專利名稱：使植物的油脂增產的基因及其利用方法
使植物的油脂增產的基因及其利用方法
背景技術：
所謂生物量(biomass)，一般是指在每一定面積生息或存在的生物的總量，特別 在以植物為對象的情況下，意味著每單位面積的干重。生物量的單位以質量或能量來數(shù) 值化。所謂生物量的表達與“生物體量”、“生物量”是同義語，在植物生物量的情況 下還有時使用“現(xiàn)存量(Standing crop)”的用語。植物生物量是使用太陽能固定大氣中 的二氧化碳而生成的，因而可以作為所謂碳中和的能量而被捕獲。因此，增加植物的生 物量具有保全地球環(huán)境、防止地球溫暖化、降低溫室效應氣體排放的效果。因此，使植 物生物量增產的技術在產業(yè)上很重要性另一方面，植物是以獲得其一部分組織本身(種子、根、葉莖等)為目的栽培 的，或者是以生產油脂等各種物質為目的栽培的。例如，作為由植物產生的油脂，大豆 油、胡麻油、橄欖油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、紅花油、棕櫚油 和菜籽油等自古以來已經為人們所知，在家庭用途和/或工業(yè)用途中被廣泛利用。另 外，由植物產生的油脂也可以作為生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用，作為石油 替代能源應用性正在擴大。在這樣的現(xiàn)狀下，為了使用植物在工業(yè)上成功地進行油脂生產，需要提高每單 位耕地面積的生產性。這里假定每單位耕地面積的栽培個體數(shù)一定，則可判定需要提高 每個個體的油脂生產量。在從由植物體采摘的種子中回收油脂的情況下，通過提高每個 個體的種子產量、和提高種子中的油脂含量等技術，可期待能夠實現(xiàn)提高每個個體的油
脂生產量。增加植物種子的油脂生產量的技術大致分為通過改良栽培法的技術、油脂增產 品種的開發(fā)。油脂增產品種的開發(fā)方法大致分為以雜交技術為核心的現(xiàn)有育種法和利用 基因重組的分子育種法。作為利用基因重組的油脂增產技術，已知A)改變作為植物油 脂的主成分的種子三酰甘油(TAG)的合成體系的技術、和B)對調控植物的形態(tài)形成和/ 或代謝和與它們相關的基因的表達的各種調控基因進行改變的技術。對于上述A)的方法，作為增加以通過光合成生產的糖為原料合成的TAG的合 成量的方法，可以考慮(1)提高從作為TAG的構成成分的脂肪酸、或甘油的糖的合成活 性的方法、(2)強化由甘油和脂肪酸合成TAG的反應的方法。對于這些方法，作為使用 基因工程學方法的技術，報告了以下技術。作為(1)的例子，可列舉通過使擬南芥的細 胞質型乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)在油菜籽的質粒中過量表達，從而將種子的油脂含量 提高5%的報告(非專利文獻1)。另外，作為(2)的例子，可列舉涉及通過在二酰甘油 的位轉移?；腄GAT ( 二酰甘油乙酰轉移酶)的過量表達來使油脂增產的技術的報 告(非專利文獻2)。在非專利文獻2的方法中，還報告了有時油脂含量和種子重量隨著 DGAT的表達量增加而增加，每個個體的種子數(shù)增加。應用了該方法的擬南芥的種子油 脂含量增加46%，每個個體的油脂量最高增加約125%。另一方面，作為上述B)的方法，可以考慮對與生物合成體系酶基因的表達調控 相關的轉錄因子基因的表達進行調控的方法。作為其例子可列舉專利文獻1。在該專利文獻1中，采用了制作大范圍地將轉錄因子過量表達或敲除而得的重組植物，然后篩選 出提高種子的油脂含量的基因的方法。專利文獻1記載了通過ERF亞族B-4轉錄因子基 因的過量表達而使種子的油脂含量增加了 23%。但是，在專利文獻1中，沒有記載每個 個體的油脂含量增減。另外，非專利文獻3記載了通過使作為具有AP2/EREB結構域的 轉錄因子的WRINKLED1過量表達，可以提高種子的油脂含量。然而，雖然以改良各種性狀為目的開發(fā)了上述的分子育種法，但伴隨植物的重 量增產、特定的組織增產、或目的物質的生產性提高的提高產量的技術尚未達到實用的 程度。認為其原因在于未發(fā)現(xiàn)真正優(yōu)異的基因；在試驗階段有效的重組新品種在實 用階段多樣的自然環(huán)境下不能發(fā)揮如期待的效果。另外，植物的重量增產、特定的組織 增產、或目的物質的生產性等量的性狀與從調控體系到代謝體系的各步驟中的大量基因 相關，發(fā)現(xiàn)、開發(fā)改善量的性狀的真正優(yōu)異的有用基因是困難的。為了解決這些問題， 發(fā)現(xiàn)效果非常高的新基因、開發(fā)雖然效果水平同等但能在實用環(huán)境條件下發(fā)揮效果的基 因成為課題。非專利文獻1 Plant Physiology (1997) Vol.11，pp.75-81非專利文獻2 : Plant Physiology (2001)，Vol.126, pp.861-874非專利文獻3 : Plant J. (2004) 40，575-585專利文獻1 : WOOl/3659
發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題因此，鑒于上述事實，本發(fā)明的目的是探索具有能夠提高每個個體的物質生產 性、特別是種子中的油脂量的新功能的基因，提供能夠提高植物體中的這些特性的技 術。用于解決問題的方法為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過表達由屬于 特定的轉錄因子家族的轉錄因子與將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽(以 下，也有時稱為阻遏物結構域)融合而成的嵌合蛋白質，可以改善各種量的性狀，特別 是可以提高每個個體的物質生產性、特別是油脂生產性，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明所涉及的植物體表達由轉錄因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白質，所 述轉錄因子屬于包括含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質的轉錄因子家族，所述功能 性肽是將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽。在本發(fā)明所涉及的植物體中， 優(yōu)選通過融合功能性肽，來抑制規(guī)定的轉錄因子的轉錄調控活性、特別是轉錄促進活 性。這里，作為融合上述功能性肽的轉錄因子，優(yōu)選為以下ω (C)的任一蛋白質。(a)含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號4所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了 1或多個氨基 酸而得的氨基酸序列、并具有轉錄促進活性的蛋白質，
(c)由與含有序列號3所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜 交的多核苷酸編碼、并具有轉錄促進活性的蛋白質。這里作為上述功能性肽，可列舉以下所示的式⑴ (8)。(1) Xl-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3(其中，式中的Xl表示0 10個氨基酸殘基，X2表示Asn或Glu，X3表示至 少6個氨基酸殘基。)(2) Y1 -Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3(其中，式中的Yl表示0 10個氨基酸殘基，Y2表示Phe或lie，Y3表示至
少6個氨基酸殘基。)(3) Z1 -Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3(其中，式中的 Zl 表示 Leu、Asp-Leu 或 Leu-Asp-Leu，Z2 表示 Glu、Gln 或 Asp, Z3表示0 10個氨基酸殘基。)(4) Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)
(5) α I-Leu- β l_Leu_ Y I-Leu(6) α I-Leu- β l_Leu_ Y 2-Leu(7) α I-Leu-β 2-Leu-Arg-Leu(8) α 2-Leu-β l-Leu-Arg-Leu(其中，式(5) (8)中，α 表示 Asp、Asn > Glu、Gin、Thr 或 Ser，α 2 表示 Asn> Glu、Gln> Thr Ser, β 1 表示 Asp、Gln> Asn> Arg> Glu、Thr> Ser His,
β 2 Asn> Arg> Thr> Ser His, Y 1 表示 Arg、Gln> Asn> Thr> Ser> His、Lys 或 Asp, Y 2 表示 Gin、Asn> Thr> Ser、His、Lys 或 Asp。)另外，使用本發(fā)明所涉及的植物體的物質制造方法，包括從上述本發(fā)明所涉及 的植物體中分離和回收生產性提高了的物質。這里，作為上述物質可列舉油脂。另一方面，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者們進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，在與 色素合成途徑相關的基因缺失的植株中，可以提高每個個體的物質生產性、特別是油脂 生產性，從而完成了本發(fā)明。所謂與色素合成途徑相關的基因，包括編碼涉及色素合 成途徑代謝反應的底物和/或產物的輸送的因子的基因、編碼催化色素合成途徑代謝反 應的酶的基因、和/或編碼催化形成色素合成途徑代謝反應的場所的反應的酶的基因。 還包括對編碼涉及色素合成途徑代謝反應的底物和/或產物的輸送的因子的基因、編 碼催化色素合成途徑代謝反應的酶的基因、和/或編碼催化形成色素合成途徑代謝反應 的場所的反應的酶的基因的表達進行調控的基因。S卩，本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法包括從由選自查耳酮合酶基因、 查耳酮異構酶基因和黃酮-3-水化酶基因中的至少1種基因的功能缺失的植物體采摘的種 子中回收油脂成分的工序。另外，本發(fā)明所涉及的油脂量提高了的植物體的篩選方法，包括以下工序從 作為評價種子內的油脂量的對象的植物體采摘種子的工序；以及觀察采摘的種子的種皮 色，將顏色更白的情況判定為種子內的油脂量高的工序。發(fā)明的效果
本發(fā)明所涉及的植物體是每個個體的物質生產性提高了的植物體。因此，通過 使用本發(fā)明所涉及的植物體，可以實現(xiàn)提高目的物質的生產性，從而可以以低成本制造 目的物質。另外，本發(fā)明的植物來源油脂的制造方法在特定的基因的功能缺失的植物體中 大幅提高每單位量的種子所含的油脂量，因此可以提高油脂生產性。而且，本發(fā)明的油脂量提高了的植物體的篩選方法非破壞地評價種子內的油脂 量，因此可以使用小量的種子迅速、且簡便地進行篩選。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權基礎的日本專利申請2008-054008號說明書 和/或附圖所記載的內容。


圖1是顯示導入了各改良型轉錄因子基因、改良型轉錄共激活因子基因或轉錄 因子基因的家系和野生株的種子油脂含量的測定結果的特性圖。圖2是顯示色素合成途徑缺失株和野生株的種子油脂含量的測定結果的特性 圖。圖3是顯示對于種子的種皮色使用圖像數(shù)據(jù)計算出R值、G值和B值的乘積值， 并與野生型的種子進行比較的結果的特性圖。
具體實施例方式以下，詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明所涉及的植物體表達屬于規(guī)定的轉錄調控因子家族的轉錄調控因子，特 別是屬于規(guī)定的轉錄因子家族的轉錄因子與將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能 性肽融合而成的嵌合蛋白質，與野生型植物體相比，每個個體的物質生產性提高了。 即，本發(fā)明所涉及的植物體是以所需的植物為對象，為了顯著提高該植物中的物質生產 性，而使轉錄因子作為與上述功能性肽的嵌合蛋白質表達的植物體。特別是在本發(fā)明所涉及的植物體中，優(yōu)選通過與上述功能性肽融合來抑制轉錄 因子的轉錄促進活性。換言之，本發(fā)明所涉及的植物體優(yōu)選具有如下特征表達轉錄因 子與上述功能性肽融合而成的嵌合蛋白質，結果由上述功能性肽所產生的轉錄抑制效果 作為優(yōu)勢的性狀而顯現(xiàn)出來。這里，所謂每個個體的物質生產性意味著由植物產生的各種物質的每單位體積 的含量。作為物質，不特別限定，既可以是植物體本來產生的物質，也可以是植物體本 來不產生但能夠通過基因操作技術等產生的物質。特別是如果每個組織的目的生產物的 含量高，則能夠降低精制成本和/或運輸成本，因此產業(yè)上的有用性高。特別是作為目 的生產物，可以是占植物的大部分重量的木質纖維素，也可以是作為種子油在產業(yè)上利 用的植物油。植物油可以是作為脂肪酸與醇的酯的單純脂質，也可以是含有磷、糖和/ 或氮等的復合脂質，還可以是脂肪酸本身。作為單純脂質的醇，可以是分子量高的高級 醇，也可以是丙三醇(甘油)等多元醇。作為單純脂質的脂肪酸，可以是飽和脂肪酸，也 可以是不飽和脂肪酸，另外，還可以是含有羥基和/或環(huán)氧基的特殊脂肪酸。作為甘油 與脂肪酸的酯的單純脂質，可以是單酰甘油，也可以是二酰甘油，還可以是三酰甘油。
在以下的說明中，作為提高其生產性的物質例示油脂進行說明，但本發(fā)明的技 術范圍不限于此。本發(fā)明對于作為植物所產生的物質的除油脂以外的物質也同樣適用。這里，作為植物體，不特別限定，可以以任何植物為對象。特別優(yōu)選以一直以 來用于油脂生產的植物為對象。作為對象植物，可列舉例如，大豆、胡麻、橄欖油、椰 子、稻、棉花、向日葵、玉米、甘蔗、麻瘋樹、椰子(”、煙草、紅花和油菜 籽等。另外，還可以以在植物的基因分析中作為模型生物被廣泛應用的、已確立了基因 表達分析方法的擬南芥為對象植物。另外，所謂轉錄因子的嵌合蛋白質所具有的轉錄抑制活性，是指識別該轉錄因 子所識別的Cis序列、和/或與該Cis序列類似的其他轉錄因子中的Cis序列，積極地抑制 下游基因表達的活性，也稱為轉錄抑制因子。對使轉錄因子的嵌合蛋白質具有的轉錄抑 制活性的方法，不特別限定，特別是構建添加了阻遏物結構域序列和/或SRDX序列的嵌 合蛋白質(融合蛋白質)的方法是最優(yōu)選的。在該方法中所謂阻遏物結構域序列，是指構成將任意轉錄因子轉換成轉錄抑 制因子的肽的氨基酸序列，是由本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)的各種序列。對于使用阻遏物結構域 序列的方法，例如，可以參考特開2001-269177公報、特開2001-269178公報、特開 2001-292776 公報、特開 2001-292777 公報、特開 2001-269176 公報、特開 2001-269179 公報、國際公開第 W003/055903 號小冊子、Ohta，M.，Matsui, K., Hiratsu, K., Shinshi, H.and Ohme-Takagi, M.，The Plant Cell, Vol.13, 1959—1968，August, 2001 和 Hiratsu，K., Ohta, M.，Matsui, K., Ohme-Takagi, M.，F(xiàn)EBS Letters 514 (2002) 351-354。阻遏物結構域序列是從II類ERF (Ethylene Responsive Element Binding Factor)蛋白質和/或植物的鋅指蛋白(Zinc Finger Protein、例如擬南芥SUPERMAN蛋白 質等)中截取的序列，具有極其單純的結構。作為以嵌合蛋白質的形式表達的轉錄調控因子，可以列舉擬南芥中由AGI編碼 的Atlg71030所特定的轉錄因子(以下，簡稱為“轉錄因子Atlg71030” )。已知轉錄因 子Atlg71030是myb家族的轉錄因子，與大麥來源的MybHv5GI 19055類似。轉錄因 子Atlg71030的氨基酸序列示于序列號4。編碼轉錄因子Atlg71030的基因的堿基序列示 于序列號3。另外，由At5g24520所特定轉錄共激活因子(transcription coactivator)(以下，簡 稱為“轉錄共激活因子At5g24520”)、轉錄抑制因子(transcriptionrepressor)和/或轉錄 共抑制因子(transcripition corepressor)作為轉錄調控因子已經為人們所知，對于這些轉錄 共激活因子和/或轉錄抑制因子也同樣可以構建添加了阻遏物結構域的嵌合蛋白質。此 外，AGI 編碼的 AtSgMMO 是作為 transparent testa glabra lprotein (TTGl)已知的轉錄共激 活因子。在其他植物來源的基因中，已知蘋果(Malusdomestica)來源的GenBank登錄號 AAF27919所編碼的蛋白質、碧冬茄(Petunia hybrida)來源的GenBank登錄號AAC18914 所編碼的蛋白質、棉花(Gossypiumhirsutum)來源的GenBank登錄號AAM95645所編碼 的蛋白質、紫蘇(Perillafrutescens)來源的GenBank登錄號BAB58883所編碼的蛋白質與 轉錄共激活因子At5g24520同源，可以期待與本說明書所記載的功能同等的功能。轉錄 共激活因子At5g24520的氨基酸序列示于序列號2。編碼轉錄共激活因子At5g24520的基 因的堿基序列示于序列號1。
另外，作為嵌合蛋白質的對象的轉錄共激活因子At5g24520和轉錄因子 Atlg71030分別不僅限于含有序列號2和4所示氨基酸序列的蛋白質，也可以是含有在該 氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了 1或幾個氨基酸序列的氨基酸序列、且具有轉 錄促進活性的蛋白質。這里，作為幾個氨基酸，例如，表示1 20個，優(yōu)選為1 10 個，更優(yōu)選為1 7個，進一步優(yōu)選為1個 5個，特別優(yōu)選為1個 3個。此外，氨 基酸的缺失、置換或添加可以通過利用該技術領域公知的方法改變編碼上述轉錄因子的 堿基序列來進行。為了在堿基序列中導入突變，可以通過Kunkel法或Gappedduplex法 (缺口雙鏈體法)等公知方法或依據(jù)這些公知方法的方法來進行，例如，使用利用了定點 誘變法的突變引入用試劑盒(例如Mutant-K和/或Mutant-G (均為商品名，TAKARA Bio社制))等，或使用LA PCR in vitroMutagenesis系列試劑盒(商品名，TAKARA Bio 社制)來引入突變。另外，作為突變引入方法，還可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、 5_溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、其他致癌性化合 物為代表的化學誘變劑的方法，還可以是利用以X射線、α射線、β射線、γ射線、 離子束為代表的放射線處理和/或紫外線處理的方法。另外，作為嵌合蛋白質的對象的轉錄共激活因子和轉錄因子不限于擬南芥中的 轉錄共激活因子At5g24520和轉錄因子Atlg71030，還包括除擬南芥以外的植物(例如上 述的植物)中具有相同功能的轉錄共激活因子和轉錄因子(以下，分別稱為同源轉錄共激 活因子和同源轉錄因子)。對于轉錄共激活因子At5g24520的同源轉錄共激活因子或轉錄 因子Atlg71030的同源轉錄因子，如果植物基因組信息已清楚，則可以基于轉錄共激活 因子At5g24520或轉錄因子Atlg71030的氨基酸序列或各基因的堿基序列從檢索對象植物 的基因組信息中進行檢索。這時，作為同源轉錄共激活因子和同源轉錄因子，檢索與轉 錄共激活因子At5g24520或轉錄因子Atlg71030的氨基酸序列具有例如為70%以上、優(yōu)選 為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、最優(yōu)選為95%以上的同源性的氨基酸序列。這里，同 源性的值意味著使用安裝了 blast算法的計算機程序和存儲了基因序列信息的數(shù)據(jù)庫、以 默認設定求得的值。另外，在植物基因組信息不清楚的情況下，可以從對象植物提取基因組或構建 對象植物的cDNA文庫，通過分離與轉錄共激活因子At5g24520或轉錄因子Atlg71030 的堿基序列的至少一部分在嚴格條件下雜交的基因組區(qū)域或cDNA來鑒定同源基因。這 里，所謂嚴格條件，是指形成所謂特異性的雜種、且不形成非特異性的雜種的條件。例 如，可列舉在45°C、6 XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)下進行雜交、然后在50 65°C、0.2 1XSSC、0.1% SDS下進行洗滌，或者作為這樣的條件，可列舉在65 70°C、IXSSC 下進行雜交、然后在65 70°C、0.3XSSC下進行洗滌。雜交可以按照J.Sambrook etal. Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.(分子克隆實驗指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory (1989)所記載的方法等現(xiàn)有公知的方法來進行。本發(fā)明所涉及的植物體通過表達如上所述的轉錄因子與功能性肽的嵌合蛋白質 來顯示油脂生產量顯著提高這樣的特征。另外，在表達上述轉錄共激活因子與功能性 肽的嵌合蛋白質時，也顯示油脂生產量顯著提高這樣的特征。特別是通過制成嵌合蛋白 質，可以使對象轉錄因子以抑制了轉錄促進活性的狀態(tài)表達，并且使其以識別與對象轉 錄因子所識別的Cis序列具有同源性的Cis序列的轉錄抑制活性表達，使對象轉錄因子和轉錄共激活因子所具有的與其他因子、核酸、脂質和/或糖質的親和特異性變化，從而顯 示油脂生產量顯著提高這樣的特征。這時，在上述植物體中，既可以改變內源性的轉錄 因子和/或轉錄共激活因子來生產其嵌合蛋白質，也可以導入編碼嵌合蛋白質的基因來 使該基因表達。作為一例，優(yōu)選以下方法將編碼由如上所述的轉錄因子和/或轉錄共激活因 子、與將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白質(融合蛋 白質)的基因導入對象植物中，使該嵌合蛋白質(融合蛋白質)在植物內表達的方式。作為本說明書中所記載的“轉錄促進活性被抑制的轉錄因子”，不特別限定， 是指該轉錄因子本來具有轉錄促進活性顯著降低了的轉錄因子。另外，所謂“將任意 轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽”，是指具有在與任意轉錄因子融合形成嵌合 蛋白質時，形成該轉錄因子本來具有的轉錄促進活性顯著降低了的轉錄因子的功能的肽 (也有時稱為轉錄抑制轉換肽)。作為這樣的“將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功 能性肽”，不特別限定，尤其優(yōu)選為含有作為阻遏物結構域序列和/或SRDX序列已知的 氨基酸序列的肽。對于轉錄抑制轉換肽，在特開2005-204657號公報中有詳細敘述，可 以使用該公報所公開的所有肽。轉錄抑制轉換肽可以列舉例如以下所示式(1) (8)的任一項所示的氨基酸序 列。(1) Xl-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3(其中，式中的Xl表示0 10個氨基酸殘基，X2表示Asn或Glu，X3表示至 少6個氨基酸殘基。)(2) Y1 -Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3(其中，式中的Yl表示0 10個氨基酸殘基，Y2表示Phe或lie，Y3表示至
少6個氨基酸殘基。)(3) Z1 -Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3(其中，式中的 Zl 表示 Leu、Asp-Leu 或 Leu-Asp-Leu，Z2 表示 Glu、Gln 或 Asp, Z3表示0 10個氨基酸殘基。)(4) Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)(5) α I-Leu- β l_Leu_ Y I-Leu(6) α I-Leu- β l_Leu_ Y 2-Leu(7) α I-Leu-β 2-Leu-Arg-Leu(8) α 2-Leu- β l-Leu-Arg-Leu(其中，式(5) (8)中，α 表示 Asp、Asn > Glu、Gin、Thr 或 Ser，α 2 表示 Asn> Glu、Gln> Thr Ser, β 1 表示 Asp、Gln> Asn> Arg> Glu、Thr> Ser His,
β 2 Asn> Arg> Thr> Ser His, Y 1 表示 Arg、Gln> Asn> Thr> Ser> His、Lys 或 Asp, Y 2 表示 Gin、Asn> Thr> Ser、His、Lys 或 Asp。)式(1)的轉錄抑制轉換肽在上述式(1)的轉錄抑制轉換肽中，上述Xl所示的氨基酸殘基的數(shù)只要在0 10個的范圍內即可。另外，對構成Xl所示的氨基酸殘基的具體氨基酸種類不特別限定，可以是任何氨基酸。從合成式(1)的轉錄抑制轉換肽時的容易程度出發(fā)，該Xl所示的氨 基酸殘基優(yōu)選盡量短。具體來說，Xl所示的氨基酸殘基優(yōu)選為5個以下。同樣地，在上述式(1)的轉錄抑制轉換肽中，上述X3所示的氨基酸殘基的數(shù)只 要是至少6個即可。另外，對構成X3所示的氨基酸殘基的具體氨基酸種類不特別限定， 可以是任何氨基酸。式(2)的轉錄抑制轉換肽在上述式(2)的轉錄抑制轉換肽中，與上述式(1)的轉錄抑制轉換肽的Xl同樣 地，上述Yi所示的氨基酸殘基的數(shù)只要在0 10個的范圍內即可。另外，對構成Yl 所示的氨基酸殘基的具體氨基酸種類不特別限定，可以是任何氨基酸。具體來說，Yi所 示的氨基酸殘基優(yōu)選為5個以下。同樣地，在上述式(2)的轉錄抑制轉換肽中，與上述式(1)的轉錄抑制轉換肽的 X3同樣地，上述Y3所示的氨基酸殘基的數(shù)只要是至少6個即可。另外，對構成Y3所 示的氨基酸殘基的具體氨基酸種類不特別限定，可以是任何氨基酸。式(3)的轉錄抑制轉換肽在上述式(3)的轉錄抑制轉換肽中，上述Zl所示的氨基酸殘基在1 3個的范 圍內、并含有Leu。在氨基酸為1個的情況下，是Leu，在氨基酸為2個的情況下，是 Asp-Leu,在氨基酸為3個的情況下，是Leu-Asp-Leu。另一方面，在上述式(3)的轉錄抑制轉換肽中上述Z3所示的氨基酸殘基的數(shù) 只要在0 10個的范圍內即可。另外，對構成Z3所示的氨基酸殘基的具體氨基酸種 類不特別限定，可以是任何氨基酸。具體來說，Z3所示的氨基酸殘基更優(yōu)選為5個以 下。作為Z3所示的氨基酸殘基的具體例，可列舉Gly、Gly-Phe-Phe> Gly-Phe_Ala、 Gly-Tyr-Tyr、Ala_Ala_Ala 等，當然不限于這些。另外，對該式(3)所示的轉錄抑制轉換肽整體的氨基酸殘基的數(shù)不特別限定， 從合成時容易程度出發(fā)，優(yōu)選為20個氨基酸以下。式(4)的轉錄抑制轉換肽上述式(4)的轉錄抑制轉換肽是含有6個氨基酸殘基的六聚體(6mer)。此外， 在上述式(4)的轉錄抑制轉換肽中Z4所示的氨基酸殘基是Glu的情況下的氨基酸序列， 相當于擬南芥SUPERMAN蛋白質(SUP蛋白質)的第196 201位氨基酸序列。以上說明的各種轉錄抑制轉換肽可以通過與上述轉錄因子和/或轉錄共激活因 子融合形成嵌合蛋白質(融合蛋白質)，從而改變該轉錄因子和/或轉錄共激活因子的特 性。具體來說，可以通過與上述轉錄因子和/或轉錄共激活因子融合形成嵌合蛋白質(融 合蛋白質)，從而將轉錄因子和/或轉錄共激活因子轉換成轉錄抑制因子和/或負的轉錄 共激活因子。另外，還可以將不是顯性的轉錄抑制因子變成顯性型轉錄抑制因子。另外，如果使用編碼上述轉錄抑制轉換肽的多核苷酸，獲得與編碼轉錄因子和/ 或轉錄共激活因子的基因的融合基因，則可以生產嵌合蛋白質(融合蛋白質)。具體來 說，通過將編碼上述轉錄抑制轉換肽的核苷酸(稱為轉錄抑制轉換多核苷酸)與編碼上 述轉錄因子和/或轉錄共激活因子的基因連接來構建融合基因，并導入植物細胞中。由 此可以生產嵌合蛋白質(融合蛋白質)。對上述轉錄抑制轉換多核苷酸的具體堿基序列 不特別限定，只要基于遺傳密碼，包含與上述轉錄抑制轉換肽的氨基酸序列對應的堿基序列即可。另外，根據(jù)需要，上述轉錄抑制轉換多核苷酸還可以含有作為用于與轉錄因 子基因連接的連接部位的堿基序列。而且，在上述轉錄抑制轉換多核苷酸的氨基酸閱讀 框、與轉錄因子和/或轉錄共激活因子的基因的閱讀框不一致這樣的情況下，還可以含 有用于使它們一致的添加的堿基序列。并且，還可以含有具有用于使轉錄因子和/或轉 錄共激活因子與轉錄抑制轉換肽之間連接的接頭(linker)功能的多肽、和/或像His和/ 或Myc、Flag等那樣用于賦予嵌合蛋白質(融合蛋白質)表位標記的多肽等的各種附加多 肽。另外，根據(jù)需要，上述嵌合蛋白質(融合蛋白質)還可以含有除多肽以外的結構、 例如糖鏈和/或類異戊二烯基等。對于制造植物體的方法，只要是包含在植物體內生產上述轉錄因子和/或轉錄 共激活因子與轉錄抑制轉換肽的嵌合蛋白質、提高油脂生產性的過程即可，不特別限 定，例如，可列舉包含表達載體構建工序、轉化工序、篩選工序等工序的制造法方法。 以下對各工序進行具體說明。表汰載體構津工序表達載體構建工序只要是構建含有編碼上述轉錄因子和/或轉錄共激活因子的 基因、轉錄抑制轉換多核苷酸和啟動子的重組表達載體的工序即可，不特別限定。作為 重組表達載體的母體的載體，可以使用現(xiàn)有公知的各種載體。例如，可以使用質粒、噬 菌體或粘粒等，可以根據(jù)所導入的植物細胞和/或導入方法不同來適當選擇。具體來 說，可列舉例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、 pBI系的載體等。特別是在向植物體的載體導入法是使用農桿菌的方法時，優(yōu)選使用 pBI系的雙元載體。作為pBI系的雙元載體，具體來說，可列舉例如，pBIG、pBIN19、 ρΒΙΙΟΙ、pBI121、pBI221 等。啟動子只要是能夠在植物體內表達基因的啟動子即可，不特別限定，優(yōu)選 使用公知的啟動子。作為所述啟動子，可列舉例如，花椰菜花葉病毒35S啟動子 (CaMV35S)、各種肌動蛋白基因啟動子、各種遍在蛋白基因啟動子、胭脂堿合成酶基因 的啟動子、煙草的PRla基因啟動子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基 基因啟動子、Napin(油菜儲藏蛋白)基因啟動子、油質蛋白(oleosin)基因啟動子等。其 中，更優(yōu)選使用花椰菜花葉病毒35S啟動子、肌動蛋白基因啟動子或遍在蛋白基因啟動 子。如果使用上述各啟動子，則可以在導入植物細胞內時可以使任意基因增強表達。啟 動子只要使得編碼轉錄因子和/或轉錄共激活因子的基因與轉錄抑制轉換多核苷酸連接 而成的融合基因能夠表達那樣地連接、并導入載體內即可，對作為重組表達載體的具體 結構不特別限定。此外，重組表達載體中除了啟動子和上述融合基因之外，還可以含有其他DNA 片段。對該其他DNA片段不特別限定，可列舉終止子、篩選標記、增強子、用于提高翻 譯效率的堿基序列等。另外，上述重組表達載體還可以具有T-DNA區(qū)。T-DNA區(qū)特別 是在使用農桿菌將上述重組表達載體導入植物體中的情況下可以提高基因導入的效率。轉錄終止子只要具有作為轉錄終止部位的功能即可，不特別限定，可以是公知 的終止子。例如，具體來說，優(yōu)選使用胭脂堿合成酶基因的轉錄終止區(qū)(Nos終止子)、 花椰菜花葉病毒35S的轉錄終止區(qū)(CaMV35S終止子)等。其中更優(yōu)選使用Nos終止 子。在上述重組載體中，可以通過將轉錄終止子配置在適當?shù)奈恢茫瑥亩趯胫参锛毎蠓乐共槐匾睾铣砷L轉錄物、強啟動子使質粒的拷貝數(shù)減少等現(xiàn)象發(fā)生。作為轉化體篩選標記，例如，可以使用抗藥性基因。作為所述抗藥性基因的具 體例，可列舉例如，針對潮霉素、博來霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素等的抗藥性 基因。由此，通過選擇在含有上述抗生素的培養(yǎng)基中生長的植物體，可以容易地篩選轉 化的植物體。作為用于提高翻譯效率的堿基序列，可列舉例如，煙草花葉病毒來源的omega 序列。通過使該omega序列配置在啟動子的非翻譯區(qū)(5’ UTR)，可以提高上述融合基 因的翻譯效率。這樣，根據(jù)其目標，上述重組表達載體可以含有各種DNA片段。對于重組表達載體的構建方法，不特別限定，只要在適當選擇的作為母體的載 體中，以規(guī)定的順序導入上述啟動子、編碼轉錄因子和/或轉錄共激活因子的基因、轉 錄抑制轉換多核苷酸、以及根據(jù)需要的上述其他DNA片段即可。例如，將編碼轉錄因子 的基因與轉錄抑制轉換多核苷酸連接來構建融合基因，接著將該融合基因與啟動子(根 據(jù)需要的轉錄終止子等)連接來構建表達盒(expression cassette)，將其導入載體即可。在嵌合基因(融合基因)的構建和表達盒的構建中，例如，可以通過預先使各 DNA片段的切割部位形成彼此互補的突出末端，然后用連接酶使其反應，從而規(guī)定該 DNA片段的順序。此外，在表達盒包含終止子的情況下，從上流開始依次為啟動子、上 述嵌合基因、終止子即可。另外，對于用于構建重組表達載體的試劑種類、即限制性酶 和/或連接酶等的種類不特別限定，適當選擇使用市售的試劑即可。另外，對上述重組表達載體的增殖方法(生產方法)也不特別限定，可以使用現(xiàn) 有公知的方法。一般以大腸桿菌為宿主使其在該大腸桿菌內增殖即可。這時，可以根據(jù) 載體的種類來選擇優(yōu)選的大腸桿菌的種類。轉化工序本發(fā)明中進行的轉化工序，是使用上述重組表達載體將上述融合基因導入植物 細胞以使其表達的工序。對使用重組表達載體導入植物細胞的方法(轉化方法)不特別 限定，可以根據(jù)植物細胞而使用適當?shù)默F(xiàn)有公知的方法。具體來說，例如，可以使用利 用農桿菌的方法和/或直接導入植物細胞的方法。作為利用農桿菌的方法，例如，可以 使用 Bechtold，E., Ellis, J.andPelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer byinfiltration of adult Arabidopsis plants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie，316, 1194-1199. 或Zyprian Ε, Kado Cl，Agrobacterium-mediated planttransformation by novel mini—T vectors in conj unction with a high-copy virregion helper plasmid.Plant Molecular Biology，1990, 15(2)，245-256.所記載的方法。作為將含有重組表達載體和對象基因的DNA直接導入植物細胞的方法，例如， 可以使用微注射法、電穿孔法、聚乙二醇法、基因槍法、原生質體融合法、磷酸鈣法等。另外，如果采用將DNA直接導入植物細胞的方法，則只要是含有對象基因表達 所需的轉錄單位、例如啟動子和/或轉錄終止子、以及對象基因的DNA就足夠了，載 體功能不是必須的。而且，即使是不具有轉錄單位的僅含有對象基因的蛋白質編碼區(qū)的 DNA也可以，只要是能夠整合到宿主的轉錄單位內表達對象基因即可。作為導入了上述含有重組表達載體和對象基因的DNA、和/或不含表達載體而含有對象基因DNA的DNA的植物細胞，可列舉例如，花、葉、根等植物器官中各組織 的細胞、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細胞等。這里，在本發(fā)明所述的植物體的生產方法中，上 述重組表達載體既可以根據(jù)要進行生產的植物體的種類來構建適當載體，也可以預先構 建通用的重組表達載體，將其導入植物細胞。即，在本發(fā)明所涉及的植物體的制造方法 中，既可以包含上述使用重組表達載體的轉化用DNA構建工序，也可以不包含。其他工序、其他方法在本發(fā)明所涉及的植物體的生產方法中，只要包含上述轉化工序即可，還可以 包含上述使用重組表達載體的轉化用DNA構建工序，但還可以另外包含其他工序。具體 來說，可列舉從轉化后的植物體中篩選適當?shù)霓D化體的篩選工序等。對篩選方法不特別限定，例如，可以以潮霉素抗性等抗藥性為基準進行篩選， 也可以在培育出轉化體之后，根據(jù)植物體本身或任意器官和/或組織所含的油脂含量進 行篩選。例如，作為根據(jù)油脂含量進行篩選的例子，可列舉由轉化體的種子按照常規(guī)方 法來定量油脂成分、并與未轉化的植物體的種子所含的油脂含量進行比較的方法(參考 后述的實施例)。在本發(fā)明所涉及的植物體的制造方法中，由于將上述融合基因導入植物體，因 而可以由該植物體通過有性繁殖或無性繁殖來獲得油脂含量顯著提高的后代。另外，可 以由該植物體和/或其后代獲得植物細胞和/或種子、果實、植株、愈傷組織、塊莖、扦 插枝、塊等繁殖材料，以他們?yōu)榛A來大量生產該植物體。因此，在本發(fā)明所涉及的植 物體的制造方法中，可以包含繁殖篩選后的植物體的繁殖工序(大量生產工序)。此外，所謂本發(fā)明中的植物體，包含長成的植物個體、植物細胞、植物組織、 愈傷組織、種子的至少任一者。即，在本發(fā)明中，只要是最終能生長成植物個體的狀態(tài) 即全部可看作是植物體。另外，上述植物細胞包括各種形態(tài)的植物細胞。作為所述植物 細胞，包含例如，懸浮培養(yǎng)細胞、原生質體、葉的切片等。通過使這些植物細胞增殖、 分化可以獲得植物體。此外，由植物細胞再生植物體可以根據(jù)植物細胞的種類使用現(xiàn)有 公知的方法來進行。因此，在本發(fā)明所涉及的植物體的制造方法中，還可以包括由植物 細胞等再生植物體的再生工序。另外，本發(fā)明所涉及的植物體的生產方法不限于利用重組表達載體進行轉化的 方法，還可以使用其他方法。具體來說，例如，可以將上述嵌合蛋白質(融合蛋白質)本 身給予植物體。這時，為了能夠在最終利用的植物體的部位提高油脂含量，只要對幼年 期的植物體給予嵌合蛋白質(融合蛋白質)即可。另外對嵌合蛋白質(融合蛋白質)的 給予方法也不特別限定，使用公知的各種方法即可。正如以上說明的那樣，根據(jù)本發(fā)明，可以通過使屬于規(guī)定的轉錄因子家族的轉 錄因子與上述功能性肽的嵌合蛋白質表達，來提供與野生型植物體相比每個個體的物質 生產性提高了的植物體。另外，可以通過使規(guī)定的轉錄共激活因子與上述功能性肽的嵌 合蛋白質表達，來提供與野生型植物體相比每個個體的物質生產性提高了的植物體。如 果在植物體中表達上述嵌合蛋白質，則有時對象轉錄因子的轉錄促進活性被抑制，或有 時針對對象轉錄因子所識別的CiS序列的同源序列顯示轉錄抑制效果。而且，嵌合蛋白質 有時針對與對象轉錄因子和/或轉錄共激活因子具有親和性的其他因子、DNA、RNA、 脂質或糖質發(fā)揮作用以使該親和特異性發(fā)生變化，或有時針對與對象轉錄因子無親和性的物質發(fā)揮作用以使其親和性提高。在本發(fā)明所涉及的植物體中，雖然嵌合蛋白質的對 象轉錄因子、識別與該因子所識別的CiS序列具有同源性的CiS序列的轉錄因子、與嵌合蛋 白質的對象轉錄因子具有同源性的轉錄因子、與嵌合蛋白質的對象轉錄因子具有親和性 的其他因子等也同樣地在植物體內表達，但通過上述嵌合蛋白質的作用效果，能夠顯性 負性地抑制調控對象的基因表達。由此，認為在本發(fā)明所涉及的植物體中，與油脂生產 相關的基因簇和/或與生產出的油脂的分解相關的基因簇的表達水平發(fā)生變化，其結果 是油脂含量顯著提高。這里所謂油脂含量顯著提高，意味著以下任一種情況與野生型相比每一粒種 子的質量無變化但油脂量提高的情況；與野生型相比每一粒種子的質量顯著變大、且油 脂量提高的情況；與野性型相比種子中的油脂含量提高的情況。在任一種情況下，每一 個植物個體所生產的油脂量都提高了。本發(fā)明所涉及的植物體可以在植物來源的油性的 制造方法中利用。例如，可以使本發(fā)明所涉及的植物體生長并采摘種子，從采摘的種子 中回收油脂成分來制造油脂。特別是利用了本發(fā)明所涉及的植物體的油脂制造方法由于植物的每一個個體中 油脂含量高，因而可以說是生產性優(yōu)異的方法。換言之，如果假定每單位耕地面積的栽 培個體數(shù)一定，則通過利用本發(fā)明所涉及的植物體，可以大幅提高由每單位耕地面積制 造的油脂量。因此，通過利用本發(fā)明所涉及的植物體，可以大幅削減油脂生產所需的制 造成本。而且，利用了本發(fā)明所涉及的植物體的油脂制造方法由于每單位重量的種子中 的油脂含量高，因而可以說是生產性優(yōu)異的方法。此外，在利用了本發(fā)明所涉及的植物體的油脂制造方法中，作為制造對象的油 脂，不特別限定，可例示例如，大豆油、胡麻油、橄欖油、椰子油、米糠油、棉籽油、 向日葵油、玉米油、紅花油和菜籽油等植物來源的油脂。另外，制造的油脂可以在家庭 用途和/或工業(yè)用途中廣泛利用，還可以作為生物柴油燃料的原料使用。即，通過利用 本發(fā)明所涉及的植物體，可以低成本地制造上述的家庭用途或工業(yè)用途的油脂、和/或 生物柴油燃料等。棺物來源油脂的制造方法另外，在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了在由顯示特定表型的植物體采摘的種子中油脂含量 顯著提高這樣的新見解。具體來說，由參考文獻(Plant J.1995NOV; 8(5) 659-71.)所公 開的4種色素合成途徑缺失株(tt4、tt5、tt6和Δ CHS)采摘的種子與野生型相比種子中的 油脂含量顯著提高。即，本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法，包括從由選自查耳 酮合酶基因、查耳酮異構酶基因和黃酮-3-水化酶基因中的至少1種基因的功能缺失的植 物體采摘的種子中回收油脂成分的工序。此外，上述參考文獻所公開的tt4株和Δ CHS是 查耳酮合酶基因缺失的植株，tt5株是查耳酮異構酶基因缺失的植株，tt6株是黃酮-3-水 化酶基因缺失的植株。擬南芥中的查耳酮合酶基因的堿基序列示于序列號5，由該基因所編碼的查耳酮 合酶的氨基酸序列示于序列號6。擬南芥中的查耳酮異構酶基因的堿基序列示于序列號 7,由該基因所編碼的查耳酮異構酶的氨基酸序列示于序列號8。擬南芥中的黃酮-3-水 化酶基因的堿基序列示于序列號9，由該基因所編碼的黃酮-3-水化酶的氨基酸序列示于序列號10。但是，在本發(fā)明中，查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因和黃酮-3-水化酶基 因不限于上述的具體序列。即，查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因和黃酮-3-水化酶 基因還可以是編碼包含在上述的具體氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了 1或幾個 氨基酸序列的氨基酸序列、且具有查耳酮合酶活性、查耳酮異構酶活性和黃酮-3-水化 酶活性的蛋白質的基因。這里，作為幾個氨基酸，例如為1 20個，優(yōu)選為1 10個， 更優(yōu)選為1 7個，進一步優(yōu)選為1個 5個，特別優(yōu)選為1個 3個。此外，氨基酸 的缺失、置換或添加可以通過利用該技術領域公知的方式改變編碼上述轉錄因子的堿基 序列來進行。為了在堿基序列中引入突變，可以通過Kunkel法或Gapped duplex法(缺口 雙鏈體法)等公知方法或依據(jù)這些公知方法的方法來進行，例如，使用利用了定點誘變 法的突變弓I入用試劑盒(例如Mutant-K和/或Mutant-G (均為商品名，TAKARA Bio社 制))等，或使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(商品名，TAKARA Bio社制) 引入突變。另外，作為突變引入方法，還可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧 啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、其他致癌性化合物為代表 的化學誘變劑的方法，還可以是利用以X射線、α射線、β射線、γ射線、離子束為 代表的放射線處理和/或紫外線處理的方法。而且，在本發(fā)明中，查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因和黃酮-3-水化酶基 因包括在除擬南芥以外的植物(例如上述的植物)中具有相同功能的基因(以下，稱為 同源基因)。對于查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因或黃酮-3-水化酶基因的同源基 因，如果植物基因組信息已清楚，則可以基于查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因或黃 酮-3-水化酶基因的堿基序列或由該基因所編碼的氨基酸序列從檢索對象的植物基因組 信息中進行檢索。這時，作為同源轉錄因子，檢索與上述的具體氨基酸序列具有例如 70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、最優(yōu)選為95%以上的同源性的氨基酸 序列。這里，同源性的值意味著使用安裝了 blast算法的計算機程序和存儲了基因序列信 息的數(shù)據(jù)庫、以默認設定求得的值。另外，在植物基因組信息不清楚的情況下，可以從對象植物提取基因組或構建 對象植物的CDNA文庫，通過分離與查耳酮合酶基因、查耳酮異構酶基因或黃酮-3-水 化酶基因的堿基序列的至少一部分在嚴格條件下雜交的基因組區(qū)域或cDNA來鑒定同源 基因。這里，所謂嚴格條件，是指形成所謂特異性的雜種、且不形成非特異性的雜種的 條件。例如，可列舉在45°C、6XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)下進行雜交、然后在50 65°C、0.2 1XSSC、0.1% SDS下進行洗滌，或者作為這樣的條件，可列舉在65 70°C、IXSSC下進行雜交、然后在65 70°C、0.3XSSC下進行洗滌。雜交可以按照 J.Sambrook et al.Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(分子克隆實驗指南第二 版)，Cold Spring Harbor Laboratory (1989)所記載的方法等現(xiàn)有公知的方法來進行。換言之，本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法不限于使用擬南芥來源的種 子的體系，可以以所有植物為對象來應用。作為能夠應用本發(fā)明所涉及的植物來源油脂 的制造方法的植物，可列舉例如，雙子葉植物、單子葉植物，例如，屬于十字花科、禾 本科、茄科、豆科、楊柳科等的植物(參考下述)，但并不限于這些植物。十字花禾斗擬南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa、Brassicanapus)、卷 菜(Brassica oleracea var.capitata)、油菜軒(Brassica rapa> Brassica napus)、油菜 花(Brassica rapa、Brassica napus)、大白菜(Brassicarapa var.pekinensis)、青菜(Brassica rapa var.chinensis)、蕪青(Brassicarapa var.rapa)、里予澤菜(Brassica rapa var.hakabura)、日 本蕪青(Brassicarapa var.lancinifolia)、小豐公菜(Brassica rapa var.peraviridis)、小白菜(八 夕子 3 彳，Brassica rapa var.chinensis)、蘿卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。爺禾斗煙草(Nicotianatabacum)、爺子(Solanummelongena)、馬鈴薯(Solaneum tuberosum)、番爺(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)、矮牽牛 (Petunia)等。豆科大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蠶豆(Vicia faba)、多花紫 藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脈卞艮(Lotus corniculatus var. japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis) > 金合歡(Acacia)等。菊禾斗菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。棕櫚科油棕(Elaeisguineensis、Elaeis oleifera)、椰子(Cocos nucifera)、海棗 (Phoenix dactylifera)、巴西棕櫚(Copernicia)漆樹科野漆樹(Rhussuccedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆樹 (Toxicodendron vernicifluum) > 芒果(Mangifera indica)、阿月渾子(Pistacia vera)葫聲禾斗南瓜(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、黃 瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫聲(Lagenaria siceraria var. gourda)薔薇科扁桃(Amygdaluscommunis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、櫻 (Pranus)、蘋果(Malus pumila var.domestica)等。石竹科康乃馨(Dianthuscaryophyllus)等。楊柳禾斗楊(Populus trichocarpa、Populus nigra> Populus tremula)禾本科玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥 (Triticum aestivum)、毛竹屬(Phyllostachys)、甘鹿(Saccharamofficinaram)等。百合科郁金香屬(Tulipa) >百合屬(Lilium)等。另外，所謂使基因功能缺失，包括使該基因從基因組中缺失、抑制該基因的表 達(轉錄水平和翻譯水平)、以及使由該基因所編碼的蛋白質的活性降低或缺失的含義。更詳細地說，作為使基因缺失的方法，不特別限定，可列舉使用同源重組的方 法和/或使用轉座子的方法。另外，在使該基因缺失時，既可以使該基因的全長缺失， 也可以使其部分缺失。另外，作為抑制基因表達的方法，不特別限定，可列舉使調控該基因表達的啟 動子缺失的方法、將調控該基因表達的啟動子替換成表達誘導型啟動子的方法、在調控 該基因表達的啟動子中引入突變的方法、利用RNA干涉來分解該基因的轉錄產物的方 法、以及利用反義RNA來抑制該基因的翻譯的方法。另外，作為降低該基因所編碼的蛋白質的活性的方法，可列舉使具有與該蛋白 質特異性地結合來抑制該蛋白質的活性的功能的物質發(fā)揮作用的方法。作為該物質，可 列舉能夠抑制該蛋白質的功能的抗體和/或抑制物質。
在本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法中，對從種子中回收油脂的方法不 特別限定，可以使用壓榨法、提取法和擠出法等任何方法。例如，可以通過使用索氏抽 提器的醚提取法，從由植物采摘的種子中回收油脂成分。根據(jù)本發(fā)明所涉及的植物來源 油脂的制造方法，即使能夠從每一個植物個體采摘的種子量相等，也由于使用每一粒種 子的油脂含量高的植物體，因此可以說是生產性優(yōu)異的方法。換言之，如果假定每單位 耕地面積的栽培個體數(shù)一定，則通過本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法，由每單 位耕地面積制造的油脂量大幅提高，從而可以大幅削減油脂生產所需的制造成本。此外，在本發(fā)明所涉及的植物來源油脂的制造方法中，作為制造對象的油脂， 不特別限定，可例示例如，大豆油、胡麻油、橄欖油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日 葵油、玉米油、紅花油和菜籽油等植物來源的油脂。另外，制造的油脂可以在家庭用 途和/或工業(yè)用途中廣泛利用，還可以作為生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用。 即，通過利用本發(fā)明所涉及的植物體，可以低成本地制造上述的家庭用途或工業(yè)用途的 油脂、和/或生物柴油燃料和/或生物塑料等。油脂量提高了的棺物體的篩詵方法如上所述，在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了由色素合成途徑缺失株(參考文獻Plant J.1995Nov ； 8(5) 659-71.)采摘的種子與野生型相比油脂含量顯著提高這樣的新見解。 色素合成途徑缺失株是與色素合成體系相關的基因的功能缺失了的突變株，與野生株相 比顯示種皮色為淡色(與野生型相比顏色更白)這樣的表型。上述參考文獻所公開的tt4 株和ACHS是查耳酮合酶基因缺失的植株，tt5株是查耳酮異構酶基因缺失的植株，tt6 株是黃酮-3-水化酶基因缺失的植株。在這些基因缺失的突變株中，由于色素的合成不 全而種皮色變得更白。因此，如果從篩選對象植物采摘種子，并確認采摘的種子的種皮 色，則在可以判斷該植物中的色素合成途徑的色素合成能力的同時，可以高精度地推斷 采摘的種子所含的種子含量。S卩，例如，在存在同種所包含的各種植物體時，可以觀察從這些植物體采摘的 種子的種皮色，將顏色更白的作為油脂生產量高的品種篩選出來。這里，所謂篩選對象 植物體，既可以是進行了任何誘變劑處理的植物體，也可以是通過現(xiàn)有公知的育種法等 制作出的植物品種。這里，作為誘變劑處理，不特別限定，可以使用用于廣泛誘發(fā)突變的化學誘變 劑和/或物理誘變劑進行處理。作為化學誘變劑，可以使用例如甲磺酸乙酯(EMS)、乙 基亞硝基脲(ENS)、2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶(5-BU)、烷基化劑等。另外，作為物理 誘變劑，可以使用放射線、紫外線等。使用這些誘變劑誘發(fā)突變可以按照公知的方法來 進行。根據(jù)本發(fā)明所涉及的篩選方法，無需破壞從植物采摘的種子，可以通過目視觀 察種皮色這種非常簡便且迅速的判定法來判定種子所含的油脂量。另外，在本發(fā)明所涉及的篩選方法中，還可以根據(jù)圖像數(shù)據(jù)來判斷從植物采摘 的種子的種皮色，從而定量地測定種皮色。具體來說，將評價對象的種子的圖像轉換成 數(shù)字數(shù)據(jù)，測定圖像數(shù)據(jù)中的種子區(qū)域的R值、G值和B值(RGB值)。種子區(qū)域的R 值、G值和B值的測定只要使用圖像處理軟件來進行即可，可以使用任何軟件。接著， 將測定的R值、G值和B值與野生型的種子中的R值、G值和B值進行比較。作為一例，計算出測定的R值、G值和B值的乘積值，與野生型的種子中的R值、G值和B值 的乘積值進行比較。例如，如果測定的R值、G值和B值的乘積值與野生型的種子中的 R值、G值和B值的乘積值相比顯著上升，則可以判斷測定對象的種子的種皮色更接近白 色。特別是在測定的R值、G值和B值的乘積值顯示相對于野生型的種子中的R值、G 值和B值的乘積值為2.88倍以上的值時，可以判斷為是更白色化(淡色化)的種子。如上，通過將從植物采摘的種子的種皮色作為圖像數(shù)據(jù)進行觀察這種方式，也 無需破壞種子，可以通過非常簡便且迅速的判定法來判定種子所含的油脂量。此外，在 由圖像數(shù)據(jù)觀察種子的種皮色時，不僅可以計算R值、G值和B值的乘積值，還可以計 算R值、G值和B值的合計值等。實施例以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術的范圍不限于這些實 施例。[實施例1]在本實施例中，對于擬南芥中的轉錄共激活因子At5g24520和轉錄因子 Atlg71030,分別在植物體中表達添加了阻遏物結構域序列的嵌合蛋白質(融合蛋白 質)，測定從該植物體采摘的種子中的油脂含量。另外，對于用于比較的轉錄因子 Atlg56650,同樣地在植物體中表達嵌合蛋白質(融合蛋白質)，測定種子中的油脂含量。轉錄因子基因的擴增使用以下所記載的引物，通過PCR從擬南芥的CDNA文庫中擴增出Atlg71030 的除終止密碼子以外的編碼區(qū)的DNA片段和包含終止密碼子的編碼區(qū)的DNA片段、 At5g24520的除終止密碼子以外的編碼區(qū)的DNA片段和Atlg56650的除終止密碼子以外 的編碼區(qū)的DNA。PCR條件是將94°C 1分鐘、47°C 2分鐘、延伸反應74°C 1分鐘進行 25循環(huán)。PCR結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離、回收擴增出的DNA片段?！?Atlg71030擴增用正向引物1gATGAACAAAACCCGCCTTCGTGCTCTCTC (序列號 11)· Atlg71030擴增用反向引物1TCGGAATAGAAGAAGCGTTTCTTGACCTGT (序列號 12)· Atlg71030擴增用正向引物2gATGAACAAAACCCGCCTTCGTGCTCTCTC (序列號 13)· Atlg71030擴增用反向引物2(序列號14)TCATCGGAATAGAAGAAGCGTTTCTTGACC· Atlg56650擴增用正向引物GATGGAGGGTTCGTCC AAAGGGC (序列號 15)· Atlg56650擴增用反向引物ATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCG (序列號 16)· At5g24520擴增用正向引物gATGGATAATTCAGCTCCAGATTCGTTATC (序列號 17)· At5g24520擴增用反向引物
AACTCTAAGGAGCTGCATTTTGTTAGCAAA (序列號 18)融合基因的制作為了在由上述DNA片段所編碼的轉錄因子基因的3’末端添加阻遏物結構 域序列，使用在CaMV35S啟動子的下游具有SmaI位點和阻遏物結構域(氨基酸序 列GLDLDLELRLGFA)序列的載體p35SSXG。為了連接轉錄因子基因序列和阻遏 物結構域序列，將本載體用SmaI切割，插入編碼上述的轉錄因子的PCR擴增片段， 制作 p35SSXG(Atlg56650)和 p35SSXG (At5g24520)、p35SSXG (Atlg71030)。此外 p35SSXG (Atlg71030)插入了使用Atlg71030擴增用正向引物1和Atlg71030擴增用反 向引物1獲得的PCR擴增片段。另外，為了在不添加阻遏物結構域的狀態(tài)下表達使用 Atlg71030擴增用正向引物2和Atlg71030擴增用反向引物2獲得的PCR擴增片段，將 其插入在CaMV35S啟動子的下游具有SmaI位點序列的載體的p35SOXG的SmaI切割部 位，制作 p35SOXG(Atlg71030)。^ ■作為用于利用農桿菌在植物中導入基因的雙元載體，使用pBCKH。本載體 是在 pBIG (Hygr) (Nucleic Acids Res. 18, 203 (1990))的 HindIII 位點插 Λ Gateway 載體 轉換系統(tǒng)(Invitrogen)的盒而成的載體。為了在該載體中插入改良型轉錄因子基因， 將本載體與 P35SSXG (Atlg5665O)、P35SSXG (At5g24520)、P35SSXG (Atlg7IO3O)或 p35SOXG (Atlg71030)混合，使用 GATEWAY LR clonase (Invitrogen)進行重組反應。 其結果是制成了 pBCKH_p35SSXG(Atlg56650)、pBCKH_p35SSXG (At5g24520)、 pBCKH-p35SSXG (Atlg71030)禾Π pBCKH-p35SOXG (Atlg71030)。改良型轉錄因子基因表達載體向植物的導入用于導入改良型轉錄因子的植物使用擬南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia)。 基因導人法按/照 Transformation of Arabidopsis thaliana byvacuum infiltration 來進 亍。 但 是，感染時不進行減壓處理，僅將其浸入農桿菌菌液中。具體來說，將改良型轉 錄因子表達載體 pBCKH_p35SSXG(Atlg56650)、pBCKH_p35SSXG (At5g24520)、 pBCKH-p35SSXG (Atlg71030)和 pBCKH_p35SOXG (Atlg71030)用電穿孔法導入農桿菌 Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58ClRifr)pMP90 (Gmr) (koncz and Schell 1986) 菌株中。將1升的進行了導入的菌在含有抗生素(卡那霉素(Km)50yg/ml、慶大霉素 (Gm) 25 μ g/ml、利福平(Rif) 50 μ g/ml)的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為1。接著，從 培養(yǎng)液回收菌體，懸浮在1升的感染用培養(yǎng)基(Infiltrationmedium，每1升含有2.2g MS salt、IX 維生素 B5，50g 蔗糖，0.5gMES，0.044 μ M 芐氨基嘌呤，400 μ 1 Silwet，pH 為 5.7)中。將培育了 14天的擬南芥在該溶液中浸漬1分鐘使其感染，然后再繼續(xù)栽培使 其結果。將采摘的種子(Tl種子)在50% bleach、0.02% Triton X-100溶液中滅菌7分 鐘，然后用滅菌水沖洗3次，接種到滅菌的潮霉素選擇培養(yǎng)基(4.3g/l MS salts、0.5%蔴 糖、0.5g/lMES、pH5.7、0.8%瓊脂、30mg/l潮霉素、250mg/l萬古霉素)上。從在上 述潮霉素平板上培育的轉化植物體(Tl植物)中對各改良型轉錄基因分別篩選出10個家 系，移植到裝有蛭石混合土的直徑50mm的盆中。將其在22°C、16小時光周期8小時暗 周期、光強度約60 80 μ E/cm2的條件下栽培而獲得種子(T2種子)。與野生株的表皮色為深棕色相對，所得的T2種子的表皮色無論哪個家系均為淡棕色或黃色。餼素合成涂徑缺失株另外，在本實施例中，還測定了從色素合成途徑缺失株采摘的種子所含的油脂 含量。在本實施例中，具體來說，對于色素合成途徑缺失株tt4(NASC保藏號N85)(參 考文獻PlantJ., 8，659-671，1995)、tt5 (NASC 保藏號 N86)、tt6 (NASC 保藏號 N87) (參考文獻Plant Physiol.，111，339-345，1996)、Δ CHS (NASC 保藏號 N520583))， 從 NASC (The NottinghamArabidopsis Stock Centre)獲得。tt4、tt5、tt6 由 Arabidopsis thaliana, Ler 株制備，Δ CHS 由 Arabidopsis thaliana, Col-O 株制備。將它們用 5O % bleach、0.02% Triton X-100溶液滅菌7分鐘，然后用滅菌水沖洗3次，接種在培養(yǎng)基 (4.3g/l MS salts, 0.5%蔗糖，0.5g/l MES, ρΗ 5.7, 0.8%瓊脂)上。將在上述平板上培 育的植物體移植到裝有蛭石混合土的直徑50mm的盆中。將其在22°C、16小時光周期8 小時暗周期、光強度約50 60μΕ/αη2( 4，tt5，tt6，WT (Ler))、或光強度約40 μ E/ cm2(ACHS、WT(Col-o))的條件下栽培，從而獲得種子。與野生株的表皮色為深棕色 相對，所得種子的表皮色無論哪個家系均為淡棕色或黃色。導入了改良型轉錄因子或轉錄因子的T2種子的分析 對導入了 2種改良型轉錄因子基因和改良型轉錄共激活因子基因的任一種的Τ2 種子(Atlg56650-SRDX、At5g24520_SRDX、Atlg71030_SRDX)和導入了轉錄因子的 T2種子(Atlg71030)以及野生株(Col-0、Ler)進行油脂含量分析。油脂的定量分析使 用 MARAN-23 (Resonancelnsturaments Ltd.，UK) H-NMR 和分析軟件 RI-NMR 2.0 版，對 2 IOmg的擬南芥種子進行測定。使用橄欖油作為油脂的標準物質來制作標準曲線，求 出種子中的油脂含量(重量％)。求出導入了各改良型轉錄因子基因、改良型轉錄共激活因子或轉錄因子基因的 家系和野生株的種子油脂含量的平均值(η = 3 10)。其結果是，在設Col-O的油脂含量 平均值為1時，各家系的油脂含量增加率如下Τ2種子(Atlg56650-SRDX)為30.2%、 T2 種子(At5g24520-SRDX)為 12.3%、T2 種子(Atlg71030_SRDX)為 12.2%、T2 種子 (Atlg71030)為 2.3% (圖 1)。代素合成涂徑缺失株種子的分析對4種色素合成途徑缺失株種子(tt4、tt5、tt6、Δ CHS)和野生株(Col_0、Ler) 進行油脂含量分析。油脂的定量分析使用MARAN-23 (Resonancelnsturaments Ltd.，UK) H-NMR和分析軟件RI-NMR 2.0版，對2 IOmg的擬南芥種子進行測定。使用橄欖油 作為油脂的標準物質來制作標準曲線，求出種子中的油脂含量(重量％)。求出色素合成途徑缺失株和野生株的種子油脂含量的平均值(η = 3 10)。 Δ CHS的油脂含量相對于Ccxl-O株為8.9%, tt4、tt5和tt6的油脂含量相對于Ler株分別 為 4.7%、8.8%, 11.1% (圖 2)。結果和討論由以上結果可判明，分別導入了添加有阻遏物結構域的轉錄因子Atlg56650、 轉錄共激活因子At5g24520、轉錄因子Atlg71030的各嵌合基因的植物體的種子的每單 位重量的油脂含量與同時栽培的野生株的每單位重量的油脂含量相比優(yōu)異，是在油脂生 產中非常有效的植物體。另一方面，導入了具有表達促進活性的Atlg71030的植物體的種子的每單位重量的油脂含量與同時栽培的植物體的每單位重量的油脂含量相比有一些 增加，但其增加率為導入了抑制表達促進活性的Atlg71030的植物體種子的每單位重量 的油脂含量的增加率的1/5左右。Atlg71030編碼具有MYB信號樣的結構域的蛋白質 (AtMybL2),通過使該基因以CaMV35S啟動子過量表達，從而顯示缺失葉、莖、萼的毛 狀體的性狀。認為這是由于形成毛狀體所需的GL2基因表達被抑制的緣故(參考文獻 DNARes.，9，31-34，2002)。有人報告了通過破壞GL2基因，種子的油脂含量增加8% (參考文獻PlantMol Biol.2006，60， 377-87，2006)。另外，AtMybL2蛋白質在其羧基末端區(qū)域具有包含6個氨基酸的轉錄阻遏物， 在過量表達AtMybL2基因的植物和過量表達編碼添加了作為EAR基序已知的轉錄阻 遏物的AtMybL2的基因的植物中，任一種情況下花色素苷前體的合成均被抑制(參考 文獻18TH INTERNATIONALCONFERENCE ON ARABIDOPSIS RESEARCH, TAIR accessionPublication 501721814)。然而，分析結果表明，相對于Atlg71030的過量表達 體的T2種子的油脂含量增加率為2.3%，添加了阻遏物結構域的Atlg71030的過量表達體 的T2種子的油脂含量的增加率大幅提高至12.2%，另外與GL2基因破壞時的油脂含量增 加率8%相比也顯著提高。由這些結果可認為，添加了阻遏物結構域的Atlg71030通過除 GL2以外的未知途徑作用于種子的油脂合成和儲存過程，從而增加油脂含量。另一方面，根據(jù)色素合成途徑缺失株的分析結果，色素合成途徑的主要基因被 破壞的突變株tt4、tt5、tt6、由于插入了 T-DNA而CHS基因被破壞的Δ CHS株的種子的 油脂含量均高于野生株。關于種皮色和油脂含量，有人報告了在油菜籽中種皮色為黃色 的品種HUA-yellowNo.l比種皮色為黑色的品種油脂含量高5-7% (參考文獻Genome 44 1077-1082(2001))。然而，在由異種間的雜交產生的現(xiàn)有育種法中，在決定種皮色 和種子的油脂含量的性狀的基因座接近的情況下也可以觀察到同樣的減少。因此，關于 基因表達與性狀的相關關系迄今為止尚未搞清楚。即，到目前為止，人們并不知道左右 種皮色的性狀的基因座會影響油脂含量這種見解。與此相對，在本結果中，通過實際地破壞編碼種皮的色素合成酶的基因而證實 了種子中的油脂含量增加。因此，首次搞清楚了不僅在利用雜交的現(xiàn)有育種法中，而 且在利用基因導入法、基因破壞法的分子育種法中，種皮色都是預測油脂含量的重要表 型。通過使用種皮色為指標，可以非破壞地評價種子的油脂含量，并且無需使用特別的 裝置，就可以有效地篩選出油脂含量增加的種子。更詳細地說，拍攝野生株、Atlg71030_SRDX、Atlg56650_SRDX、ACHS
家系的種子的照片并轉換成數(shù)字數(shù)據(jù)。對得到的數(shù)字數(shù)據(jù)使用圖像處理軟件(Adobe Photoshop)分別定量種子區(qū)域的RGB值。接著，計算出定量的R值、G值和B值的乘 積值。另外，也計算出相對于在野生型中所定量的R值、G值和B值的乘積值的比率。 將其結果示于表1和圖3。表 1
如表1和圖3所示，在八11§71030-310)乂、八11§56650-3110乂和八0^家系中，
將R值、G值和B值的乘積值與野生型比較，結果顯示了至少為2.88倍以上的值。如 上，可以使用種子的圖像數(shù)據(jù)來定量測定種皮色，從而能夠非常簡便且迅速地評價種子 中的油脂量。
權利要求
1.一種植物體，其表達由轉錄因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白質，其中所述轉 錄因子屬于包括含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質的轉錄因子家族，所述功能性肽 是將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物體，其特征在于，所述轉錄因子的轉錄促進活性被抑制。
3.根據(jù)權利要求1所述的植物體，其特征在于，所述嵌合蛋白質具有轉錄抑制因子活性。
4.根據(jù)權利要求1所述的植物體，其特征在于，所述轉錄因子是以下(a) (C)的任一蛋白質，(a)含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號4所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了1或多個氨基酸而 得的氨基酸序列、并具有轉錄促進活性的蛋白質，(c)由與含有序列號3所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的 多核苷酸編碼、并具有轉錄促進活性的蛋白質。
5.根據(jù)權利要求1所述的植物體，其特征在于，所述功能性肽是具有以下所示式 (1) ⑶的任一項所示的氨基酸序列的肽，(1)Xl-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3其中，式中的Xl表示O 10個氨基酸殘基，X2表示Aot或Glu，X3表示至少6個 氨基酸殘基，(2)Y1 -Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3其中，式中的Yl表示0 10個氨基酸殘基，Y2表示Phe或lie，Y3表示至少6個 氨基酸殘基，(3)Z1 -Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3其中，式中的 Zl 表示 Leu> Asp-Leu 或 Leu-Asp-Leu, Z2 表示 Glu> Gln 或 Asp, Z3表示0 10個氨基酸殘基，(4)Asp-Leu~Z4-Leu-Arg-Leu其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp，(5)α I-Leu-β I-Leu- Y I-Leu(6)α I-Leu- β I-Leu- Y 2-Leu(7)α I-Leu-β 2-Leu-Arg-Leu(8)α 2-Leu-β 1-Leu-Arg-Leu其中，式(5) (8)中的 α 1 表示 Asp、Asn> Glu、Gin、Thr 或 Ser，0 2表示八811、 Glu、Gin、Thr 或 Ser，β 1 表示 Asp、Gin、Asn> Arg> Glu、Thr、Ser 或 His，β 2 表 不 Asn、Arg> Thr、Ser 或 His，Y 1 表不 Arg、Gin、Asn> Thr、Ser、His、Lys 或 Asp， Y 2 表示 Gin、Asn> Thr、Ser、His、Lys 或 Asp。
6.根據(jù)權利要求1 5的任一項所述的植物體，其特征在于，油脂生產性顯著提高。
7.根據(jù)權利要求1 5的任一項所述的植物體，其特征在于，特定組織中的油脂含量顯者提尚。
8.根據(jù)權利要求7所述的植物體，其特征在于，特定組織是種子。
9.根據(jù)權利要求1 8的任一項所述的植物體，其特征在于，是被子植物。
10.根據(jù)權利要求1 8的任一項所述的植物體，其特征在于，是雙子葉植物。
11.根據(jù)權利要求1 8的任一項所述的植物體，其特征在于，是十字花科植物。
12.根據(jù)權利要求1 8的任一項所述的植物體，其特征在于，是擬南芥。
13.使用植物體的物質制造方法，包括從權利要求1 12的任一項所述的植物體中分 離和回收生產性提高了的物質。
14.根據(jù)權利要求13所述的使用植物體的物質制造方法，其特征在于，所述物質是油脂。
15.—種嵌合蛋白質，其由轉錄因子和功能性肽融合而成，其中所述轉錄因子屬于包 括含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質的轉錄因子家族，所述功能性肽是將任意轉錄 因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽。
16.根據(jù)權利要求15所述的嵌合蛋白質，其特征在于，所述轉錄因子是以下(a) (C)的任一蛋白質，(a)含有序列號4所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號4所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了1或多個氨基酸而 得的氨基酸序列、并具有轉錄促進活性的蛋白質，(C)由與含有序列號3所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的 多核苷酸編碼、并具有轉錄促進活性的蛋白質。
17.根據(jù)權利要求15所述的嵌合蛋白質，其特征在于，所述功能性肽是具有以下所示 式(1) (8)的任一項所示的氨基酸序列的肽，(1)Xl-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3其中，式中的Xl表示0 10個氨基酸殘基，X2表示Aot或Glu，X3表示至少6個 氨基酸殘基，(2)Y1 -Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3其中，式中的Yl表示0 10個氨基酸殘基，Y2表示Phe或lie，Y3表示至少6個 氨基酸殘基，(3)Z1 -Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3其中，式中的 Zl 表示 Leu> Asp-Leu 或 Leu-Asp-Leu, Z2 表示 Glu> Gln 或 Asp, Z3表示0 10個氨基酸殘基，(4)Asp-Leu-Z4_Leu-Arg-Leu其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp，(5)α I-Leu-β I-Leu- Y I-Leu(6)α I-Leu- β I-Leu- Y 2-Leu(7)α I-Leu-β 2-Leu-Arg-Leu(8)α 2-Leu-β 1-Leu-Arg-Leu其中，式(5) (8)中的 α 1 表示 Asp、Asn> Glu、Gin、Thr 或 Ser，0 2表示八811、 Glu、Gin、Thr 或 Ser，β 1 表示 Asp、Gin、Asn> Arg> Glu、Thr、Ser 或 His，β 2 表 不 Asn、Arg> Thr、Ser 或 His，Y 1 表不 Arg、Gin、Asn> Thr、Ser、His、Lys 或 Asp， Y 2 表示 Gin、Asn> Thr、Ser、His、Lys 或 Asp。
18.編碼權利要求15 17的任一項所述的嵌合蛋白質的基因。
19.含有權利要求18所述的基因的表達載體。
20.含有權利要求18所述的基因的轉化體。
21.一種植物來源油脂的制造方法，包括從由查耳酮合酶基因的功能缺失的植物體采 摘的種子中回收油脂成分的工序。
22.根據(jù)權利要求21所述的植物來源油脂的制造方法，其特征在于，所述查耳酮合酶 基因是編碼以下(a) (C)的任一蛋白質的基因，(a)含有序列號6所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號6所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了1或多個氨基酸而 得的氨基酸序列、并具有查耳酮合酶活性的蛋白質，(C)由與含有序列號5所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的 多核苷酸編碼、并具有查耳酮合酶活性的蛋白質。
23.一種植物來源油脂的制造方法，包括從由查耳酮異構酶基因的功能缺失的植物體 采摘的種子中回收油脂成分的工序。
24.根據(jù)權利要求23所述的植物來源油脂的制造方法，其特征在于，所述查耳酮合酶 基因是編碼以下(a) (C)的任一蛋白質的基因，(a)含有序列號8所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號8所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了1或多個氨基酸而 成的氨基酸序列、并具有查耳酮異構酶活性的蛋白質，(C)由與含有序列號7所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的 多核苷酸編碼、并具有查耳酮異構酶活性的蛋白質。
25.一種植物來源油脂的制造方法，包括從由黃酮-3-水化酶基因的功能缺失的植物 體采摘的種子中回收油脂成分的工序。
26.根據(jù)權利要求25所述的植物來源油脂的制造方法，所述黃酮-3-水化酶基因是編 碼以下(a) (C)的任一蛋白質的基因，(a)含有序列號10所示氨基酸序列的蛋白質，(b)含有在序列號10所示氨基酸序列中缺失、置換、添加或插入了1或多個氨基酸而 得的氨基酸序列、并具有黃酮-3-水化酶活性的蛋白質，(C)由與含有序列號9所示堿基序列的互補堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交的 多核苷酸編碼、并具有黃酮-3-水化酶活性的蛋白質。
27.一種油脂量提高了的植物體的篩選方法，包括以下工序從作為評價種子內的油脂量的對象的植物體采摘種子的工序；以及觀察采摘的種子的種皮色，以顏色越白種子內的油脂量高的方式來判斷種子內的油 脂量的工序。
28.根據(jù)權利要求27所述的篩選方法，其特征在于，所述評價對象植物體是表達由轉 錄因子與將任意轉錄因子轉換成轉錄抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白質的植物 體或基因功能缺失的植物體。
全文摘要
探索具有能夠提高每個個體的物質生產性的新功能的轉錄調控因子，提高植物體內的這些特性。使屬于包括含有序列號4所示氨基酸序列的轉錄因子的轉錄因子家族轉錄因子與阻遏物結構域融合而成的嵌合蛋白質在植物體內表達。
文檔編號C12N5/10GK102016032SQ20098011601
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權日2008年3月4日
發(fā)明者光川典宏, 大音德, 村本伸彥, 松井恭子, 茶谷大志, 近藤聰, 高木優(yōu) 申請人:豐田自動車株式會社