專利名稱：用于區(qū)別性調(diào)節(jié)膜脂和種子油中脂肪酸不飽和性的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的方面一般地涉及脂 肪酸生物合成，膜脂和植物種子油，且更具體地涉 及不飽和脂肪酸及相關(guān)酰基甘油，以及涉及基于先前未知的生物合成途徑的調(diào)節(jié)，區(qū)別 性調(diào)節(jié)植物種子油和膜脂中脂肪酸不飽和性的組合物和方法，所述途徑涉及在發(fā)育的 含油種子植物(例如，擬南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycine max)，油菜(甘藍(lán)型油菜 (Brassica napus)或白菜型油菜(B.rapa))，向日葵(Helianthus annuus)，等)中調(diào)節(jié)磷脂酰 膽堿生物合成的新型磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)。具體的方面涉及本 發(fā)明的PDCT多肽包括，例如，其變體、缺失、突變蛋白、融合蛋白、和直向同源物(總 的來說，PDCT蛋白)，涉及編碼它們的分離的核酸，涉及包含所述PDCT蛋白或缺乏所 述PDCT蛋白的植物，且涉及用于生成具有改變的或無PDCT表達(dá)和/或活性的植物的 方法，包括但不僅限于包括誘變，基因沉默，反義，siRNA，重組DNA，轉(zhuǎn)基因?qū)W等方 法。相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本發(fā)明要求2009年2月2日提交的標(biāo)題為“用于區(qū)別性調(diào)節(jié)膜脂和種子油中脂 肪酸不飽和性的組合物和方法”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/149,288，和2008年3月 4日提交的具有相同標(biāo)題的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/033,742的優(yōu)先權(quán)，將這二者通常 參考整體結(jié)合于此。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明是至少部分地在由美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)頒發(fā)的政府資金 2006-35318-17797和97-35301-4426支持下完成的，因此美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有一定的 權(quán)利。背景許多植物物種包括，例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)在它們的種子中儲(chǔ)存 三酰甘油(TAGs)作為碳儲(chǔ)備。這些TAGs是在植物生命早期支持種子發(fā)育的主要能量 和碳物質(zhì)來源。來自大豆(Glycine max)，油菜(甘藍(lán)型油菜或白菜型油菜)，向日葵 (Helianthus annuus)和許多其他含油種子農(nóng)作物的植物油也是人類飲食或工業(yè)應(yīng)用包括， 但不僅限于生物燃料、生物潤(rùn)滑劑、尼龍前體、和清潔劑原料的重要來源。植物油的多 不飽和脂肪酸的程度和/或量是關(guān)于油在食品或非食品工業(yè)中應(yīng)用的特有決定性特性。 更具體地，植物油的特有特性和效用主要由其在TAG中的脂肪酰基組合物決定。主要的植物油主要包括棕櫚酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:lciSA9)，亞油 酸(18:2ciSA9’ 12)，和α-亞油酸(18:3ciSA9’ 12’ 15)。至少一個(gè)世紀(jì)以來試圖尋求脂肪酸 組合物的修飾，從而為人類營(yíng)養(yǎng)和化學(xué)(例如油化學(xué))應(yīng)用提供最佳油產(chǎn)品(1-3)。具體 地，多不飽和脂肪酸(18:2和18:3)已經(jīng)受到大量關(guān)注，因?yàn)樗鼈兪怯绊憼I(yíng)養(yǎng)價(jià)值和油穩(wěn) 定性的主要因素。然而，盡管這兩種脂肪酸為人類和動(dòng)物提供基本營(yíng)養(yǎng)，但是它們?cè)黾?油的不穩(wěn)定性，因?yàn)樗鼈儼鄠€(gè)在加工和保存過程中易被氧化的雙鍵。
現(xiàn)有技術(shù)的 局限性。18:1至18:2的去飽和作用是合成多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵步 驟。在保存脂質(zhì)生物合成的過程中，已知該反應(yīng)受脂肪酸去飽和酶FAD2，即一種位于內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)(ER)上的膜結(jié)合酶的催化(4)。FAD2底物18:1必須在磷脂酰膽堿(PC)，即植物細(xì) 胞的主要膜磷脂的位置上酯化(5，6)。因此，不意外的是，F(xiàn)AD2 (和FAD3)基因 的下調(diào)成為避免對(duì)氫化植物油和不希望的副產(chǎn)物反式脂肪酸的需要的優(yōu)選策略。例如， 大豆具有種子特異性和組成型FAD2去飽和酶二者，因此種子特異性同種型的基因沉默容 許產(chǎn)生高油酸的栽培種(在油中>88% 18:1)，在所述栽培種中膜不飽和性和植物表現(xiàn)主 要不受影響。然而，顯著地，所述FAD2基因沉默策略受到很大局限，因?yàn)?，例如，油?及其它含油種子植物僅具有組成型FAD2酶。因此，在油菜和其他所述組成型FAD2農(nóng)作 物中，F(xiàn)AD2的沉默或下調(diào)不僅改變種子中儲(chǔ)存三酰甘油(TAG)的脂肪酸組成，而且改變 細(xì)胞膜的脂肪酸組成，這嚴(yán)重危害植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。例如，擬南芥突變體fad2中的缺 陷性FAD2改變種子和植物組織的脂肪酸組成，且嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)(4)。在油中產(chǎn)生最 高18:1水平的FAD2突變和沉默也減少植物和種子組織中的膜不飽和性，由此產(chǎn)生發(fā)芽和 生長(zhǎng)不良的植物。結(jié)果，僅部分下調(diào)FAD2表達(dá)是可能的，其在商業(yè)栽培種諸如Nexera/ Natreon (Dow AgroSciences)禾Π Clear Valley 75 (Cargill)的油中產(chǎn)生約 70-75% 18:1。因此，本領(lǐng)域中明確需要在不存在對(duì)膜脂成分不飽和性的有害變化的條件下， 區(qū)別性調(diào)節(jié)植物種子油和膜脂中脂肪酸不飽和性的新型組合物和方法，和在種子油中具 有減小的脂肪酸不飽和性的可生存植物(例如油菜等)。示范性實(shí)施方案概述具體方面提供在不存在對(duì)膜脂成分不飽和性的有害變化的條件下，區(qū)別性調(diào)節(jié) 種子油和膜脂中脂肪酸不飽和性的新型組合物和方法。另外的方面提供基于先前未知的生物合成途徑的調(diào)節(jié)來區(qū)別性調(diào)節(jié)植物種子油 和膜脂中脂肪酸不飽和性的組合物和方法，所述途徑涉及在發(fā)育的含油種子植物(例 如，擬南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycinemax)，油菜(白菜型油菜或甘藍(lán)型油菜)，向日 葵(Helianthus annuus)，等)中調(diào)節(jié)磷脂酰膽堿生物合成的新型磷脂酰膽堿二酰甘油磷 酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)。其他方面提供本發(fā)明的PDCT多肽包括，例如，其變體、缺失、突變蛋白、融 合蛋白、和直向同源物(總的來說，PDCT蛋白)。另外的方面提供包含所述PDCT序列或蛋白或缺乏或耗盡所述PDCT蛋白或序列 的植物，和用于生成具有改變的或無PDCT表達(dá)和/或活性的植物的方法，包括但不僅限 于包括誘變，基因沉默，反義，siRNA，重組DNA，轉(zhuǎn)基因?qū)W等方法。具有方面提供用于調(diào)節(jié)種子油中的脂肪酸不飽和性的方法，其包括獲得具有 含油種子的植物；和調(diào)節(jié)至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述 植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中的表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和 性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。在某些實(shí) 施方案中，調(diào)節(jié)至少一種PDCT的表達(dá)或活性包括下調(diào)所述表達(dá)或活性，其中所述種子 油中的脂肪酸不飽和性的水平、量或分布改變，下降。優(yōu)選地，所述方法包括相對(duì)于一 種或多種膜脂中的脂肪酸不飽和性來區(qū)別性調(diào)節(jié)種子油中的脂肪酸不飽和性。優(yōu)選地， 在種子油中相對(duì)于一種或多種膜脂中的脂肪酸不飽和性區(qū)別性減小種子油中的脂肪酸不飽和性。另外的方面提供產(chǎn)生具有含油種子的植物或其部分的方法，其包括賦予具有含 油種子植物品種的種質(zhì)突變或遺傳變化，所述突變或遺傳變化改變至少一種PDCT在所 述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和 性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。其他實(shí)施方案包括具有含油種子的植物或其部分，其包括突變或遺傳變化，所 述突變或遺傳變化改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述植 物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的 水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。盡管突變或遺 傳變化可以是直接或間接改變PDCT表達(dá)和/或活性的突變或遺傳變化，在具體方面，突 變包括至少一種PDCT序列的突變，所述突變改變其在所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā) 育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的水平、量或分布相對(duì)于具 有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。另外的方面提供源自本文中提供的具有含油種子的植物或其部分的種子或純育 禾中子(true-breeding seed)。其他方面提供源自本文中提供的具有含油種子的植物或其部分的油。另外的實(shí)施方案提供至少部分地基于至少一種源自本文中提供的具有含油種子 的植物或其部分的油的燃料(例如，生物燃料)。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1D顯示擬南芥發(fā)育種子中的脂質(zhì)合成。發(fā)育種子用放射性乙酸(用于標(biāo) 記脂肪酸)(圖IC和1D)和放射性甘油(用于標(biāo)記脂質(zhì)主鏈)(圖IA和1B)來標(biāo)記。用 [14-C]標(biāo)記的甘油(C)或乙酸酯(D)脈沖15min后，追蹤進(jìn)行180min。在0，30，60和 180min時(shí)間點(diǎn)時(shí)確定PC，DG和TG中的放射性。圖1E-1H顯示來自開花后9天的發(fā)育種子的TG，DG, PC和PE中rodl和WT
之間的脂肪酸組成比較。圖2A-2C顯示RODl基因在擬南芥中被確定為At3gl5820。圖2D顯示基于圖譜確定擬南芥染色體3上的RODl基因座。圖3A-3C顯示RODl起磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶作用。圖4顯示DH4中的RODl突變體截短氨基酸序列(SEQ ID NO 5)。根據(jù)具體 的方面，磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)突變體(rodl)編碼序列(SEQ ID NO 4)在核苷酸位置228處包含G > A改變，從而引起PDCT蛋白的過早終止，由此 提供75個(gè)氨基酸的截短的RODl突變體序列(SEQ ID NO 5)。圖5顯示，根據(jù)具體的示范性方面，LPT家族成員之間的主要序列關(guān)系。根據(jù) 具體方面，RODl屬于脂質(zhì)磷酸酶/磷酸轉(zhuǎn)移酶家族。圖6顯示，根據(jù)具體的示范性方面，不同生物體中與擬南芥RODl同源的已知的 序列。根據(jù)具體方面，RODl調(diào)節(jié)含油種子中二酰甘油和磷脂酰膽堿之間的平衡。圖7顯示，根據(jù)具體的示范性方面，擬南芥和 酵母細(xì)胞中RODl和At3gl5830 表達(dá)的RT-PCR。泳道1-8是關(guān)于RODl的結(jié)果，且泳道9_16是關(guān)于At3gl5830的結(jié) 果。RT-PCR樣品是來自WT擬南芥的發(fā)芽苗(1，9)，嫩葉(2，10)，花(3，11)，長(zhǎng)角果(4，12)和來自rodl突變植物的長(zhǎng)角果(5，13)的總RNA ；包含p424GPD(7，15)或 p424RODl (8)和P424_At3gl5830 (16)的酵母細(xì)胞；和來自rodl的基因組DNA。
圖8顯示，根據(jù)具體的示范性方面，擬南芥中RODl基因的數(shù)字Northern分 析。 用于構(gòu)建數(shù)字 Northern 的數(shù)據(jù)由 Genevestigator 立占點(diǎn)(genevestigator.ethz.ch/)的 AtGenExpress獲得。信號(hào)強(qiáng)度對(duì)該圖中包括的全部階段進(jìn)行平均化。圖9A-9G顯示，根據(jù)具體的示范性方面，RODl具有磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸 膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)活性。(A) CPT測(cè)定的TLC圖像。(B)PDCT測(cè)定的TLC圖像。使 用用 p424GPD(V)或p424RODl(R)轉(zhuǎn)化的 DBYM6 (WT)和 HJO9I 釀酒酵母(S.cerevisiae) 細(xì)胞的微粒體，且所有實(shí)驗(yàn)中的TLC溶劑系統(tǒng)是氯仿/甲醇/水=65/25/4(體積)。 底物，關(guān)于CPT是CDP_[14C]膽堿和二油精，關(guān)于PDCT分別是[14C-甘油]二 18:1-DG 和PC (O或ImM)。b =煮沸的微粒體蛋白。(C)RODl-轉(zhuǎn)化的酵母微粒體在[14C-甘 油]二 18:1-DG分別與PC (O或ImM)，CDP-膽堿，磷酸膽堿和溶解-PC的反應(yīng)中的 PDCT活性。(D)用載體p424GPD (V)或p424RODl (R)轉(zhuǎn)化的HJ091細(xì)胞的微粒體用二 14:0-PC[14C_膽堿]和二 18:1-DG溫育，以進(jìn)行PDCT測(cè)定。(E)pH對(duì)PDCT活性的影 響。(F-H)PDCT活性分別作為溫育時(shí)間、添加的微粒體蛋白和PC函數(shù)的線性。數(shù)據(jù) 表示三次獨(dú)立反應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。示范性實(shí)施方案詳述具體方面提供在不存在對(duì)膜脂成分不飽和性的有害變化的條件下，區(qū)別性調(diào)節(jié) 種子油和膜脂中脂肪酸不飽和性的新型組合物和方法。另外的方面提供基于先前未知的生物合成途徑的調(diào)節(jié)來區(qū)別性調(diào)節(jié)植物種子油 和膜脂中脂肪酸不飽和性的組合物和方法，所述途徑涉及在發(fā)育的含油種子植物(例 如，擬南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycinemax)，油菜(甘藍(lán)型油菜或白菜型油菜)，向日 葵(Helianthus annuus)，等)中調(diào)節(jié)磷脂酰膽堿生物合成的新型磷脂酰膽堿二酰甘油磷 酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)。其他方面提供本發(fā)明的PDCT序列和多肽包括，例如，其突變體(例如，SEQID NOS 4和5)、變體、缺失、突變蛋白、融合蛋白、和直向同源物(總的來說，PDCT蛋 白)。另外的方面提供包含所述PDCT蛋白或缺乏或缺少所述PDCT序列或蛋白和/或 活性的植物，和用于生成具有改變的或無PDCT表達(dá)和/或活性的植物的方法，包括但不 僅限于包括誘變，基因沉默，反義，siRNA，重組DNA，轉(zhuǎn)基因?qū)W等本領(lǐng)域公知方法。 關(guān)于誘變劑和誘變種子或花粉的信息，例如在IAEA的Manual on Mutation Breeding (突變 育種手冊(cè))(IAEA，1977)中介紹。在某些實(shí)施方案中，誘變包括化學(xué)誘變(例如包括用 甲磺酸乙酯處理種子)。在下文中詳細(xì)討論有效用于提供本發(fā)明植物的多種植物育種法。如下文中所述，本發(fā)明的具體的示范性方面提供在種子脂肪酸中具有減小的去 飽和作用的擬南芥突變植物的遺傳或生物化學(xué)特征(見以下實(shí)施例2的表1)。突變植 物，最初確定并命名為DH4 (7)，不能與其在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)的親本野生型Col-O植物相 區(qū)分。申請(qǐng)人此處公開了編碼PDCT的基因RODl (Reduced Oleate Desaturation 1)，這種 在DH4擬南芥突變體中的突變導(dǎo)致種子油中減小的油酸去飽和水平。DH4中的rodl等位 基因是單隱性孟德爾突變，如通過遺傳分析所確定地。如本文中所示(工作實(shí)施例2)，rodl突變體中的缺陷性PDCT活性導(dǎo)致發(fā)育種子中三酰甘油合成過程中減少的18:1脂肪酸 到磷脂酰膽堿(PC)轉(zhuǎn)化。該結(jié)果說明PDCT是調(diào)節(jié)脂質(zhì)流到磷脂酰膽堿的主要因素，其 中大部分脂肪酸修飾在含油種子中發(fā)生。顯著地，與fad2突變體相比(5，7)，DH4中的脂肪酸組成變化局限于種子油。如下文中在工作實(shí)施例3中所述，本發(fā)明的具體的示范性方面顯示DH4的擬南 芥突變體rodl基因座被顯示在種子油中介導(dǎo)減小的油酸去飽和作用，這歸因于通過由二 酰甘油(DAG)的從頭合成減少的18:1至PC的轉(zhuǎn)化。根據(jù)另外的方面，如下文中實(shí)施例4中所述，對(duì)DH4的擬南芥突變體rodl進(jìn)行 精細(xì)繪圖，且At3gl5820(SEQ ID NO 2)在本文中確定為rodl突變體(SEQ ID NO 4) 的基因座，且首次顯示不僅是磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)，而且是在 發(fā)育種子中高度表達(dá)的PCDT，其最高水平在種子發(fā)育的第6階段，這與儲(chǔ)存沉積的峰值 階段相一致。顯著地，At3gl5820(SEQIDNO: 2)以前已經(jīng)被注解為推定2型磷脂酸磷酸酶 (PAP2)樣蛋白。然而，意外地，根據(jù)申請(qǐng)人分析，其沒有顯示出與已知表征的擬南芥中 的PAP基因(AtLPP 1，AtLPP2和AtLPP3) (13，14)的強(qiáng)同源性，且本申請(qǐng)人在本文中確 定RODl基本不含與這些真PAP2直向同源物的序列同源性，并推斷RODl編碼不同的功 能。

本申請(qǐng)人在缺乏全部CDP-膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶活性的雙突變酵母菌 株HJ091(17)中，通過在可誘導(dǎo)的GALl啟動(dòng)子的控制下表達(dá)At3gl5820的cDNA來測(cè)試 了 RODl的PDCt活性。如本文中詳述地(實(shí)施例4)，這些結(jié)果說明RODl不具有PA磷 酸酶活性，且基本證實(shí)RODl而是賦予PDCT活性，這與rodl突變體在發(fā)育種子中的PC 合成中具有缺陷的事實(shí)相一致。根據(jù)另外的方面，如在下文中的實(shí)施例5中所述，確定RODl(At3gl5820)直向 同源物具有顯著的序列同源性/同一性。實(shí)施例5的表2和3分別顯示來自蕓苔(Brassica) (SEQ ID NO 6 ； SEQ ID NO 7)，苔蘚(Moss) (SEQ ID NO 16; SEQ ID NO 17)， 云杉(Spruce) (SEQ ID NO 14 ； SEQID NO 15)，葡萄(Grape) (SEQ ID NO 12 ； SEQ ID NO 13)，稻米(Rice) (SEQID NO 10 ； SEQ ID NO 11)和蓖麻(Castor) (SEQ ID NO 8 ； SEQ ID NO 9)的示范性RODl直向同源物的核苷酸相似性(％同一性)和蛋白 序列相似性(％同一性)，其顯示約46-80%的核酸同一性范圍，和約42-85%的蛋白序列 同一性范圍。根據(jù)另外的方面，如下文中實(shí)施例6中所述，甘藍(lán)型油菜單基因Bna.6194確 定為真擬南芥RODl(At3gl5820)同源物。申請(qǐng)人將Bna.6194命名為BnRODl。定量 RT-PCR顯示BnRODl在油菜發(fā)育種子中高度表達(dá)。甘藍(lán)型油菜是雙二倍體，包括白菜 型油菜和甘藍(lán)(Brassica oleracea)兩種亞基因組。序列比對(duì)也提示BnRODl可能是白菜型 油菜單基因Bra.2038和甘藍(lán)ES948687的真同源物。根據(jù)其他方面，如下文中實(shí)施例7中所述，如本文中提供的包含相對(duì)高濃度的 具有適度不飽和性的長(zhǎng)鏈脂肪的生物材料(例如，植物種子油)提供用于生產(chǎn)生物柴油及 其相關(guān)產(chǎn)品，以及食物油的改良原料。特別優(yōu)選的示范性實(shí)施方案
具體方面提供調(diào)節(jié)種子油中脂肪酸不飽和性的方法，包括獲得具有含油種子 的植物；和調(diào)節(jié)至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述植物的 一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中的表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的水 平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。在某些實(shí)施方 案中，調(diào)節(jié)至少一種PDCT的表達(dá)或活性包括下調(diào)所述表達(dá)或活性，其中所述種子油中 的脂肪酸不飽和性的水平、量或分布改變或下降。優(yōu)選地，所述方法包括相對(duì)于一種或 多種膜脂中的脂肪酸不飽和性來區(qū)別性調(diào)節(jié)種子油中的脂肪酸不飽和性。優(yōu)選地，在種 子油中相對(duì)于一種或多種膜脂中的脂肪酸不飽和性區(qū)別性減小種子油中的脂肪酸不飽和 性。在具體的實(shí)施方案中，所述至少一種PDCT包括選自由以下組成的組的至少一種序 列SEQ ID NO: 3，與其具有至少46%，至少48%，至少58%，至少64%，至少71% 或至少85%氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分。在某些實(shí)施方案中，所 述至少一種PDCT包括選自由以下組成的組的至少一種序列SEQ ID NOS 7，9，11， 13，15，17，及其PDCT活性部分。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)至少一種PDCT的表達(dá)或 活性包括至少一種誘變和重組DNA方法的應(yīng)用，包括但不僅限于基因沉默，反義法， SiRNA法，轉(zhuǎn)基因法中至少一種的應(yīng)用。 另外的方面提供生產(chǎn)具有含油種子的植物或其部分的方法，包括賦予具有含油 種子植物品種的種質(zhì)突變或遺傳變化，所述突變或遺傳變化改變至少一種PDCT在所述 植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性 的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。本發(fā)明的具 體實(shí)施方案包括提供具有含油種子植物品種的種質(zhì)；用誘變劑處理所述種質(zhì)以生成誘 變的種質(zhì)；由所述誘變的種質(zhì)中選擇由所述誘變劑導(dǎo)致具有這樣的基因型的具有含油種 子的植物種子，所述基因型改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT) 在所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不 飽和性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化；和由 所述種子生長(zhǎng)具有含油種子的植物。在本方法的具體執(zhí)行中，生成誘變的種質(zhì)包括生成 至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)序列的突變，所述突變改變其在 所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽 和性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。另外的實(shí)施方案包括具有含油種子的植物或其部分，其包括突變或遺傳變化， 所述突變或遺傳變化改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述 植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性 的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。盡管突變或 遺傳變化可以是直接或間接改變PDCT表達(dá)和/或活性的突變或遺傳變化，在具體方面， 突變包括至少一種PDCT序列的突變，所述突變改變其在所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或 發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的水平、量或分布相對(duì)于 具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。在某些方面，具有含油種子的植物或 其部分是不同于擬南芥。優(yōu)選地，在這樣的植物中，調(diào)節(jié)至少一種PDCT的表達(dá)或活性 包括下調(diào)表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的水平、量或分布改變，下 降。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)表達(dá)或活性包括相對(duì)于一種或多種膜脂中的脂肪酸不飽和性來區(qū)別性調(diào)節(jié)種子油中的脂肪酸不飽和性。具體的植物實(shí)施方案包括兩種以上不同突變或遺傳變 化，所述突變或遺傳變化改變種子油中脂肪酸不飽和性的水平、量、或分布，其中所述 兩種以上不同突變或遺傳變化中的至少一種是改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽 堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性的突變或遺傳 變化。在所述植物的具體實(shí)施方案中，所述兩種以上不同突變中的至少一種是減小或消 除種子或發(fā)育種子中FAD2活性或量的FAD2去飽和酶突變。在某些方面中，所述至少一 種PDCT包括選自由以下各項(xiàng)組成的組的至少一種序列SEQID NO: 3，與其具有至少 46%,至少48%，至少58%，至少64%，至少71%或至少85%氨基酸序列同一性的序 列，及其PDCT活 性部分。在具體實(shí)施方案中，所述至少一種PDCT包括選自由以下組 成的組的至少一種序列SEQ ID NOS: 7，9，11，13，15，17，及其PDCT活性部分。另外的方面提供源自本文中提供的具有含油種子的植物或其部分的種子或純育 種子。其他方面提供源自本文中提供的具有含油種子的植物或其部分的油。另外的實(shí)施方案提供至少部分地基于源自本文中提供的具有含油種子的植物或 其部分的油的燃料。植物和植物育種具體方面提供具有含油種子的植物或其部分，其包括突變或遺傳變化，所述突 變或遺傳變化改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)在所述植物 的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和性的水 平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。盡管突變或遺傳 變化可以是改變PDCT表達(dá)和/或活性的任何突變或遺傳變化，在優(yōu)選的方面，所述突變 包括至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)序列的突變，所述突變改變 其在所述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中表達(dá)或活性，其中所述種子油中的脂肪酸 不飽和性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。多種植物育種法也有效用于基于所述突變或遺傳變化構(gòu)建有效植物品種。植物育種另外的發(fā)明包括用于在植物育種中使用具有含油種子的植物的方法，所述植物 包括改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所 述植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中的表達(dá)或活性的突變，其中所述種子油中的脂肪 酸不飽和性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。 一個(gè)這樣的實(shí)施方案是使具體PDCT突變品種與另一植物品種雜交，以形成第一代Fl植 物群。由該方法產(chǎn)生的第一代Fl植物群也是本發(fā)明的實(shí)施方案。該第一代Fl植物群應(yīng) 該包括基本整套具體PDCT突變品種的等位基因。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員可以利用育 種者書籍或分子方法來識(shí)別利用具體PDCT突變品種產(chǎn)生的具體Fl植物，且任何這樣的 個(gè)體植物也屬于本發(fā)明。這些實(shí)施方案還包括具體PDCT突變品種的轉(zhuǎn)基因或回交轉(zhuǎn)變 用于產(chǎn)生第一代Fl植物的應(yīng)用。另外的方面包括發(fā)育具體PDCT突變體-后代植物的方法，包括使具體PDCT突 變品種與第二種植物雜交和執(zhí)行育種方法，其也是本發(fā)明的實(shí)施方案。一般性育種和選擇法
總述。植物育種是植物的遺傳操作。植物育種的目的是開發(fā)新型、獨(dú)特且優(yōu)越植物品種。在植物育種程序的具體應(yīng)用中，且如下文中更具體討論地，育種者最初選擇 并雜交兩種以上親本品系，隨后重復(fù)“自交”和選擇，產(chǎn)生許多新遺傳組合。育種者理 論上可以通過雜交、“自交”和天然誘導(dǎo)的突變生成數(shù)十億不同的遺傳組合。育種者對(duì) 細(xì)胞水平不具有直接的控制，且因此兩名育種者永遠(yuǎn)不會(huì)開發(fā)完全相同的品系。每年， 植物育種者選擇種質(zhì)，以進(jìn)展至下一代。該種質(zhì)可以在獨(dú)特且不同的地理、氣候和土壤 條件下生長(zhǎng)，且進(jìn)一步的選擇可以在生長(zhǎng)季過程中和結(jié)束時(shí)進(jìn)行。適當(dāng)?shù)臏y(cè)試可以檢測(cè)主要缺陷和確定超越目前品種的優(yōu)越性或改進(jìn)水平。除顯 示優(yōu)越表現(xiàn)外，對(duì)新品種的需要是理想的。新品種最好應(yīng)該與工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相一致，或創(chuàng)建 新的市場(chǎng)。新品種的引入可以對(duì)種子生產(chǎn)者、生長(zhǎng)者、加工者和消費(fèi)者引起另外的關(guān)于 具體廣告和行銷、改變的種子和商業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐、和新產(chǎn)品利用的成本。該測(cè)試在釋放新 品種前應(yīng)該考慮研究和開發(fā)成本以及最終品種的技術(shù)優(yōu)越性。理想地，容易和經(jīng)濟(jì)地生 產(chǎn)種子也應(yīng)該是可行的。術(shù)語(yǔ)“純合植物”在此定義為在其基因座95%以上具有純合基因的植物。術(shù)語(yǔ)“近交”用于本文中時(shí)，意指純合植物或純合植物的集合。育種或選擇法的選擇。育種或選擇法的選擇取決于植物繁殖的模式，改良特性 的遺傳力，和商業(yè)上所用品種的類型(例如，F(xiàn)l雜交品種、純品系品種等)。對(duì)于高度 可遺傳的特性，在單位置處評(píng)估的優(yōu)越個(gè)體植物選擇應(yīng)該是有效的，而對(duì)于具有低遺傳 力的特性，選擇應(yīng)該基于獲自相關(guān)植物家族的重復(fù)評(píng)估的平均值。遺傳復(fù)雜性也影響育 種法的選擇。育種通常由交叉雜交兩種基因型(“育種雜交”)開始，每種基因型可以 具有一種或多種所需特征，所述特征是另一基因型中所缺乏的或補(bǔ)充另一基因型。如果 兩種初始的親本不提供所有所需的特征，則可以通過進(jìn)行更多雜交引入其他來源。在每 個(gè)連續(xù)雜交后代(例如，F(xiàn)l — F2 ； F2 — F3 ； F3 — F4 ； F4 — F5，等)中，植物“自 交”，以增加品系的純合性。典型地，在育種程序中，進(jìn)行5代以上選擇和“自交”， 以獲得純合植物。每個(gè)植物育種程序應(yīng)該包括周期性客觀評(píng)估育種步驟的效率。評(píng)估標(biāo) 準(zhǔn)取決于目的和目標(biāo)而變化，但應(yīng)該包括基于與適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的比較每年來自選擇的增加， 先進(jìn)育種品系的總價(jià)值，和每單位輸入(例如，每年、每花費(fèi)一元等)所產(chǎn)生的成功品系 的數(shù)量?；亟晦D(zhuǎn)變另外的實(shí)施方案包括或是具有含油種子的植物的回交轉(zhuǎn)變，所述植物包括改變 至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的 一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中的表達(dá)或活性的突變，其中所述種子油中的脂肪酸不飽和 性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。當(dāng)通過傳 統(tǒng)(非轉(zhuǎn)化)育種技術(shù)，諸如回交引入DNA序列時(shí)，發(fā)生回交轉(zhuǎn)變。DNA序列，無論 是天然存在或轉(zhuǎn)基因的，可以利用這些傳統(tǒng)育種技術(shù)引入。通過該方法轉(zhuǎn)移的所需特性 包括，但不僅限于營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)、工業(yè)增強(qiáng)、抗病性、抗昆蟲性、抗除草劑性、農(nóng)業(yè)增強(qiáng)、 谷物質(zhì)量增強(qiáng)、蠟質(zhì)淀粉、育種增強(qiáng)、種子生產(chǎn)增強(qiáng)、和雄性不育。另外的實(shí)施方案包 括或是開發(fā)回交轉(zhuǎn)變植物的方法，其包括與所述PDCT突變體的重復(fù)回交。進(jìn)行的回交 次數(shù)可以是2，3，4，5，6次或更多，且所用回交的具體次數(shù)應(yīng)該取決于供方親本的遺傳學(xué)，和是否在回交程序中使用分子標(biāo)記?；狙苌贩N本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案是具有含油種子的植物的基本衍生品種，所述品種包括改變至少一種磷脂酰膽堿二酰甘油磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述 植物的一個(gè)或多個(gè)種子或發(fā)育種子中的表達(dá)或活性的突變，其中所述種子油中的脂肪酸 不飽和性的水平、量或分布相對(duì)于具有PDCT正常種子表達(dá)的植物的種子油而變化。如 通過UPOV大會(huì)所確定地，基本衍生品種可以例如通過選擇天然的或誘導(dǎo)的突變體或體 細(xì)胞克隆變體，由最初品種植物選擇變體個(gè)體，回交，或通過遺傳工程轉(zhuǎn)化來獲得。所 述PDCT突變體的基本衍生品種進(jìn)一步定義為這樣的品種，所述品種的產(chǎn)生需要對(duì)其進(jìn) 行反復(fù)使用，或其主要源自具體PDCT突變體的基因型。如1991年3月19日修改的 International Convention for the Protection ofNew Varieties of Plants (國(guó)際植物新品種保護(hù)大 會(huì))，第V章，文章14，部分5(c)。DNA構(gòu)建體本發(fā)明還預(yù)期制造DNA構(gòu)建體(例如，表達(dá)載體、重組載體、反義構(gòu)建體、 SiRNA構(gòu)建體，等)，其包括分離的核酸序列，所述核酸序列包含來自公開的PDCT突變 品種的遺傳元件和/或編碼序列，其與植物基因表達(dá)控制序列可操作連接?！癉NA構(gòu)建 體”在本文中定義為有效用于將DNA引入宿主細(xì)胞的構(gòu)建的(非天然存在的)DNA分 子，且該術(shù)語(yǔ)包括嵌合基因、表達(dá)盒、和載體。用于本文中時(shí)，“可操作連接”意指處于表達(dá)編碼蛋白的方式的DNA序列(包 括序列的順序、序列的方向、和不同序列的相對(duì)間隔)連接。使表達(dá)控制序列與編碼序 列可操作連接的方法是本領(lǐng)域中公知的。參見，例如，Maniatis等，MolecularCloning: A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor (冷泉港)，N.Y.， 1982 ；禾Π Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè))，ColdSpring Harbor (冷泉港)，N.Y.，1989?！氨磉_(dá)控制序列”是以任何方式參與控制轉(zhuǎn)錄或翻譯的DNA序列。合適的表達(dá) 控制序列和制備和使用它們的方法是本領(lǐng)域中公知的。表達(dá)控制序列優(yōu)選包括啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的或組成型的。其可以是 天然存在的，可以由多種天然存在的啟動(dòng)子的部分組成，或可以是部分或全部合成的。 設(shè)計(jì)啟動(dòng)子的指導(dǎo)是通過研究啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)提供的，諸如Harley和Reynolds，NucleicAcids Res.(核酸研究)，15，2343-2361，1987。而且，可以最優(yōu)化啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始的 位置。參見，例如，Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))，76: 760-764， 1979。許多適合用于植物中的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。例如，適合用于植物中 的組成型啟動(dòng)子包括植物病毒啟動(dòng)子，諸如花生褪綠條死病花椰菜花葉病毒(PClSV) 啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,850,019)；來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S啟動(dòng) 子(Odell等，1313:3810-812，1985)；小球藻病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子(美 國(guó)專利號(hào)5,563,328)；來自玄參花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào) 5,378,619)；來自如稻米肌動(dòng)蛋白的基因的啟動(dòng)子(McElroy等，Plant Cell (植物細(xì) 胞)2: 163-171(1990))，泛蛋白(Christiansen 等，Plant Mol.Biol.(植物分子生物學(xué))12 619-632，1989)，和(Christiansen 等，Plant Mol.Biol.(植物分子生物學(xué))18 675-689， 1992)，pEMUCLast 等，Theor.Appl.Genet.(理論和應(yīng)用遺傳學(xué))81 581-588，1991)， MAS (Velten 等，EmboJ.3: 2723-2730, 1984),小麥組蛋白(Lepetit 等，Mol.Gen.Genet. (分子和普通遺傳學(xué))231 276-285，1992)，和 Atanassova 等，Plant Journal (植物雜 志)2: 291-300，1992)，甘藍(lán)型油菜ALS3 (國(guó)際
發(fā)明者信占國(guó), 約翰·布朗斯, 陸朝福 申請(qǐng)人:華盛頓州立大學(xué)