木聚糖酶不同的方式作用于木聚糖，但是也可以裂解某些相同的位置。
這里考慮XYL-IV可以來自各種各樣的任何來源，包括微生物，例如真菌或細(xì)菌，植物，或動(dòng)物。具體地說，預(yù)計(jì)具有纖維素溶解能力的微生物將是極好的XYL-IV蛋白質(zhì)的來源。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，XYL-IV來自木霉屬(Trichoderma spp.)，特別是Trichodermareesei。但是，還優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的XYL-IV和/或編碼XYL-IV的DNA來自真菌，例如，犁頭霉屬(Absidia spp.)；支頂孢屬(Acremonium spp.)；蘑菇屬(Agaricus spp.)；Anaeromyces spp.；曲霉屬(Aspergillus spp.)，包括棘孢曲霉(A.aculeatus)，泡盛曲霉(A.awamori)，黃色曲霉(A.flavus)，臭曲霉(A.foeti dus)，丁烯二酸曲霉(A.fumari cus)，煙曲霉(A.fumigatus)，構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)，黑色曲霉(A.niger)，米曲霉(A.oryzae)，土曲霉(A.terreus)和雜色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidium spp.；頭孢屬(Cephalosporium spp.)；毛殼霉屬(Chaetomiumspp.)；Coprinus spp.；Dactyllum spp.；鐮孢屬(Fusarium spp.)，包括F.conglomerans，多隔鐮孢(F.decemcellulare)，爪哇鐮孢(F.javanicum)，亞麻鐮孢(F.lini)，尖孢鐮孢(F.oxysporum)和茄病鐮孢(F.solani)；膠霉屬(Gliocladium spp.)；腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，包括H.insolens和H.lanuginosa；毛霉屬(Mucor spp.)；鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，包括粗糙鏈孢霉(N.crassa)和嗜食鏈孢霉(N.sitophila)；Neocallimastix spp.；Orpinomyces spp.；青霉屬(Penicillium spp)；Phanerochaete spp.；射脈菌屬(Phlebia spp.)；Piromyces spp.；根霉屬(Rhizopus spp.)；裂褶菌屬(Schizophyllum spp.)；栓菌屬(Trametes spp.)；木霉屬(Trichoderma spp.)，包括T.reesei，T.reesei(longibrachiatum)和綠色木霉(T.viride)；和接霉屬(Zygorhynchus spp.)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的XYL-IV蛋白質(zhì)是分離的或純化的。所謂純化或分離指通過將XYL-IV與其自然界相關(guān)的天然存在成分的一些或全部分開而從其自然狀態(tài)改變XYL-IV蛋白質(zhì)。這樣的分離或純化可以通過本領(lǐng)域公知的分離技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如離子交換層析，親和層析，疏水分離，透析，蛋白酶處理，硫酸銨沉淀或者其它蛋白質(zhì)鹽沉淀，離心，大小排阻層析，過濾，微過濾，凝膠電泳或者梯度分離來去除全部的細(xì)胞，細(xì)胞碎屑，雜質(zhì)，外來蛋白質(zhì)，或者最終組合物中不期望的酶。然后還可以向含有XYL-IV的組合物中加入提供另外的益處的成分，例如，活化劑，抗抑制劑，期望的離子，控制pH的化合物或者其它酶。優(yōu)選地，通過重組方法制備根據(jù)本發(fā)明的XYL-IV蛋白質(zhì)。
如這里所使用的，“微生物”指細(xì)菌，真菌，病毒，原生動(dòng)物，和其它微生物或微生物體。如這里所使用的，“植物”指植物界的任何成員。如這里所使用的，“動(dòng)物”指動(dòng)物界的任何成員。動(dòng)物可以是單細(xì)胞動(dòng)物或多細(xì)胞動(dòng)物。
如這里所使用的，“衍生物”指通過在C-末端和N-末端之一或兩端加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)不同的位點(diǎn)替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在蛋白質(zhì)的一端或兩端或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而從前體蛋白質(zhì)(例如天然蛋白質(zhì))衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選通過修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將該DNA序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，并且表達(dá)該經(jīng)修飾的DNA序列，形成衍生的XYL-IV，實(shí)現(xiàn)XYL-IV衍生物的制備。
本發(fā)明的“衍生物”包括其中肽保留了前體XYL-IV的特征性XYL-IV特性但是在某些具體方面具有改變的性質(zhì)的與前體氨基酸序列(例如，野生型或天然狀態(tài)XYL-IV)相比包括改變的氨基酸序列的肽。例如，所述XYL-IV衍生物可以具有提高的最適pH值或提高的溫度或氧化穩(wěn)定性但是保留其特征性木聚糖修飾活性。類似地，根據(jù)本發(fā)明的衍生物包括纖維素結(jié)合域，其可以以這樣的方式被加入，去除或修飾，使得顯著削弱或增強(qiáng)其纖維素結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明的衍生物包括木聚糖或者其它底物的結(jié)合域，其已經(jīng)被加入或修飾來改變其底物結(jié)合能力。還考慮根據(jù)本發(fā)明的衍生物衍生自其中保留表達(dá)的XYL-IV衍生物的功能活性的編碼XYL-IV衍生物的DNA片段。衍生物進(jìn)一步包括改變XYL-IV特征的化學(xué)修飾。
通常，XYL-IV衍生物與圖2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)具有至少大約50％，70％，或85％的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少大約85％氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90％氨基酸序列同一性，甚至更優(yōu)選至少大約95％氨基酸序列同一性，和更優(yōu)選98％氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，所有的氨基酸替代是使用L-氨基酸的“保守型氨基酸替代”，其中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)生物學(xué)類似氨基酸替代。保守型氨基酸替代是保持被替代的氨基酸的總電荷，疏水性/親水性，和/或空間位阻的那些。保守型替代的例子是下面各組中的那些Gly/Ala，Val/Ile/Leu，Lys/Arg，Asn/Gln，Glu/Asp，Ser/Cys/Thr，和Phe/Trp/Tyr。衍生物的不同可以在于，例如，1-10個(gè)這樣少的氨基酸殘基，例如6-10個(gè)，象5這樣少，象4，3，2這樣少，或者甚至1個(gè)氨基酸殘基。
如這里使用的，“天然序列XYL-IV”包括具有和從自然得到的XYL-IV相同的氨基酸序列的多肽。這樣的天然序列XYL-IV可以從自然界分離或者可以通過重組或合成方法制備。術(shù)語"天然序列XYL-IV"具體包括天然存在的XYL-IV的截短或分泌形式和XYL-IV的天然存在的變體形式(例如，不同剪接形式)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，天然序列XYL-IV包括圖2的第1-465位氨基酸(SEQ ID NO2)。
如這里使用的，與這里鑒定的氨基酸或核苷酸序列的“百分(％)序列同一性”定義為為了實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性將序列比對(duì)并且，如果需要，引入間隙之后，而且不考慮所有的保守型替代作為序列同一性一部分，在候選序列中與XYL-IV序列中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。
進(jìn)行序列比對(duì)并且測(cè)定序列同一性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以進(jìn)行而不需要過多的實(shí)驗(yàn)，并且可以明確獲得同一性值的計(jì)算。參見，例如，Ausubel等，編著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。關(guān)于比對(duì)序列和測(cè)定序列同一性有很多算法，包括，例如，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性比對(duì)算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(參見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。利用這些算法的計(jì)算機(jī)程序也是可獲得的，并且包括但不限于ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可獲得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本領(lǐng)域那些熟練技術(shù)人員能夠確定用于測(cè)定比對(duì)的合適的參數(shù)，包括需要在要比較的序列的長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。優(yōu)選地，使用程序確定的默認(rèn)參數(shù)測(cè)定序列同一性。具體地說，通過MSPRCH程序(Oxford Molecular)中實(shí)施的Smith-Waterman同源性搜索算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997))能夠測(cè)定序列同一性，采用下面的搜索參數(shù)使用親族間隙搜索(affine gap search)間隙開放損失12，間隙擴(kuò)展損失1。優(yōu)選地，利用Genetics Computer Group，Inc.，Madison，Wiscons in的GCG序列分析軟件包的GAP程序，應(yīng)用blosum62氨基酸替代矩陣，間隙權(quán)重12并且長(zhǎng)度權(quán)重2，可以進(jìn)行成對(duì)氨基酸比較。
關(guān)于兩個(gè)氨基酸序列的最佳比對(duì)，變體氨基酸序列的連續(xù)片段可以相對(duì)參照氨基酸序列具有另外的氨基酸殘基或者缺失的氨基酸殘基。用于與參照氨基酸序列相比較的連續(xù)區(qū)段包括至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，并且可以是30，40，50，或者更多的氨基酸殘基。通過指定間隙損失可以對(duì)與包括衍生物氨基酸序列中間隙相關(guān)的提高的序列同一性進(jìn)行校正。
如這里使用的，“表達(dá)載體”指包括與在合適的宿主中能實(shí)現(xiàn)DNA表達(dá)的合適的調(diào)控序列可操作地連接的DNA序列的DNA構(gòu)建體。這樣的調(diào)控序列可以包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，任選的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列，編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。針對(duì)不同的細(xì)胞類型優(yōu)選使用不同的表達(dá)載體。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中使用的載體的優(yōu)選的啟動(dòng)子是AprE啟動(dòng)子；大腸桿菌(E.coli)中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是Lac啟動(dòng)子，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是PGK1，黑曲霉(Aspergillus niger)中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是glaA，Trichoderma reesei中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是cbhI。所述載體可以是質(zhì)粒，噬菌體粒，或者簡(jiǎn)單地是潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，該載體可以獨(dú)立于宿主基因組而復(fù)制和發(fā)揮功能，或者可以，在合適的條件下，整合到基因組本身中。在本申請(qǐng)說明書中，質(zhì)粒和載體有時(shí)互換使用。但是，本發(fā)明意在包括本領(lǐng)域公知的或者變?yōu)楣钠鹬葍r(jià)功能的其它形式表達(dá)載體。因此，在本發(fā)明表達(dá)DNA序列時(shí)可以使用多種宿主/表達(dá)載體組合。有用的表達(dá)載體，例如，可以由染色體，非染色體和合成的DNA序列組成，例如各種已知的SV40的衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如，來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括col E1，pCRl，pBR322，pMb9，pUC19和它們的衍生物，寬宿主范圍質(zhì)粒，例如，RP4，噬菌體DNAs，例如，噬菌體入的多種衍生物，例如，NM989，和其它DNA噬菌體，例如，M13和絲狀單鏈DNA噬菌體，酵母質(zhì)粒，例如2μ質(zhì)?；蛘咂溲苌?，真核細(xì)胞中有用的載體，例如在動(dòng)物細(xì)胞中使用的載體和從質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體，例如經(jīng)修飾應(yīng)用噬菌體DNA或其它表達(dá)調(diào)控序列的質(zhì)粒。使用本發(fā)明的表達(dá)載體的表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且一般性描述于，例如，Sambrook，等，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，SECOND EDITION，冷泉港出版社(1989)。經(jīng)常地，通過整合事件直接插入到特定物種的基因組中而將包括本發(fā)明DNA序列的這樣的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到單細(xì)胞宿主中(參見，例如，Bennett & Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego，pp.70-76(1991)和這里引用的描述真菌宿主定向基因組插入的文章)。
如這里使用的，“宿主菌株”或者“宿主細(xì)胞”指用于包括本發(fā)明DNA的表達(dá)載體的合適的宿主。本發(fā)明中有用的宿主細(xì)胞一般是原核宿主或真核宿主，包括其中能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)的任何可轉(zhuǎn)化微生物。
具體地說，宿主菌株可以是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，大腸桿菌(Escherichia coli)，Trichoderma reesei，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者黑曲霉(Aspergillus niger)。用應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞能復(fù)制編碼XYL-IV及其衍生物或變體(突變體)的載體或者表達(dá)期望的肽產(chǎn)物。在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，“宿主細(xì)胞”指從木霉屬(Trichoderma sp.)細(xì)胞和其產(chǎn)生的原生質(zhì)體。
如這里使用的，“信號(hào)序列”指有利于在細(xì)胞外分泌成熟形式蛋白質(zhì)的、與蛋白質(zhì)的N-末端部分鍵合的氨基酸序列。信號(hào)序列的該定義是功能性定義。胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號(hào)序列，其在分泌過程之中被裂解。
如這里使用的，“功能性連接”或者“可操作地連接”指，調(diào)控區(qū)，例如啟動(dòng)子，終止子，分泌信號(hào)或增強(qiáng)子區(qū)附加或連接于結(jié)構(gòu)基因并且控制該基因的表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定雜交反應(yīng)的“嚴(yán)緊性”，并且一般是根據(jù)探針長(zhǎng)度，洗滌溫度，和鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算值。一般情況下，越長(zhǎng)的探針要求適當(dāng)退火的溫度越高，而越短的探針需要越低的溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于它們的熔解溫度的環(huán)境中時(shí)，雜交作用一般取決于變性的DNA重新退火的能力。探針和雜交序列之間的預(yù)期同源性程度越高，可以使用的相對(duì)溫度越高。作為結(jié)果，得出較高的相對(duì)溫度趨向于使反應(yīng)條件更嚴(yán)緊，而較低溫度嚴(yán)緊性較低。有關(guān)雜交反應(yīng)嚴(yán)緊性的進(jìn)一步詳細(xì)描述和解釋參見Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Wiley Interscience Publishers，1995)。
如這里使用的，“嚴(yán)緊條件”或者“高嚴(yán)緊條件”可以鑒定為(1)對(duì)于洗滌使用低離子強(qiáng)度和高溫度，例如，50℃下0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間使用變性劑，例如甲酰胺，例如，42℃下，含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)和750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉的50％(v/v)甲酰胺；或者(3)42℃下，使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt’s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡聚糖，在42℃下用0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和在55℃下用50％甲酰胺洗滌，接著55℃下用含有EDTA的0.1xSSC組成的洗液高嚴(yán)緊性洗滌。
如這里使用的，“中等嚴(yán)緊條件”可以根據(jù)Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(紐約冷泉港出版社，1989)定義，并且包括使用比上面描述的那些嚴(yán)緊性低的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度，離子強(qiáng)度，和％SDS)。中等嚴(yán)緊條件的一個(gè)例子是37℃下在下面的溶液中過夜溫育，所述溶液包括20％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20mg/mL變性剪切鮭精DNA，接著在大約37-50℃下用1xSSC洗滌濾膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白怎樣根據(jù)需要調(diào)節(jié)溫度，離子強(qiáng)度，等適應(yīng)象探針長(zhǎng)度等這樣的因素。
如這里使用的，從微生物“來源的”物質(zhì)(例如多核苷酸或蛋白質(zhì))指對(duì)微生物是天然產(chǎn)生的物質(zhì)。
XYL-IV特異性一般來說，XYL-IV表現(xiàn)出不同于11家族或10家族糖基水解酶的特異性。特別地，XYL-IV表現(xiàn)出的底物特異性不同于α-阿拉伯呋喃糖苷酶，α-半乳糖苷酶，β-木糖苷酶，β-甘露糖苷酶的底物特異性。更特別地，XYL-IV以不同于XYL-1或-II或-III的特異性裂解底物。即，XYL-IV可以在和這些其它的木聚糖酶相同位置中的一些處裂解木聚糖，但是它也在不同的位置處裂解。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在典型反應(yīng)條件下，與XYL-I或XYL-II相比，XYL-IV表現(xiàn)出更大的對(duì)沒有取代的木聚糖或者乙酰化MeGIcA-木聚糖的活性。XYLs-IV和-II兩者都能水解脫乙酰MeGIcA-木聚糖。XYL-II一般表現(xiàn)出比XYL-IV更大的對(duì)阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)的活性。在裂解沒有取代的木聚糖或乙?；疢eGIcA-木聚糖中，XYL-IV產(chǎn)生木糖作為其主要產(chǎn)物，有較少量的木二糖和取代的木寡糖。其它兩種木聚糖酶產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。與XYL-I或-II相比，XYL-IV一般在更接近于取代的木糖單元處裂解。
XYL-IV和XYLs-I和-II之間的特異性中的差異能夠在這些酶的組合物或混合物對(duì)產(chǎn)物的裂解中產(chǎn)生協(xié)同作用。例如，XYL-IV與XYL-I和/或XYL-II的混合物對(duì)底物的裂解能夠?qū)е屡c更少的這些酶的裂解相比底物裂解速度和/或程度的大于加和性相加的提高的結(jié)果。類似地，不同的XYL或者XYL-I，-II和/或-IV的組合裂解之前一種或多種XYLs-I，-II和/或-IV對(duì)底物的裂解能導(dǎo)致與更少的這些酶的裂解相比底物裂解速度和/或程度的大于加和性相加的提高。
在一個(gè)實(shí)施方案中，XYL-IV能夠裂解來自黑麥的幾種聚合木聚糖，沒有取代的木聚糖，MeGIcA-木聚糖，和阿拉伯木聚糖。一般情況下，與另兩種木聚糖(以大約相等的速度被裂解)相比，XYL-IV更緩慢地裂解阿拉伯木聚糖。XYL-IV能夠水解線性和取代的寡糖。XYL-IV，在典型反應(yīng)條件下，不裂解，或者僅很少地裂解葡甘露聚糖，半乳甘露聚糖，β-葡聚糖，羧甲基纖維素，昆布多糖，或木二糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在某些反應(yīng)條件下可以使用XYL-IV來催化糖的偶聯(lián)，形成更大的糖。例如，對(duì)于從較小單元合成木二糖或木寡糖可以使用XYL-IV?；蛘?，XYL-IV能夠催化從較小單元形成糖衍生物。
XYL-IV的制備本發(fā)明涉及XYL-IV和XYL-IV的衍生物的表達(dá)，分離和應(yīng)用。優(yōu)選通過重組方法制備XYL-IV或衍生物。但是，用于本發(fā)明的XYL-IV蛋白質(zhì)可以通過其它本領(lǐng)域公知的方法獲得，例如從自然界分離物中純化或者化學(xué)合成。
從自然界分離物中純化通過公知公用方法能夠從自然界分離物中純化XYL-IV。例如，通過各種物理或化學(xué)方法破碎含有XYL-IV的細(xì)胞，例如冷凍解凍循環(huán)，超聲，機(jī)械破碎，或者細(xì)胞溶解試劑。通過常規(guī)技術(shù)可以從介質(zhì)中回收XYL-IV，包括通過離心，過濾，和用鹽例如硫酸銨沉淀上清夜或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)而從介質(zhì)中分離細(xì)胞。然后通過下面的方法可以從破碎的細(xì)胞純化XYL-IV，例如在離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅基材料或離子交換樹脂例如DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝膠過濾；和親和色譜。可以使用各種蛋白質(zhì)純化方法，這樣的方法是本領(lǐng)域公知的并且描述于例如Deutscher，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)182(1990)；Scopes，PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，紐約(1982)。將根據(jù)產(chǎn)生的特定XYL-IV或者根據(jù)該酶的來源選擇純化步驟。
化學(xué)合成或者，可以通過應(yīng)用固相技術(shù)直接肽合成產(chǎn)生XYL-IV序列，或者其部分(參見例如，Stewart，等，SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963))。利用人工技術(shù)或者自動(dòng)化可以進(jìn)行體外蛋白質(zhì)合成。例如利用應(yīng)用生物系統(tǒng)肽合成儀(Foster City，CA)根據(jù)廠商說明可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)合成?？梢苑謩e化學(xué)合成XYL-IV的各部分并且利用化學(xué)或酶方法組合來制備全長(zhǎng)XYL-IV。
重組方法編碼XYL-IV的DNA的分離可以從由確信具有XYL-IV mRNA并且以可檢測(cè)水平表達(dá)的微生物制備的cDNA文庫獲得編碼XYL-IV的DNA。也可以從基因組文庫或者通過寡核苷酸合成獲得XYL-IV編碼基因。
用設(shè)計(jì)來鑒定感興趣的基因或者其編碼的蛋白質(zhì)的探針(例如XYL-IV的抗體或者至少大約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸)能夠篩選文庫?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行使用選擇的探針對(duì)cDNA或基因組文庫的篩選，例如描述于Sambrook，等，上文。另一種分離編碼XYL-IV的基因的方法是應(yīng)用PCR方法(Sambrook，等，上文；Dieffenbach，等，PCRPRIMERA LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1995))。
篩選cDNA文庫的已知技術(shù)中，選擇作為探針的寡核苷酸應(yīng)該具有足夠長(zhǎng)度和足夠的明確性，使假陽性最小化。優(yōu)選標(biāo)記寡核苷酸使得其在與要篩選的文庫中的DNA雜交時(shí)可以被檢測(cè)。標(biāo)記方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括使用放射性標(biāo)記物，象32P-標(biāo)記的ATP，生物素化作用或酶標(biāo)記。Sambrook，等，上文中提供了雜交條件，包括中等嚴(yán)緊性和高度嚴(yán)緊性。
可以將在這樣的文庫篩選方法中鑒定的序列與公共數(shù)據(jù)庫例如GenBank或者其它私人序列數(shù)據(jù)庫中保存和可獲得的其它已知序列進(jìn)行比較并且比對(duì)。通過使用計(jì)算機(jī)軟件程序例如應(yīng)用不同的算法測(cè)定同源性的ALIGN，DNAstar，和INHERIT進(jìn)行序列比對(duì)可以確定分子確定的區(qū)域內(nèi)或者全長(zhǎng)序列的序列同一性(在氨基酸或核苷酸水平)。
通過使用這里第一次公開的推導(dǎo)的氨基酸序列篩選選擇的cDNA或者基因組文庫可以獲得具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，并且，如果需要，使用Sambrook，等，上文中描述的常規(guī)引物延長(zhǎng)方法，來檢測(cè)前體和沒有逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的mRNA加工中間體。
宿主細(xì)胞的篩選和轉(zhuǎn)化用這里描述的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來產(chǎn)生XYL-IV。在適當(dāng)修飾以誘導(dǎo)啟動(dòng)子，篩選轉(zhuǎn)化體，或者擴(kuò)增編碼期望的序列的基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。不用過多實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基，溫度，pH等。一般情況下，在MAMMALIAN CELL BIOTECHNOLOGYA PRACTICAL APPROACH，M.Butler，編著(IRL Press，1991)和Sambrook，等，上文中可以找到將細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)率最大化的原理，方法，和實(shí)用技術(shù)。
轉(zhuǎn)染方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如，CaPO4和電穿孔。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞，利用適合這樣的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如Sambrook等人所述，利用氯化鈣進(jìn)行鈣處理，或者對(duì)于原核生物或者包含大量細(xì)胞壁屏障的其它細(xì)胞一般應(yīng)用電穿孔。如Shaw，等，Gene23315(1983)和1989年6月29日公開的WO89/05859所述，對(duì)于某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化使用用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)染。根據(jù)Van Solingen，等，J.Bacteriol.130946(1977)和Hsiao，等，Proc.Nat’l Acad.Sci.(uSA)763829(1979)的方法可以進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。但是，也可以使用將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法，例如通過核顯微注射，電穿孔，微穿孔，生物轟擊，細(xì)菌與完整細(xì)胞的原生質(zhì)體融合，或者聚陽離子，例如，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)，聚鳥氨酸。
這里用于在載體中克隆或表達(dá)DNA的合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞，酵母，或者絲狀真菌細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，腸桿菌(Enterobacteriaceae)例如大腸桿菌(E.coli.)。各種大腸桿菌(E.coli)菌株公眾是可以得到的，例如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC31，446)；大腸桿菌X1776(ATCC31，537)；大腸桿菌W3110(ATCC27，325)和K5772(ATCC53，635)株。除了原核生物外，原核微生物例如絲狀真菌或酵母對(duì)于編碼XYL-IV的載體是合適的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是普遍使用的低級(jí)真核宿主微生物。
優(yōu)選地，待轉(zhuǎn)化的微生物包括來自木霉屬(Trichoderma spp.)或者曲霉屬(Aspergillus spp.)的菌株，或者更優(yōu)選地，所述菌株包括T.reesei，其用于獲得超量表達(dá)蛋白質(zhì)，或者黑曲霉awamori變種(Aspergillus niger var.awamori)。例如，Sheir-Neiss，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.2046(1984)中描述的木霉屬菌株RL-P37，已知分泌提高量的纖維素酶。RL-P37的功能等價(jià)物包括Trichodermareesei(longibrachiatum)菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。另一個(gè)實(shí)例包括過量生產(chǎn)的突變體，如Ward，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.39738(1993)中所述。認(rèn)為這些菌株在超量表達(dá)木霉屬XYL-IV中也是有用的。認(rèn)為合適的宿主細(xì)胞的篩選在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力內(nèi)。
木霉屬(Trichoderma sp.)宿主細(xì)胞的篩選和轉(zhuǎn)化根據(jù)本發(fā)明制備XYL-IV的優(yōu)選方法包括用至少包括與啟動(dòng)子功能性連接的編碼XYL-IV的部分或全部的DNA片段的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化木霉屬(Trichoderma sp.)宿主細(xì)胞。然后在表達(dá)期望的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。接著，分離或者純化期望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物至基本上同質(zhì)化。
優(yōu)選地，要轉(zhuǎn)化的微生物包括來自木霉屬(Trichoderma spp.)的菌株。更優(yōu)選地，所述菌株包括用于獲得超量表達(dá)的蛋白質(zhì)的T.reesei，木霉屬菌株RL-P37，RL-P37的功能等價(jià)物，例如Trichoderma reesei(longibrachiatum)菌株RUT-C30(ATCC No.56765)，或者菌株QM9414(ATCC No.26921)。
一定要選擇選擇標(biāo)記以使能夠檢測(cè)轉(zhuǎn)化的真菌。在選擇的微生物中表達(dá)的任何選擇標(biāo)記基因都是合適的。例如，使用木霉屬(Trichoderma spp.)，選擇可選擇標(biāo)記使得轉(zhuǎn)化體中可選擇標(biāo)記的存在不明顯影響其性質(zhì)。這樣一種可選擇標(biāo)記可以是編碼可測(cè)試產(chǎn)物的基因。例如，可以使用木霉屬(Trichoderma spp.)基因的功能拷貝，宿主菌株中如果缺少該基因則導(dǎo)致宿主菌株顯示營(yíng)養(yǎng)缺陷表型。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用提供用于轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記的功能性pyr4基因轉(zhuǎn)化木霉屬(Trichoderma spp.)的pyr4-衍生菌株。通過篩選對(duì)氟乳清酸(FOA)有抗性的木霉屬(Trichoderma spp.)可以獲得pyr4-衍生菌株。pyr4基因編碼乳清酸核苷-5’-一磷酸脫羧酶，一種尿苷生物合成需要的酶。攜帶完整pyr4基因的菌株能在沒有尿苷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)但是對(duì)氟乳清酸敏感。通過篩選FOA抗性有可能篩選沒有功能性乳清酸核苷一磷酸脫羧酶但是生長(zhǎng)需要尿苷的pyr4-衍生菌株。利用FOA篩選技術(shù)也可能獲得沒有功能性乳清酸焦磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的需要尿苷的菌株。有可能用編碼該酶的基因的功能拷貝轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞(Berges和Barreau，Curr.Genet.19359(1991))。參照上文，利用FOA抗性技術(shù)容易進(jìn)行衍生菌株的篩選，這樣，優(yōu)選使用pyr4基因作為選擇標(biāo)記。
為了轉(zhuǎn)化pyr4-木霉屬以使其具有表達(dá)一個(gè)和多個(gè)xyl4基因的能力，然后從缺失質(zhì)粒分離包括xyl4基因的單一DNA片段，并且用來轉(zhuǎn)化合適的pyr-木霉屬宿主。然后以其表達(dá)pyr4基因產(chǎn)物因而彌補(bǔ)宿主菌株尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷的能力為基礎(chǔ)鑒定并且篩選轉(zhuǎn)化體。然后對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行Southern印跡分析，鑒定并且證實(shí)雙交叉整合事件，其中pyr4選擇標(biāo)記替代部分或全部的要缺失的基因的基因組拷貝的部分或全部。
盡管上述具體的質(zhì)粒載體涉及pyr-轉(zhuǎn)化體的制備，但是本發(fā)明不局限于這些載體。應(yīng)用上述技術(shù)在木霉屬(Trichoderma sp。)菌株中可以缺失和替代各種基因。另外，如上所述，可以使用任何可獲得的可選擇標(biāo)記。事實(shí)上，應(yīng)用上述策略可以從基因組中缺失或替代已經(jīng)克隆和鑒定的任何木霉屬(Trichoderma sp.)基因。
如上所述，優(yōu)選的宿主菌株包括沒有或者具有相應(yīng)于所選可選擇標(biāo)記的非功能性的基因的木霉屬(Trichoderma sp.)的衍生物。例如，如果選擇pyr4的選擇標(biāo)記，則在轉(zhuǎn)化過程中使用特定pyr4-衍生菌株作為受體。類似地，可以使用包括等價(jià)于構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)基因amdS，argB，trpC，niaD的木霉屬(Trichoderma sp.)基因的選擇標(biāo)記。因此，相應(yīng)的受體菌株必須是衍生菌株，例如分別是argB-，trpC-，niaD-。
在優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)中，一定要考慮到木霉屬(Trichoderma sp.)中細(xì)胞壁對(duì)DNA的滲透性非常低。因此，攝入期望的DNA序列，基因或基因片段是很少的。在轉(zhuǎn)化過程之前有很多方法來提高衍生菌株(即缺少相應(yīng)于使用的可選擇標(biāo)記的功能基因)中木霉屬(Trichodermasp.)細(xì)胞壁的透性。
制備用于轉(zhuǎn)化的木霉屬(Trichoderma sp.)的本發(fā)明優(yōu)選方法涉及從真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。可以從萌芽營(yíng)養(yǎng)孢子獲得菌絲體。用消化細(xì)胞壁產(chǎn)生原生質(zhì)體的酶處理菌絲體。然后通過懸浮培養(yǎng)基中滲透穩(wěn)定劑的存在來保護(hù)原生質(zhì)體。這些穩(wěn)定劑包括山梨糖醇，甘露糖醇，氯化鉀，硫酸鎂等等。通常這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M至1.2M之間。優(yōu)選使用含大約1.2M的山梨糖醇的懸浮培養(yǎng)基溶液。
DNA攝取到宿主木霉屬(Trichoderma sp.)菌株中取決于鈣離子濃度。一般在攝取溶液中使用大約10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了攝取溶液中需要鈣離子之外，一般包括的其它物質(zhì)是緩沖體系例如TE緩沖液(10Mm Tris，pH7.4；1mM EDTA)或者10mM MOPS，pH6.0緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。相信聚乙二醇起作用融合細(xì)胞膜從而允許培養(yǎng)基內(nèi)含物輸送到木霉屬(Trichoderma sp.)菌株的細(xì)胞質(zhì)中并且將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移給核。這種融合常常得到串聯(lián)整合到宿主染色體中的質(zhì)粒DNA的多個(gè)拷貝。
通常在轉(zhuǎn)化中使用含有108-109/ml，優(yōu)選2×108/ml密度的進(jìn)行過滲透性處理的木霉屬(Trichoderma sp.)原生質(zhì)體或細(xì)胞的懸浮液。將100微升體積的這些原生質(zhì)體或細(xì)胞的合適的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)與期望的DNA混合。一般向攝取溶液加入高濃度的PEG。向原生質(zhì)懸浮液中可以加入0.1-1體積的25％PEG4000。但是，優(yōu)選向原生質(zhì)懸浮液中加入大約0.25體積。也可以向攝取溶液加入添加劑例如二甲亞砜，肝素，亞精胺，氯化鉀等有助于轉(zhuǎn)化。
一般情況下，然后將該混合物在大約0℃下溫育10-30分鐘的時(shí)間。然后向該混合物中加入另外的PEG進(jìn)一步加強(qiáng)期望的基因或DNA序列的攝入。一般以轉(zhuǎn)化混合物體積的5-15倍的體積加入25％PEG4000；但是，更大和更小體積可以是合適的。25％PEG4000優(yōu)選是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約10倍。加入PEG之后，在加入山梨糖醇和CaCl2溶液之前在室溫下溫育轉(zhuǎn)化混合物。然后向熔化的等分生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入原生質(zhì)體懸浮液。該生長(zhǎng)培養(yǎng)基只允許轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)。本發(fā)明中可以使用適合期望的轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)的任何生長(zhǎng)培養(yǎng)基。但是，如果篩選Pyr+轉(zhuǎn)化體，則優(yōu)選使用不含有尿苷的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移隨后的菌落并且在排除尿苷的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上純化。
在該階段，通過在沒有尿苷的固體培養(yǎng)基上更快的生長(zhǎng)速度和平滑圓形菌落的形成而不是參差不齊形狀可以將穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體區(qū)分出來。另外，在某些情況下通過在固體非選擇性培養(yǎng)基(即含有尿苷)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從其培養(yǎng)基中收獲孢子并且測(cè)定這些后面將在沒有尿苷的選擇性培養(yǎng)基上發(fā)育生長(zhǎng)的孢子的百分比，可以進(jìn)行穩(wěn)定性的進(jìn)一步試驗(yàn)。
可復(fù)制載體的制備和使用制備編碼XYL-IV蛋白質(zhì)的DNA用于插入合適的微生物中。根據(jù)本發(fā)明，編碼XYL-IV酶的DNA包括編碼具有功能性XYL-IV活性的蛋白質(zhì)所需的全部DNA。因此，可以從產(chǎn)生XYL-IV的任何微生物來源產(chǎn)生DNA，前提是所述基因可以根據(jù)這里描述的方法鑒定和分離。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA編碼來自木霉屬(Trichoderma sp.)并且更優(yōu)選來自Trichoderma reesei的XYL-IV蛋白質(zhì)。
通過構(gòu)建攜帶編碼XYL-IV的基因的表達(dá)載體可以制備編碼XYL-IV的基因。攜帶插入的編碼XYL-IV的DNA片段的表達(dá)載體可以是能夠在給定宿主生物體內(nèi)自主復(fù)制的或者能夠整合到宿主的DNA中的任何載體，一般是質(zhì)粒，粘粒，病毒顆粒，或者噬菌體。各種載體是公眾可以獲得的。也涉及編碼XYL-IV的DNA的一個(gè)以上的拷貝可以被重組到菌株中以有利于超量表達(dá)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及兩種類型的獲得基因表達(dá)的表達(dá)載體。第一種類型包含其中啟動(dòng)子，基因編碼區(qū)和中止子序列都源自要表達(dá)的基因的DNA序列。通過缺失不期望的DNA序列(例如編碼不期望的結(jié)構(gòu)域)留下在其自身轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)域可以獲得基因截短。載體上也包含可選擇標(biāo)記來篩選整合到宿主中新的xyl4基因序列多個(gè)拷貝的整合。
第二類型的表達(dá)載體是預(yù)裝配的并且包含高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和可選擇標(biāo)記。涉及到基因或者其部分的編碼區(qū)可以被插入到該一般目的的表達(dá)載體中使其處于表達(dá)盒啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。例如，pTEX是這樣一種普通目的表達(dá)載體。參見美國(guó)專利5,650,322，其描述了該載體。pTEX是絲狀真菌T.reesei中使用的多用途表達(dá)載體。載體內(nèi)的表達(dá)盒具有使其對(duì)該功能有用的幾種獨(dú)特特征。對(duì)于T.reesei使用強(qiáng)cbh1基因啟動(dòng)子和終止子序列。
在載體中，本發(fā)明的編碼XYL-IV的DNA序列應(yīng)該可操作連接轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，即，合適的啟動(dòng)子序列和信號(hào)序列在讀框內(nèi)可操作地連接結(jié)構(gòu)基因。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列并且可以來自與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)編碼基因。對(duì)于胞外產(chǎn)生XYL-IV或者其衍生物可提供信號(hào)肽。編碼信號(hào)肽的DNA優(yōu)選其與要表達(dá)的基因自然相結(jié)合，但是本發(fā)明涉及來自任何合適的來源例如來自木霉屬的外切纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶的信號(hào)序列。
可以通過多種方法將合適的核酸序列插入到載體中。一般情況下，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將DNA插入到合適的限制性酶切位點(diǎn)中。載體成分一般包括但不限于一個(gè)或多個(gè)信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。包含這些成分的一個(gè)或多個(gè)的合適的載體的構(gòu)建可利用技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。
可以直接地，也可以作為與異源多肽的融合多肽，重組產(chǎn)生期望的XYL-IV，所述異源多肽可以是信號(hào)序列或者在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端有特異性酶切位點(diǎn)的其它多肽。一般情況下，信號(hào)序列可以是載體的成分或者其可以是插入到載體中的XYL-IV編碼DNA的一部分。信號(hào)序列可以是例如選自堿性磷酸酶，青霉素酶，1pp，或者熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)的原核細(xì)胞信號(hào)序列。對(duì)于酵母分泌，信號(hào)序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)區(qū)，α-因子前導(dǎo)區(qū)(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)區(qū)，后者描述于美國(guó)專利No.5,010,182)，或者酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)，C.albicans葡糖淀粉酶前導(dǎo)區(qū)(1990年4月4日公開的EP362,179)，或者1990年11月15日公開的WO90/13646中描述的信號(hào)序列。
表達(dá)和克隆載體都包含使載體能在一個(gè)或多個(gè)選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。這樣的序列對(duì)于各種各樣的細(xì)菌，酵母和病毒是公知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母。
表達(dá)和克隆載體一般包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。一般選擇基因編碼蛋白質(zhì)使得(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素，例如，氨芐青霉素，新霉素，氨甲喋呤，或四環(huán)素的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷不足，或者(c)補(bǔ)充從復(fù)合培養(yǎng)基得不到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)，例如，編碼桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。酵母中使用的合適的選擇基因是酵母質(zhì)粒YRp7中存在的trpl基因(Stinchcomb，等，Nature28239(1979)；Kingsman，等，Gene7141(1979)；Tschemper，等，Gene10157(1980))。trpl基因?yàn)闆]有在色氨酸中生長(zhǎng)能力的酵母突變株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics8512(1977))提供選擇標(biāo)記。對(duì)于木霉屬優(yōu)選使用的選擇基因是pyr4基因。
表達(dá)和克隆載體通常包含可操作地連接XYL-IV編碼核酸序列的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子指導(dǎo)mRNA合成。各種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子是公知的。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括真菌啟動(dòng)子序列，例如，cbhl或egll基因的啟動(dòng)子。
適合于原核宿主使用的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子體系(Chang，等，Nature275615(1978)；Goeddel，等，Nature，281544(1979))，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子體系(Goeddel，Nucl.Acids Res.84057(1980)；和歐洲專利申請(qǐng)36,776)，和雜合啟動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子(deBoer，等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA8021(1983))。細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子也包含可操作地連接編碼XYL-IV的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
對(duì)酵母宿主使用的合適的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman，等，J.Biol.Chem.2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess，等，J.Adv.Enzyme Reg.7149(1968)；Holland，Biochem.174900(1978))，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油酸變位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。屬于具有另外的生長(zhǎng)條件調(diào)控轉(zhuǎn)錄優(yōu)點(diǎn)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的其它酵母啟動(dòng)子，是醇脫氫酶2，異細(xì)胞色素C(isocytochrome C)，酸性磷酸酶，與氮代謝有關(guān)的降解酶，金屬硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。EP 73,657中也描述了酵母表達(dá)中使用的合適的載體和啟動(dòng)子。
真核宿主細(xì)胞(例如酵母，真菌，昆蟲，植物)中使用的表達(dá)載體也包含轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所需的序列。一般從真核細(xì)胞或病毒DNAs或cDNAs的5’和，有時(shí)3’，非翻譯區(qū)獲得這樣的序列。這些區(qū)包含在編碼XYL-IV的mRNA的非翻譯部分作為多腺苷酸化片段轉(zhuǎn)錄的核苷酸片段。
檢測(cè)基因擴(kuò)增/表達(dá)以這里提供的序列為基礎(chǔ)，利用合適的標(biāo)記探針，通過例如常規(guī)Southern印跡，定量測(cè)定mRNA轉(zhuǎn)錄的Northern印跡(Thomas，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA775201(1980))，點(diǎn)印跡(DNA分析)，或者原位雜交，可以直接測(cè)定樣品基因擴(kuò)增和/或表達(dá)?；蛘撸梢詰?yīng)用能夠識(shí)別特異性雙鏈體(duplex)，包括DNA雙鏈體，RNA雙鏈體，和DNA-RNA雜合雙鏈體，或者DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體的抗體。反過來可以標(biāo)記所述抗體，并且在雙鏈體結(jié)合表面的情況下可以進(jìn)行測(cè)試，這樣一旦在表面上形成雙鏈體，就能夠檢測(cè)與該雙鏈體結(jié)合的抗體的存在。
或者，可以通過免疫學(xué)方法，例如細(xì)胞的組織化學(xué)染色和細(xì)胞培養(yǎng)液的分析，直接定量測(cè)定基因產(chǎn)物的表達(dá)，來測(cè)定基因表達(dá)。用于組織化學(xué)染色和/或樣品液體的測(cè)試的抗體可以是單克隆或多克隆的，并且可以用任何哺乳動(dòng)物制備。方便地，可以制備抗天然XYL-IV序列，抗以這里提供的DNA序列為基礎(chǔ)的合成肽，或者抗與XYL-IV編碼DNA融合并編碼特異性抗體表位的外源序列的抗體。
多肽純化通過上述從自然分離物分離和純化的方法可以從培養(yǎng)物或者從細(xì)胞裂解產(chǎn)物回收XYL-IV各種形式。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞和重組酶中任何變體結(jié)構(gòu)，可以使用另外的技術(shù)。例如，如果重組酶是膜結(jié)合的，則使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或者通過酶裂解，其可以從膜上釋放。重組酶的純化也可以使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠柱來去除污染物例如IgG，和金屬螯合柱來結(jié)合表位標(biāo)記形式的XYL-IV。選擇的純化步驟將取決于例如使用的制備方法的性質(zhì)，產(chǎn)生的特定XYL-IV，和重組酶的任何變體結(jié)構(gòu)。
XYL-IV的衍生物除了這里描述的天然序列XYL-IV外，涉及制備具有改變的氨基酸序列的XYL-IV衍生物。通過向XYL-IV編碼DNA引入合適的核苷酸變化，或者通過合成期望的XYL-IV，能夠制備XYL-IV衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白氨基酸的改變可以改變XYL-IV的翻譯后過程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
例如，使用例如美國(guó)專利No.5,364,934中提出的保守型和非保守型突變的技術(shù)和指南，能夠制備這里描述的天然序列XYL-IV或者XYL-IV的各種結(jié)構(gòu)域的衍生物。序列變異可以是導(dǎo)致與天然序列XYL-IV相比XYL-IV的氨基酸序列變化的編碼XYL-IV的一個(gè)或多個(gè)密碼子的替代，缺失或插入。任意地，序列變異通過在XYL-IV的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中用任何其它氨基酸替代至少一個(gè)氨基酸。
通過將多肽序列與已知同源蛋白質(zhì)分子相比較并且將高同源性區(qū)中變化的氨基酸序列數(shù)最小化可以找到確定哪一個(gè)氨基酸殘基可以被插入，替代或缺失而且不會(huì)不利地影響期望的XYL-IV活性的指導(dǎo)。氨基酸替代可以是用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸置換一個(gè)氨基酸，例如用絲氨酸置換亮氨酸，即，保守氨基酸置換。任選地插入或缺失可以是1-5個(gè)氨基酸范圍。通過在序列中系統(tǒng)地進(jìn)行氨基酸的插入，缺失或替代，并且使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)測(cè)定得到的衍生物的功能活性，可以確定允許的變化。
利用本領(lǐng)域公知的方法可以進(jìn)行序列變異，可以對(duì)克隆的DNA進(jìn)行例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變，丙氨酸掃描，和PCR誘變?？墒褂枚c(diǎn)誘變(Carter，等，Nucl.Acids Res.134331(1986)；Zoller，等，Nucl.Acids Res.106487(1987))，盒式誘變(Wells，等，Gene34315(1985))，限制選擇誘變(Wells，等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))或者其它已知的技術(shù)來產(chǎn)生具有改變的序列的XYL-IV編碼DNA。
可以利用掃描氨基酸分析來鑒定連續(xù)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對(duì)小的中性氨基酸。這樣的氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸，和半胱氨酸。該組中丙氨酸典型地是優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)樗チ甩?碳那一邊的側(cè)鏈，并且不太可能改變衍生物的主鏈構(gòu)象。典型地優(yōu)選丙氨酸，也因?yàn)樗亲畛Ｒ姷陌被?。此外，常常在隱藏和暴露位置都發(fā)現(xiàn)丙氨酸(Creighton，THEPROTEINS，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976))。如果丙氨酸替代不得到適當(dāng)量的衍生物，則可以使用同型空間配位的氨基酸。
抗-XYL-IV抗體本發(fā)明進(jìn)一步提供抗XYL-IV抗體。示例的抗體包括多克隆和單克隆抗體。
本發(fā)明的抗XYL-IV抗體可以包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員公知的。例如通過一次或多次注射免疫劑和，如果需要，佐劑，能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生多克隆抗體。典型地，通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射對(duì)哺乳動(dòng)物注射免疫劑和/或佐劑。對(duì)于抗XYL-IV抗體，免疫劑可以包括XYL-IV或者其融合蛋白。將免疫劑與已知在接受免疫的哺乳動(dòng)物中是免疫原性的蛋白質(zhì)偶合可能是有用的。這樣的免疫原性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制劑。可以使用的佐劑的例子可以包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑 (單磷酰脂質(zhì)A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。本領(lǐng)域技術(shù)人員不用進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)就可以選擇免疫方法。
或者，抗XYL-IV抗體可以是單克隆抗體。利用雜交瘤方法，例如Kohler和Milstein，Nature256495(1975)中描述的那些，可以制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，典型地，用免疫劑免疫小鼠，倉鼠，或者其它合適的宿主動(dòng)物，激發(fā)產(chǎn)生或者能產(chǎn)生特異性結(jié)合免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，可以體外免疫淋巴細(xì)胞。
對(duì)于抗XYL-IV抗體，免疫劑一般包括XYL-IV或者其融合蛋白。一般情況下，如果期望人源細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞("PBLs")，或者如果期望非人哺乳動(dòng)物源，則使用脾細(xì)胞或者淋巴結(jié)細(xì)胞。然后使用合適的融合劑例如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與無限增殖化細(xì)胞系融合，生成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES ANDPRACTICE，Academic Press，(1986)pp.59-103)。無限增殖化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類，牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞。通常情況下，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？梢栽趦?yōu)選含有一種或多種抑制沒有融合的無限增殖化細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。例如，如果親本細(xì)胞沒有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤培養(yǎng)基一般包括次黃嘌呤，氨基喋呤，和胸苷("HAT培養(yǎng)基")，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。
優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是有效融合，支持選擇的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞穩(wěn)定高水平表達(dá)抗體，并且對(duì)培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的那些。更優(yōu)選的無限增殖化細(xì)胞系是鼠骨髓瘤細(xì)胞系，其可以例如從SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California和美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)獲得。關(guān)于產(chǎn)生人單克隆抗體也描述過人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur，等，MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUESAND APPLICATIONS，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)pp.51-63)。
然后可以對(duì)其中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基測(cè)定抗XYL-IV的單克隆抗體的存在。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或者通過體外結(jié)合測(cè)試?yán)绶派涿庖邷y(cè)試(RIA)或者酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)測(cè)定雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這樣的技術(shù)和測(cè)試是本領(lǐng)域公知的。例如通過Munson和Pollard，Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析可以測(cè)定單克隆抗體的結(jié)合親和性。
鑒定預(yù)期的雜交瘤細(xì)胞之后，通過有限稀釋程序可以將克隆亞克隆并且通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Goding，上文)培養(yǎng)。用于該目的的合適的培養(yǎng)基包括例如Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium和RPMI-1640培養(yǎng)基。
通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法可以從培養(yǎng)基中分離和純化亞克隆分泌的單克隆抗體，例如，蛋白質(zhì)A-Sepharose，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析，或者親和色譜。
通過重組DNA方法例如美國(guó)專利4,816,567描述的那些方法也可以制備單克隆抗體。利用常規(guī)方法可以容易地分離編碼本發(fā)明地單克隆抗體的DNA并且測(cè)序(例如，通過使用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞用作這樣的DNA的優(yōu)選的來源。一旦分離出，可以將該DNA置于表達(dá)載體中，其然后被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞例如猴COS細(xì)胞，中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或者不另外產(chǎn)生免疫球蛋白蛋白質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞之中，實(shí)現(xiàn)在重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成。也可以例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列替代同源鼠序列(美國(guó)專利No.4,816,567；Morrison，等，上文)，或者通過共價(jià)結(jié)合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列，也可以修飾DNA。這樣的非免疫球蛋白多肽可以取代本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)，或者可以取代本發(fā)明的抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。
抗體可以是一價(jià)抗體。制備一價(jià)抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾的重鏈的重組表達(dá)。重鏈通常在Fc區(qū)內(nèi)的任何一點(diǎn)被截短以防止重鏈交聯(lián)?；蛘?，相關(guān)的半胱氨酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基取代或者缺失以防止交聯(lián)。
體外方法也適合制備一價(jià)抗體。利用本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的消化，產(chǎn)生其片段特別是Fab片段。
應(yīng)用XYL-IV的方法另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的木聚糖酶用于增強(qiáng)根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)的紙漿去木質(zhì)作用和/或漂白。該方法包括使紙漿接觸XYL-IV并且取決于例如pH，溫度，處理時(shí)間，酶的劑量和紙漿的量和類型這樣的因素。
優(yōu)選的是在提高XYL-IV的酶活性的溫度和pH下進(jìn)行上述方法。對(duì)應(yīng)用本發(fā)明的XYL-IV的優(yōu)選的處理時(shí)間是大約10分鐘至大約4小時(shí)，取決于例如預(yù)期的結(jié)果，處理的紙漿的量和質(zhì)量和酶的濃度等這樣的因素。
合適的酶的劑量是大約0.10-200單位/克干紙漿，更優(yōu)選0.50-50單位/克。如下測(cè)定酶制劑的木聚糖酶活性向1.8ml木聚糖溶液(0.6％Sigma No.X-0627，在0.05M乙酸鈉緩沖液中制備并且用乙酸調(diào)節(jié)到pH5.3)，加入相同緩沖液中的0.200ml適當(dāng)稀釋的酶。該溶液在40℃下溫育正好30分鐘。然后通過加入3ml DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸鹽10f/l；Na，K酒石酸鹽300g/l)終止反應(yīng)，并且通過將樣品煮沸5分鐘顯出顏色。然后在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。一個(gè)酶單位在測(cè)試條件下每分鐘釋放一微摩爾還原糖，還原糖計(jì)算為木糖。從測(cè)試條件下釋放4微摩爾還原糖的酶稀釋物計(jì)算活性?？梢砸再|(zhì)量單位表示XYL-IV的活性，例如，測(cè)試或者反應(yīng)混合物中XYL-IV的優(yōu)選的量可以是大約1ppm至大約100,000ppm。
本發(fā)明方法可以用來對(duì)各種處理過的紙漿提高等級(jí)或者有助于提高等級(jí)，所謂處理過的紙漿即預(yù)先已經(jīng)各種方法中的任何方法處理過以減小它們的木質(zhì)素含量并且在該過程中通過化學(xué)方法處理進(jìn)一步提高木質(zhì)素去除的程度的木漿。本發(fā)明方法可以用來處理硬木和軟木牛皮紙漿來增強(qiáng)木質(zhì)素去除和使木漿增白。
該方法特別適用于化學(xué)紙漿，即其中已經(jīng)通過各種化學(xué)處理例如硫酸鈉(牛皮紙)方法和氧去木質(zhì)作用化學(xué)修飾過木質(zhì)素成分的那些紙漿，并且優(yōu)選用于牛皮紙漿。優(yōu)選的方法中，在牛皮紙漿消化或氧去木質(zhì)作用之后但是漂白之前對(duì)紙漿施用XYL-IV。在對(duì)相同紙漿進(jìn)行牛皮紙漿消化和氧去木質(zhì)作用的情況下，在牛皮紙漿消化之后，氧去木質(zhì)作用之前或氧去木質(zhì)作用之后使用酶。本發(fā)明還用于臭氧漂白的紙漿。
使用合適的提取劑處理得到的紙漿去除可釋放的木質(zhì)素成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接著可以用木質(zhì)素降解化學(xué)品例如氯氣，二氧化氯和過氧化氯處理用XYL-IV處理過的紙漿，并且進(jìn)一步用合適的提取劑提取。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用合適的提取劑處理酶處理過的紙漿，接著是木質(zhì)素降解，并且最后用合適的提取劑處理。這樣的提取劑基本上溶解受影響的木質(zhì)素成分，并且合適的提取劑包括但不限于堿，例如堿金屬氫氧化物(E)，DMF，二惡烷，丙酮，和醇。氫氧化物提取劑可以與過氧化氫(Ep)或者氧(Ep)混合。然后通過化學(xué)漂白順序(chemical bleaching sequence)例如二氧化氯(DED)或過氧化氯(P-P)可以將得到的紙漿進(jìn)一步漂白至期望的白度(brightness)，與通過相同順序但是不利用酶處理的漂白到相同的白度的紙漿相比時(shí)發(fā)現(xiàn)大量節(jié)省化學(xué)品。用這樣一種方法實(shí)現(xiàn)含有氯的化學(xué)品或過氧化物的減少。另外，通過用上述酶實(shí)施本發(fā)明，人們可以對(duì)紙漿應(yīng)用相同量的漂白化學(xué)品，而實(shí)現(xiàn)處理過的紙漿的更大的白度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述XYL-IV在各種工業(yè)環(huán)境中的另外的應(yīng)用。例如，XYL-IV可以用來酶解農(nóng)業(yè)垃圾來產(chǎn)生醇類燃料和其它的重要的工業(yè)化學(xué)品，用來產(chǎn)生動(dòng)物飼料或人用食品，或者作為洗滌劑組合物中的成分。
只是為了詳細(xì)說明的目的提供下面的實(shí)施例，而不是為了在任何方面限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明說明書中引用的所有的專利和參考文獻(xiàn)在這里完整地引作參考。
實(shí)施例實(shí)施例1-編碼新的木聚糖酶的Trichoderma reesei cDNA克隆
圖1顯示從通過本領(lǐng)域公知的方法自在混合碳源上生長(zhǎng)之后的Trichoderma reesei的RNA制備的cDNA文庫獲得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ.ID NO1)和推出的相應(yīng)的氨基酸序列(SEQ.ID NO2)。鑒定了可讀框的1518個(gè)核苷酸并且推導(dǎo)出編碼的蛋白質(zhì)。預(yù)計(jì)成熟蛋白質(zhì)全長(zhǎng)465個(gè)氨基酸。
上面鑒定的XYL-IV沒有木霉屬產(chǎn)生的一些纖維素酶和其它真菌纖維素酶中的纖維素結(jié)合域(CBD)。CBDs也與一些非分解纖維素的胞外真菌酶有關(guān)，例如來自Trichoderma reesei(longibrachiatum)的乙酰基木聚糖酯酶和甘露聚糖酶。上面鑒定的XYL-IV也沒有與木霉屬和其它真菌纖維素酶中存在的連接CBD和催化域的接頭或絞合區(qū)具有同一性的序列。
在圖2的木霉屬木聚糖酶預(yù)測(cè)氨基酸序列(SEQ ID NO2)和微生物糖苷酶的已知序列及未知功能的一些序列之間發(fā)現(xiàn)具有序列同一性和序列相似性的區(qū)。在利用BLAST程序(Altschul，等，J.Mol.Biol.215403(1990))或者本領(lǐng)域公知的其它類似程序進(jìn)行的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索中檢測(cè)同一性和相似性。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定序列相似性。
特別地，利用Genetics Computer Group，Inc.，Madison，Wisconsin的GCG序列分析軟件包的GAP程序進(jìn)行配對(duì)氨基酸比較。通過標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定序列相似性。表1中給出了T.reesei XYL-IV的氨基酸序列分析，使用GAP程序，blosum62氨基酸替代矩陣，間隙權(quán)重為12并且長(zhǎng)度權(quán)重為2。
表1中給出了T.reesei XYL-IV的此氨基酸序列分析。
表1-XYL-IV的序列同一性和相似性比較
實(shí)施例2--XYL-IV的特征通過表征蛋白質(zhì)和酶的幾種常用方法表征XYL-IV，或XYL IV。
分離來自Trichoderma reesei的XYL-IV。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，該XYL-IV表現(xiàn)出大約43.0kDa的分子量。該XYL-IV具有幾種異構(gòu)體，根據(jù)PHAST系統(tǒng)(Pharmacia)測(cè)定都具有大約7的pI。Schiffs試劑的輕微染色表明只有低水平的糖基化作用。當(dāng)Trichoderma reesei在作為唯一碳源的纖維素上生長(zhǎng)時(shí)XYL-IV基因表達(dá)，而在作為唯一碳源的葡萄糖上生長(zhǎng)時(shí)則不表達(dá)XYL-IV基因。
胰蛋白酶裂解蛋白質(zhì)并且通過C18反相HPLC分離肽之后通過埃德曼降解測(cè)定成熟XYL-IV的N-末端氨基酸序列。測(cè)定的N-末端序列是Xaa-Ser-Tyr-Ala-Thr-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Xaa-Ala-Asn-Ile-Xaa-Ile-其中Xaa表示由于信號(hào)不足而沒有鑒定的氨基酸。
XYL IV與分類屬于糖基水解酶家族5的木聚糖酶同源。
使用木聚糖底物(其可能不是XYL-IV的最佳底物)，發(fā)現(xiàn)XYL-IV活性的pH最適值在pH3.5和4之間。這不同于XYL-II的最適pH，pH5-5.5，和XYL1的最適pH，pH3.5-4.5。pH4時(shí)，XYL-IV在40℃和50℃溫度之間表現(xiàn)出最高活性水平。該酶在室溫下在溶液中活性保持幾小時(shí)，但是在升高的溫度下緩慢喪失活性。
對(duì)于大分子底物和對(duì)硝基苯基-糖苷測(cè)定XYL-IV的底物特異性。在pH4檸檬酸鈉緩沖液中在40℃下24小時(shí)之后XYL-IV不明顯裂解下面的大分子物質(zhì)葡甘露聚糖(魔芋(konjac)，Megazyme)，半乳甘露聚糖(角豆，Sigma)，β-葡聚糖(大麥，Megazyme)，羧甲基纖維素(Fluka)，昆布糖(Sigma)或者木二糖。使用已知的對(duì)硝基苯基-糖苷底物，XYL-IV沒有表現(xiàn)出α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-木糖苷酶或者β-甘露糖苷酶所預(yù)期的活性。
對(duì)XYL-IV進(jìn)一步評(píng)價(jià)在XYL-1和XYL-11存在和不存在下幾種底物的水解作用。表2描述這些研究中使用的底物。完全酶解為單糖之后通過HPLC分析各底物的單糖成分。
表2.用于水解實(shí)驗(yàn)的底物
*幾乎每一個(gè)第二木糖單元帶有乙酰基取代基。**少量未知的寡糖在完全酶解之后仍然存在。nd＝?jīng)]有測(cè)定。
在實(shí)驗(yàn)中xYL-IV與XYL-I和XYL-II相比較，其中使用少量各種酶并且只有一小部分(一般＜10％)的各種底物被水解。用本領(lǐng)域公知的DNS方法測(cè)定使用酶生成的還原糖。使用商售寡糖作為標(biāo)準(zhǔn)物通過HPLC測(cè)定線性木寡糖(1聚物至5聚物，Xyl1至Xyl5)。在下面的條件下研究水解24hr，40℃，pH4.0(XYL I和XYL IV)和pH5.0(XYLII)。表3給出這些研究的結(jié)果。
表3.Trichoderma reesei的XYLs-I，-II，和-IV對(duì)木聚糖(5g/l)的水解
*在HPLC中寡糖被去乙?；?，因此數(shù)值代表水解之后乙?；蜎]有乙?；哪竟烟?。+是Xyl+Xyl2+Xyl3+Xyl4+Xyl5的總和。
在這些實(shí)驗(yàn)中，與XYLs-I和-II相比，XYL-IV表現(xiàn)出更大的對(duì)沒有取代的木聚糖和乙?；疢eGIcA-木聚糖的活性。XYL-IV和-II都水解去乙?；疢eGIcA-木聚糖。XYL-II表現(xiàn)出比XYL-IV更大的對(duì)阿拉伯木聚糖的活性。XYL-IV產(chǎn)生木糖作為其主要產(chǎn)物，有較少量的木二糖和取代的木寡糖。另外兩種木聚糖酶產(chǎn)生非常不同的產(chǎn)物混合物(表3)。XYL-IV的產(chǎn)物和活性不同于糖基水解酶家族11和家族10的那些。
通過使用幾種分離的寡糖底物進(jìn)一步表征XYL-IV的底物特異性(表4)。在pH4.0，40℃，1小時(shí)的條件下研究水解。
表4.T.reesei的XYL-IV(500nkat/g)對(duì)取代的寡糖(0.5-0.7g/l)的水解
*Tenkanen等1996公開的結(jié)構(gòu)。**很可能是Ara2Xyl3+Ara2Xyl4在這些實(shí)驗(yàn)中，XYL-IV裂解了兩個(gè)未取代的木糖單元之間的連結(jié)，但是不裂解取代的和未取代的木糖單元之間的連結(jié)。但是與XYL-I或者-II相比，XYL-IV裂解確實(shí)靠取代單元更近。XYL-IV在寡糖的還原端只留下一個(gè)沒有取代的單元。
通過在40℃下將Hex2Xyl2+Hex3Xyl3的混合物溫育1小時(shí)來評(píng)價(jià)Hex3Xyl3充分水解需要的XYL-IV的量。對(duì)于每克HexA3Xyl3使用30mg(500nkat)的XYL-IV實(shí)現(xiàn)HexA3Xyl3幾乎完全的水解(表5，圖4)。
表5.XYL-IV對(duì)HexA3Xyl3的水解
XYL-IV對(duì)于來自黑麥的幾種聚合木聚糖，沒有取代的木聚糖，MeGIcA-木聚糖和阿拉伯木聚糖的水解是有效的。與其它兩種以大約相等的速度裂解的木聚糖相比，阿拉伯木聚糖裂解更緩慢(圖5)。
實(shí)施例3-XYLs-I，-II，和-IV的組合或混合物對(duì)底物的水解用XYLs-I，-II，和-IV同時(shí)或依次對(duì)幾種底物水解證明XYL-IV表現(xiàn)出與其它木聚糖酶的協(xié)同作用。
表6和圖6給出以下研究的結(jié)果，其中底物分別與XYLs-I，-II，或-IV之一，或者與這些木聚糖酶的組合溫育。增加的XYL-IV的效果比簡(jiǎn)單加和更有效。就是說，發(fā)現(xiàn)有協(xié)同作用。盡管不限制本發(fā)明，相信該協(xié)同作用主要?dú)w因于XYL-IV水解XYL I和II產(chǎn)生的線性和取代的寡糖的能力。
表6.XYL-IV與XYLs-I及-II的協(xié)同作用
條件pH 4，40℃，24h，底物濃度5g/l。*Xyl+Xyl2+Xyl3+Xyl4+Xyl5的總和。**總和計(jì)算為木糖。***沒有進(jìn)行HPLC分析。****在這些實(shí)驗(yàn)中該底物的水解程度異常地低。*****在HPLC分析中寡糖被去乙酰化，因此數(shù)值代表水解之后乙?；蜎]有乙?；哪竟烟?。
表7和圖7給出以下研究的結(jié)果，其中底物與XYL-I一起溫育，該酶被加熱失活，然后該底物與XYL-IV溫育。這顯示XYL-I之后XYL-IV對(duì)底物依次裂解的結(jié)果。同樣，在XYL-I和XYL-IV之間發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用。
表7.XYL-I和之后XYL-IV的逐步水解
條件pH4，40℃，24h+24h，底物濃度5g/l；XYL I(100nkat/g或者5000nkat/g)和XYL IV(20nkat/g)。*Xyl+XYL2+XYL3+XYL4+XYL5的總和。**總和計(jì)算為木糖。
實(shí)施例4-編碼木霉屬XYL-IV的克隆DNA分子的制備下面提供制備包括實(shí)施例1描述的整個(gè)xyl4基因的克隆的方法。在該實(shí)施例中，通過使用下面方法制備來自木霉屬的基因組DNA或cDNA克隆。
合成一對(duì)適合用作PCR引物并且以SEQ ID NO1的cDNA序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸。使用這些引物和從Trichoderma reesei，例如，菌株QM6a(ATCC13631)分離的總基因組DNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。Boehringer Mannheim提供使用的DNA聚合酶(例如，Pwo聚合酶)，緩沖液和脫氧核苷酸混合物。對(duì)PCR使用典型條件，例如第一步，1分鐘，94℃；第二步，40秒，92℃；第三步，1分鐘，50℃；第四步，2分鐘，72℃；第二，三和四步重復(fù)29次；第五步，5分鐘72℃。
用限制性酶，例如，BglII和XbaI，兩個(gè)引物帶來的識(shí)別位點(diǎn)，消化PCR的主要DNA產(chǎn)物，并且從瓊脂糖電泳凝膠純化得到的片段。該DNA片段連接已經(jīng)用相同的限制性酶消化的合適載體，例如已經(jīng)用例如BglII和XhaI消化的pSL1180(Pharmacia)。一般對(duì)得到的質(zhì)粒測(cè)序以證明插入物相應(yīng)于木霉屬xyl4基因的預(yù)期片段。該DNA序列表明基因中任何內(nèi)含子和外顯子的存在。
質(zhì)粒，或者其包含的插入物，現(xiàn)在可以用作雜交探針，使得能從任何基因組DNA或者感興趣的cDNA文庫克隆整個(gè)xyl4基因。因?yàn)闆]有CBD或者接頭(絞合)區(qū)，質(zhì)粒中的XYL-IV編碼DNA不包括這些區(qū)。因此，通過設(shè)計(jì)，預(yù)期其與其它xyl4 DNA序列雜交而不和CBD編碼序列雜交，所述CBD編碼序列可能是其它木聚糖酶和糖苷酶基因的一部分。
分別用各種不同的限制性內(nèi)切酶消化來自T.reesei，例如，菌株QM6a的總基因組DNA并且進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。接著將DNA印跡到Nytran(S & S)濾膜上并且用合適的xyl4 DNA片段探測(cè)，該片段從質(zhì)粒分離并且通過Amersham提供的Megaprime隨機(jī)標(biāo)記系統(tǒng)用32p標(biāo)記。在例如含有30％甲酰胺，5XSSPE，0.5％SDS的典型緩沖液中在38℃下以中等嚴(yán)緊性進(jìn)行與探針的雜交。接著在用X-射線膠片曝光之前用中等嚴(yán)緊性洗滌濾膜，例如，在2XSSC，0.1％SDS中，在55℃下洗滌。結(jié)果表明T.reesei的基因組拷貝位于合適的限制性片段上。
如上所述給出例示的xyl4基因，通過如上所述插入質(zhì)粒中的PCR片段作為探針進(jìn)行菌落雜交從基因組DNA或cDNA文庫克隆Trichoderma reesei xyl4基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。
實(shí)施例5-分離在微生物中編碼XYL-IV的DNA序列的方法可以采用實(shí)施例1和4中的一般技術(shù)結(jié)合已知技術(shù)，獲得包括來自其它真菌或細(xì)菌的XYL-IV基因的克隆。和對(duì)整個(gè)xyl4分子一樣，可以標(biāo)記合適的質(zhì)粒或編碼部分xyl4基因的分離的DNA插入物。然后該DNA探針可以用來與來自其它真菌或細(xì)菌的基因組DNA或cDNA雜交。木霉屬XYL-IV的推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的其它木聚糖酶的氨基酸序列相比較可鑒定在XYL-IV和其它木聚糖酶之間保守的氨基酸的某些區(qū)。這些保守區(qū)為設(shè)計(jì)在來自其它微生物的XYL-IV編碼DNA的PCR擴(kuò)增中使用的簡(jiǎn)并引物提供了基礎(chǔ)。這樣的方法一般是本領(lǐng)域公知的并且認(rèn)為是常規(guī)的(參見例如，McPherson，等，PCR A PRACTICALAPPROACH pp.171-186(1991))。從這些氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)衍生的寡核苷酸用作使用基因組DNA的常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)的引物。容易從任何微生物獲得基因組DNA或cDNA并且用作該P(yáng)CR實(shí)驗(yàn)中的模板。用這種方法，有可能從各種微生物克隆編碼XYL-IV的基因。
實(shí)施例6-從其它微生物分離XYL-IV編碼序列的異源雜交方法可以用合適的限制性酶例如HindIII消化來自不同微生物的基因組DNA并且在1.0％瓊脂糖凝膠上分析。該凝膠被脫嘌呤，變性，和印跡，并且通過已知方法將膜進(jìn)行UV-交聯(lián)。利用已知方法，例如來自Boehringer Mannheim的DIG/GeniusTM System，進(jìn)行預(yù)雜交，雜交，探針標(biāo)記和檢測(cè)。
探針相應(yīng)于編碼整個(gè)T.reesei XYL-IV分子的核苷酸序列。用一對(duì)合適的限制性酶消化初始cDNA亞克隆(實(shí)施例1)，并且通過隨機(jī)引物標(biāo)記根據(jù)廠商(Boehringer Mannheim)說明用DIG-dUTP(洋地黃毒苷-dUTP)標(biāo)記得到的片段。
該膜預(yù)雜交之后在合適的封閉試劑例如5xSSC-0.1％N-月桂?；“彼?0.02％SDS-1％GeniusTM封閉試劑中，在合適的溫度例如45℃下雜交。雜交(一般過夜)之后洗滌。然后用合適的偶合物檢測(cè)并且例如使用化學(xué)發(fā)光底物CSPD根據(jù)廠商說明進(jìn)行觀察。
可利用該方法及其變化方法(不同雜交和洗滌條件)檢測(cè)來自任何生物體的XYL-IV編碼基因。
本發(fā)明參照各種具體的和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)進(jìn)行了描述。但是，應(yīng)該明白在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以進(jìn)行很多變化和修飾。
權(quán)利要求
1.分離的核酸，其包含與下面的分子有至少60％的序列同一性的DNA(a)編碼SEQ ID NO1中的cDNA所編碼的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)的DNA分子的互補(bǔ)分子。
2.權(quán)利要求1的核酸，其包含編碼SEQ ID NO1中的cDNA所編碼的相同成熟多肽的DNA分子。
3.權(quán)利要求1的核酸，其包含具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA分子。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述DNA分子具有至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
5.包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子。
6.來自微生物的部分或完全分離的XYL-IV蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的XYL-IV蛋白質(zhì)，其中所述XYL-IV來自真菌或細(xì)菌。
8.權(quán)利要求7的XYL-IV蛋白質(zhì)，其中所述真菌包含絲狀真菌。
9.權(quán)利要求8的XYL-IV蛋白質(zhì)，其中所述絲狀真菌包含木霉屬(Trichoderma spp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，鐮孢屬(Fusariumspp.)，青霉屬(Penicillium spp.)，或者膠霉屬(Gliocladium spp.)。
10.權(quán)利要求9的XYL-IV蛋白質(zhì)，其中所述絲狀真菌包含Trichoderma reesei。
11.權(quán)利要求6的XYL-IV蛋白質(zhì)，其含括(a)與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少70％的序列同一性的氨基酸序列，或者(b)SEQID NO2的氨基酸序列的衍生物，其中(a)或(b)的XYL-IV裂解木聚糖。
12.權(quán)利要求12的XYL-IV蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有至少80％的序列同一性，至少90％的序列同一性，或者至少95％的序列同一性。
13.權(quán)利要求12的XYL-IV蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.分離的DNA，其編碼權(quán)利要求6的XYL-IV蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求12的DNA，其中所述DNA來自真菌或細(xì)菌。
16.權(quán)利要求15的DNA，其中所述真菌包含絲狀真菌。
17.權(quán)利要求16的DNA，其中所述絲狀真菌包含木霉屬(Trichoderma spp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，鐮孢屬(Fusariumspp.)，青霉屬(Penicillium spp.)，或者膠霉屬(Gliocladium spp.)。
18.權(quán)利要求17的DNA，其中所述絲狀真菌包含Trichodermareesei。
19.權(quán)利要求14的DNA，其中所述DNA包含(a)與SEQ ID NO1的核苷酸序列有至少85％的序列同一性的核苷酸序列，或者(b)SEQID NO1的核苷酸序列的衍生物，其中(a)或(b)的DNA編碼裂解木聚糖的XYL-IV蛋白質(zhì)。
20.分離的包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA。
21.包含權(quán)利要求20的DNA的載體。
22.權(quán)利要求21的載體，其與載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞識(shí)別的控制序列可操作地連接。
23.用權(quán)利要求22的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含絲狀真菌。
25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中所述絲狀真菌包含木霉屬(Trichoderma spp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergi llus spp.)，或鐮孢屬(Fusarium spp.)。
26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其中所述絲狀真菌包含Trichoderma reesei。
27.產(chǎn)生XYL-IV蛋白質(zhì)的方法，包括(a)獲得已用包含編碼XYL-IV蛋白質(zhì)的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)在適合表達(dá)和，任選地，分泌，XYL-IV蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(c)回收XYL-IV蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述DNA來自絲狀真菌。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述絲狀真菌包含木霉屬(Trichoderma spp.)，腐質(zhì)霉屬(Humicola spp.)，鏈孢霉屬(Neurospora spp.)，曲霉屬(Aspergillus spp.)，鐮孢屬(Fusariumspp.)，或者膠霉屬(Gliocladium spp.)。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述絲狀真菌包含Trichodermareesei。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述DNA包含(a)與SEQ ID NO1的序列有至少60％的序列同一性的核苷酸序列，或者(b)SEQ ID NO1的核苷酸序列的衍生物，其中DNA編碼裂解木聚糖的XYL-IV蛋白質(zhì)。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述DNA包含SEQ ID NO1的核苷酸序列。
33.改變含有木聚糖的底物的性質(zhì)的方法，包括使含有木聚糖的底物接觸含有通過權(quán)利要求27的方法產(chǎn)生的XYL-IV蛋白質(zhì)的組合物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述方法包括改變動(dòng)物飼料和食品及植物材料的處理性質(zhì)。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述方法包括在造紙過程中改變木紙漿或者其衍生物的性質(zhì)。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述方法包括在含有木聚糖的生物質(zhì)還原為葡萄糖的過程中改變含有木聚糖的生物質(zhì)的性質(zhì)。
37.與XYL-IV特異性結(jié)合的抗體。
38.權(quán)利要求37的抗體，其包含單克隆抗體。
39.鑒定與XYL-IV編碼核酸同源的核酸的方法，包括在至少中等嚴(yán)緊條件下將與(a)編碼SEQ ID NO1中的cDNA所編碼的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)的DNA分子的互補(bǔ)分子有至少60％序列同一性的DNA的至少大約14個(gè)連續(xù)核苷酸的xyl4核酸與測(cè)試核酸雜交；篩選與該xyl4核酸雜交的測(cè)試核酸；分離雜交的測(cè)試核酸。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述雜交的測(cè)試核酸編碼XYL-IV。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述雜交的測(cè)試核酸編碼還沒有歸類的木聚糖酶。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述雜交的測(cè)試核酸編碼木聚糖酶。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述雜交在高嚴(yán)緊條件下進(jìn)行。
44.至少大約10個(gè)核苷酸的分離的核酸，其包含與(a)編碼SEQID NO1中的cDNA所編碼的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)(a)的DNA分子的互補(bǔ)分子有至少60％序列同一性的DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的木聚糖酶(稱之為XYL－IV)并且涉及編碼那些木聚糖酶的核酸分子。這里還提供了包括那些核酸序列的載體和宿主細(xì)胞，與本發(fā)明的木聚糖酶結(jié)合的抗體，制備本發(fā)明的木聚糖酶的方法，和應(yīng)用本發(fā)明的木聚糖酶的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1415016SQ00817933
公開日2003年4月30日 申請(qǐng)日期2000年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月30日
發(fā)明者M·L·A·薩洛海默, M·?？?奧, M·坦卡南, M·E·潘提拉 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司