專利名稱：生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑的提取方法。
背景技術(shù)：
鼠李糖脂是由微生物產(chǎn)生的具有表面活性的兩親化合物，它與化學合成的表面活性劑相比，除具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和發(fā)泡等相同特性外，其表面活性和乳化能力更強，還具有一般化學合成表面活性劑所不具備的無毒、易生物降解等特性，是一種有利于環(huán)境保護的綠色產(chǎn)品。鼠李糖脂的分子結(jié)構(gòu)類型多樣，具有許多特殊的官能團，專一性強，可用于一些特殊領(lǐng)域。它在石油采收、環(huán)境修復、醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑和食品等工業(yè)方面極具潛在的應用價值。
然而，鼠李糖脂在微生物發(fā)酵液中的產(chǎn)量很低且發(fā)酵液成分復雜，其分離、提取和濃縮工藝不僅難度較大，還成為鼠李糖脂生產(chǎn)成本的主要部分，其費用約占生產(chǎn)總成本的60％～70％。因而選擇合適的產(chǎn)物提取方法是保證生產(chǎn)工藝成功的一個重要環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)的提取工藝一般包括了離心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及硅膠柱層析等過程。對于大規(guī)模的生產(chǎn)來說，需要大量的氯仿做溶劑，在經(jīng)濟上是不合理的，而且氯仿是一種高毒性的有機氯化物，對人體和環(huán)境極具危害。生產(chǎn)的高成本和高毒性決定了鼠李糖脂大規(guī)模的生產(chǎn)和應用受到限制。
目前國內(nèi)對生物表面活性劑鼠李糖脂的研究，專利技術(shù)涉及較多的是如何提高鼠李糖脂的產(chǎn)率及具體應用等。如微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑可以增強油類提取，某單位研制了一種鼠李糖脂生物表面活性劑，和其它表面活性劑復配，用于三次采油，平均采收率比水提高20％(專利申請?zhí)?9107581.1)。對于被油污染的海面或土壤，可加快油類的降解；還有用于對重金屬污染的土壤和地下水的修復等。有人研究了鼠李糖脂對土壤中多環(huán)芳烴的增溶及脫附作用，還有人研究了鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)，旨在提高鼠李糖脂的含量，更好地應用于生活垃圾堆肥處理中(專利申請?zhí)?3118042.6)。然而，由于鼠李糖脂存在于微生物的發(fā)酵液中，而且含量很低，如CN1275429A公開的鼠李糖脂的最大產(chǎn)量僅為25g/L；另一研究者公開的發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量為30g/L～40g/L，但發(fā)酵液中成分復雜，分離提取較純的鼠李糖脂的工藝較為復雜，它的生產(chǎn)成本中有約為70-90％都要用在中下游提取及分離工藝上，因而，鼠李糖脂大規(guī)模的應用就受到限制。研究提取鼠李糖脂簡單而有效的環(huán)保方法已引起不少學者的興趣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，它能有效降低鼠李糖脂的生產(chǎn)成本、顯著減少生產(chǎn)過程中對環(huán)境的危害，使其更好地投入實際應用中。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，所述生物表面活性劑鼠李糖脂提取的工藝步驟為(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液在溫度為3.5℃-4.5℃條件下，以轉(zhuǎn)速為7800rpm-8200rpm離心18-22min除去菌體后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸銨后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后離心去除蛋白類沉淀物，得上清液B；
(3)將上清液B用0℃-4℃的冰食鹽水適當稀釋去除蛋白類沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱靜置，至殘存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去，得上清液C；(4)將上清液C的pH值調(diào)至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后(5)將所得液體在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm條件下離心25min-35min后，得淡黃色沉淀物，收集該沉淀物；(6)將收集到的淡黃色沉淀物進行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
以下對本發(fā)明做出進一步說明。
上述步驟(1)至(3)為對原料鼠李糖脂發(fā)酵液的預處理，經(jīng)過這三個步驟的預處理后，發(fā)酵液中的細菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。
上述步驟(6)中的冷凍干燥可采用如下操作過程①將產(chǎn)品(淡黃色沉淀物)放入寬口燒杯中，于低溫冰箱(-30℃)中冷凍30分鐘；②將冷凍干燥機冷凍井的溫度調(diào)至-45℃；③將凍好的產(chǎn)品放在冷凍干燥機的托盤上，蓋上有機玻璃罩并檢查其氣密性；④開動真空泵抽真空，干燥的時間為24～36小時。
做為本發(fā)明提取工藝所用原料的鼠李糖脂發(fā)酵液，可采用現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品，或采用已有技術(shù)制備。例如，所述鼠李糖脂發(fā)酵液可由以下途徑獲得1、菌種的活化及保藏從中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)購得銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCAB93066，菌種經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接保藏在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的成分見表1所示。斜面培養(yǎng)至菌體生長旺盛后(24～36h)，將試管口用牛皮紙塞包上，將斜面放入4℃的冰箱中保藏，保藏期為1～3個月，一般2個月傳代一次。傳代時先通過平板劃線分離獲得純培養(yǎng)菌，再將其接種在傳代斜面培養(yǎng)基上保存。
表1.傳代斜面培養(yǎng)基的成分

2.鼠李糖脂發(fā)酵液的生產(chǎn)按下列表2所示培養(yǎng)基配方配制種子培養(yǎng)液，取80mL于500mL三角燒瓶中滅菌，從保存的斜面接種P.A-AB93066(銅綠假單胞菌)于三角燒瓶中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)條件溫度37℃，pH值6.5，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘。
表2種子培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為粗制豆油100～120g/L，NaNO37.5～8.5g/L，KH2PO40.5～1.5g/L，Na2HPO4.12H2O 0.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。按以上配方配置發(fā)酵培養(yǎng)液(不包括豆油)共1.8L，分別裝入8個1000mL的三角瓶中，因油類須單獨滅菌，所以豆油(須加15～20％的水)另分裝在8根大試管中，三角瓶和試管先用紗布封口，再包一層牛皮紙，并用棉線扎緊；用報紙包10mL移液管2根；將上述的三角瓶、大試管和移液管在滅菌鍋中滅菌，溫度控制在120-125℃之間，滅菌時間為30分鐘；用移液管從上述裝有種子培養(yǎng)液的500mL三角瓶中分別吸取7mL種子培養(yǎng)基(培養(yǎng)24h)，接入8個滅完菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中。接種在超凈工作臺上完成，培養(yǎng)條件37℃，pH值7.0，并以250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為96小時，即得到所述鼠李糖脂發(fā)酵液，其中鼠李糖脂含量不低于28g/L。
按上述工藝生產(chǎn)的鼠李糖脂產(chǎn)品，通過液-質(zhì)聯(lián)用對樣品的分析表明，含有兩種結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂，分子量分別為650和504，分別為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂。
鼠李糖脂產(chǎn)品的測定將經(jīng)過冷凍干燥的鼠李糖脂產(chǎn)品進行高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。高效液相色譜起到分離樣品的作用，為質(zhì)譜分析做準備。樣品的鑒定在湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室進行。具體的儀器及操作條件如下儀器名稱美國Thermo Finngan公司生產(chǎn)的型號為LCO Advantage的LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3柱(150mm×2.1mm×5μm)。進樣量20μL，流動相為乙腈1％醋酸水溶液。在不同的洗脫時段，流動相的體積比不同。在0～15min內(nèi)乙腈1％醋酸的體積比為50∶50，在16～23min內(nèi)流動相的體積比為100∶0，在24～30min內(nèi)流動相的體積比又為50∶50。流速均為0.3mL/min。柱溫25℃，毛細管溫度為300℃。
質(zhì)譜條件電噴霧(ESI)源，負離子(NEG)檢測。質(zhì)譜掃描質(zhì)量數(shù)范圍300～1000m/z。
掃描結(jié)果見圖1-圖3。
對總質(zhì)譜圖的每個峰進行逐個分析，得到time＝13.54min和16.32min的兩個峰的m/z符合鼠李糖脂的分子量規(guī)律，如圖2、圖3所示。在圖2和圖3中，被測物質(zhì)的m/z分別為650和503.9，對應的分子量分別為650和504，分別為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂的分子量。二鼠李糖脂和單鼠李糖脂的分子結(jié)構(gòu)式如圖4和圖5所示。
由圖1總質(zhì)譜圖的豐度可見，樣品的主要成分為二鼠李糖脂和單鼠李糖脂，且純度已很高，其中二鼠李糖脂約占60％。將提取后的鼠李糖脂進行稱量，產(chǎn)量為28.3g/L，溶于水后其表面張力為29.48mN/m，臨界膠束濃度CMC為25mg/L。
本發(fā)明的技術(shù)原理是，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginose)經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后，產(chǎn)生了大量的鼠李糖脂，但發(fā)酵液中成分非常復雜，除鼠李糖脂外，還含有菌體、殘余的培養(yǎng)基成分以及蛋白化合物和蛋白質(zhì)乳化劑、中性脂、多糖等。由于鼠李糖脂在水溶液中呈酸性，只有當溶液的pH值大于5時才能完全溶解，因此可以用酸沉淀法提取鼠李糖脂。但發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)和殘余的豆油對鼠李糖脂的沉淀會產(chǎn)生嚴重的干擾作用。原因有兩個，第一，用酸沉淀法提取鼠李糖脂時，需將溶液的pH調(diào)至2.0以下，此時發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)達到等電點從而產(chǎn)生沉淀，而鼠李糖脂卻不能有效的分離出來；第二，鼠李糖脂的表面活性使發(fā)酵液中的殘余豆油穩(wěn)定地分散于溶液中，與鼠李糖脂形成了穩(wěn)定的乳狀體系，從而妨礙鼠李糖脂的沉淀。本實驗先通過離心除去菌體；利用硫酸銨能與蛋白類物質(zhì)產(chǎn)生沉淀的原理，在上清液中加入適量的硫酸銨再離心從而除去蛋白類物質(zhì)；加入冰鹽水(NaCl溶液)使殘存的豆油破乳凝聚于上清液表面，輕輕刮去殘油。經(jīng)過這三步預處理過程后，發(fā)酵液中的細菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。再將上清液的pH值調(diào)至2以下靜置12小時，然后以8000r/min離心，收集沉淀；將收集到的淡黃色沉淀物進行冷凍干燥去除水份后就能得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
由以上可知，本發(fā)明為一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，即酸沉淀-冷凍提取法。同現(xiàn)有技術(shù)相比，它所具有的積極效果是，所得鼠李糖脂的最終產(chǎn)量高達28g/L以上，生產(chǎn)成本較用離心沉淀、氯仿-甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及硅膠柱層析等方法低一倍以上，而且本發(fā)明的生產(chǎn)過程沒有采用任何有害物質(zhì)，對人體和環(huán)境無危害，是一項低成本的綠色提取工藝，且操作工藝簡單，值得大力推廣。


圖1是鼠李糖脂樣品的總質(zhì)譜圖；圖2是二鼠李糖脂的質(zhì)譜圖；圖3是單鼠李糖脂的質(zhì)譜圖；圖4是單鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)式；圖5是二鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)式。
具體實施例方式
1.鼠李糖脂發(fā)酵液的制備1)將銅綠假單胞菌從斜面培養(yǎng)基接種至種子培養(yǎng)基中，進行搖瓶培養(yǎng)，500mL的三角燒瓶中裝種子培養(yǎng)液80mL。培養(yǎng)條件溫度37℃，時間24小時，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘。
2)在每個1L發(fā)酵罐中裝入250mL以豆油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種銅綠假單胞菌種子培養(yǎng)液7mL，培養(yǎng)條件37℃，用HCl或NaOH控制pH值為7.0，并以250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為96小時。得到每個發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)液約230mL，將所有的發(fā)酵罐中的發(fā)酵液收集在一起。
注傳代斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基的配方見表1和表2所示，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為粗制豆油120g/L，NaNO38.0g/L，KH2PO41.0g/L，Na2HPO4.12H2O 1.0g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.1g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，pH7.0。
2.鼠李糖脂發(fā)酵液的預處理取出培養(yǎng)96小時后的發(fā)酵液，將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘、溫度為4℃時離心20分鐘除去菌體，離心后取上清液。上清液加入80mg/L的硫酸銨后放入4℃的冰箱中靜置12小時，再離心去除蛋白類沉淀物。用適量的冰鹽水(NaCl溶液)稀釋已去除蛋白類沉淀物的上清液(濃度為10％的冰鹽水的體積取發(fā)酵液體積的0.2倍)，放入4℃冰箱靜置8小時，待殘存的豆油破乳凝聚于上清液表面，輕輕刮去殘油。經(jīng)過這三步預處理過程后，發(fā)酵液中的細菌、殘油及蛋白類雜質(zhì)都得到了去除。
3.鼠李糖脂的提取將經(jīng)過預處理后的上清液的pH值調(diào)至2.0以下，放入4℃的冰箱中靜置12小時；再將發(fā)酵液在4℃和8000r/min的條件下離心30分鐘并收集沉淀；將收集到的淡黃色沉淀物進行冷凍干燥，得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
冷凍干燥的具體操作過程如下①將產(chǎn)品放入寬口燒杯中，于低溫冰箱(-30℃)中冷凍30分鐘；②將冷凍干燥機冷凍井的溫度調(diào)至-45℃；③將凍好的產(chǎn)品放在冷凍干燥機的托盤上，蓋上有機玻璃罩并檢查其氣密性；④開動真空泵抽真空，干燥的時間為24～36小時。
權(quán)利要求
1.一種生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝，其特征在于，其工藝步驟為(1)取鼠李糖脂含量不低于28g/L的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液在溫度為3.5℃-4.5℃條件下，以轉(zhuǎn)速為7800rpm-8200rpm離心18-22min除去菌體后，得上清液A；(2)在上清液A中按60mg/L-120mg/L的量加入硫酸銨后，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后離心去除蛋白類沉淀物，得上清液B；(3)將上清液B用0℃-4℃的冰食鹽水適當稀釋去除蛋白類沉淀物后，放入3.5℃-4.5℃冰箱靜置，至殘存的油脂乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去，得上清液C；(4)將上清液C的pH值調(diào)至2.0以下，放入3.5℃-4.5℃的冰箱中靜置11h-13h，然后(5)將所得液體在3.5℃-4.5℃和7800rpm-8200rpm條件下離心25min-35min后，得淡黃色沉淀物，收集該沉淀物；(6)將收集到的淡黃色沉淀物進行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為生物表面活性劑鼠李糖脂的提取工藝。其步驟為將鼠李糖脂發(fā)酵液在約4℃時以轉(zhuǎn)速約8000rpm離心除去菌體后，按60mg/L－120mg/L的量加入硫酸銨，放入約4℃的冰箱中靜置約10h，離心去除蛋白類沉淀物；用冰食鹽水適當稀釋去除蛋白類沉淀物后的上清液，放入約4℃冰箱靜置，至殘存的油脂破乳凝聚于上清液表面后，將其輕輕刮去；將溶液pH值調(diào)至2以下，放入約4℃的冰箱中靜置約10h；在約4℃和8000rpm條件下離心約30min后，將收集到的淡黃色沉淀物進行冷凍干燥，即得到鼠李糖脂產(chǎn)品。本提取工藝具有生產(chǎn)成本低、對環(huán)境無危害的特點，且提取率高。
文檔編號E21B43/16GK1974589SQ200610136880
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者施周, 馬滿英, 吳星杰 申請人:湖南大學