專利名稱：用于懷孕的雌性哺乳動(dòng)物的以增強(qiáng)她們的后代的免疫性的益生菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益生細(xì)菌在制備營養(yǎng)組合物中的用途，用于懷孕的雌性哺乳動(dòng)物以 增強(qiáng)她們的新生后代的免疫狀態(tài)。
背景技術(shù)：
新生兒的免疫狀態(tài)是重要的問題。這種狀態(tài)包括在嬰兒出生時(shí)存在的保護(hù)以及 在嬰兒生命最初的小時(shí)、天或者周期間獲得此種免疫保護(hù)。獲得和維持此種保護(hù)的能力 是面對(duì)新環(huán)境的嬰兒的健康的關(guān)鍵因素。在人類中，這些問題對(duì)人群的健康是最重要 的。在妊娠期間維持懷孕母親的良好健康條件是提高妊娠期間和出生后后代的健康 的關(guān)鍵因素。已知的一般健康因素包括她們的營養(yǎng)習(xí)慣、她們的微量營養(yǎng)物攝取、她們 的感染史，并且也涉及她們的免疫狀態(tài)。例如，一些礦物質(zhì)、維生素或者物質(zhì)(例如葉 酸)的缺乏可以影響胎兒的發(fā)育，以及也影響出生后嬰兒的發(fā)育。母親的營養(yǎng)在嬰兒未 來的健康中起著關(guān)鍵的作用，并且已經(jīng)對(duì)監(jiān)測和改善懷孕母親的營養(yǎng)平衡做出了許多努 力。食物補(bǔ)充劑或者僅一般的飲食指南在那方面是基本的。除用于懷孕母親的一般營養(yǎng)指南外，現(xiàn)在也認(rèn)識(shí)到，一些特定的食物可以促進(jìn) 懷孕母親的胃腸道中特定的小型生物群的增殖。平衡的小型生物群反過來可以對(duì)宿主起 作用。使用益生菌劑即營養(yǎng)物質(zhì)來改善宿主腸內(nèi)小型生物群已經(jīng)在例如W002/07533 中描述了其對(duì)雌性的健康益處。而且，W02007/105945A已經(jīng)要求專利保護(hù)用益生素成分，特別是不可消化糖 類的某些類型，喂飼懷孕母親能改善后代的小型生物群和/或免疫系統(tǒng)。也已經(jīng)表明，用微生物，優(yōu)選地活的微生物補(bǔ)充營養(yǎng)的攝取改善了宿主腸道的 小型生物群平衡。已經(jīng)顯示通過特定的活的微生物來調(diào)節(jié)腸道的小型生物群引起了特 別有利的生理效應(yīng)。例如，已經(jīng)廣泛研究并描述了由特定類型的益生細(xì)菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng) 答(“Cross talk between probioticsbacteria and the host immune system” , The journal of nutrition, BlaiseCorthesy等人，增刊，2007，第781S-790S頁)。如在科學(xué)文獻(xiàn)中所述， 特定的微生物菌株已經(jīng)更特別地顯示出具有有益的作用。雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、 嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳桿菌(Lactobacillus caseii)是一般已知的顯 示出具有益生菌劑作用的家族的例子。假定益生菌劑，同其它共生體一樣，將通過調(diào)節(jié)小型生物群組成和/或代謝活 性或者通過與位于腸道粘膜下的免疫系統(tǒng)直接相互作用來影響宿主的免疫功能。在這種 相互作用之后，將會(huì)激活免疫功能，反映為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)(細(xì)胞因子)的釋放、抗體的產(chǎn) 生和淋巴細(xì)胞以及其它免疫細(xì)胞的活化。這些活化的細(xì)胞、細(xì)胞因子和/或細(xì)菌化合物 將通過血液循環(huán)在身體的不同部位發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在那方面，假定通過益生菌劑補(bǔ) 充對(duì)母親的免疫狀態(tài)起的有益作用可能已經(jīng)影響了胎兒的免疫發(fā)育。而且，已知源自母親的腸的免疫細(xì)胞和其它生物活性因子可以通過腸-乳房運(yùn)輸途徑運(yùn)輸?shù)侥溉椴⒃诓溉?期間傳輸給新生兒。因此，值得進(jìn)一步假定，對(duì)懷孕母親的補(bǔ)充可以促進(jìn)有助于支持新 生兒免疫發(fā)育的具免疫因子的乳汁的富集。確保后代的健康未來是公認(rèn)需要的。更特別地，確保后代的免疫系統(tǒng)的最好發(fā) 育和成熟是最重要的。常規(guī)地，除與特定的醫(yī)學(xué)疾病相對(duì)應(yīng)的醫(yī)學(xué)治療外，重點(diǎn)還放在懷孕母親良好 的營養(yǎng)平衡上。然而，怎樣在妊娠期期間特別地增強(qiáng)后代的免疫狀態(tài)還知之甚少。
然而，存在使用最新的有關(guān)營養(yǎng)的發(fā)現(xiàn)來進(jìn)一步確保后代的健康未來的需要。因此，存在通過懷孕母親的靶向營養(yǎng)飲食來積極地影響后代的健康的需要。特別存在在后代中幫助保證最好的免疫系統(tǒng)的需要，以便使他們?yōu)樵缙谏?原攻擊作最好準(zhǔn)備以及增強(qiáng)他們的免疫系統(tǒng)的未來成熟，以更好地促進(jìn)在隨后嬰兒期期 間的保護(hù)。存在在妊娠期期間的最早可能階段和整個(gè)妊娠期，以及當(dāng)免疫系統(tǒng)在快速地成 熟時(shí)他們的新生兒的早期時(shí)期，影響后代的免疫系統(tǒng)的建立的需要。存在增強(qiáng)后代的免疫系統(tǒng)的能力，以總體上對(duì)抗原和特別地對(duì)感染性疾病反應(yīng) 的需要。存在通過既有效又除去了對(duì)懷孕母親和或她們的后代的負(fù)面影響的方法來遞送 這些益處的需要。發(fā)明概述在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了益生菌劑的用途，用于對(duì)懷孕的雌性哺乳動(dòng)物 制備組合物，來增強(qiáng)她們的后代出生后的免疫性。在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了特定的益生菌劑生物例如雙歧桿菌屬、乳桿 菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)禾口 酵母屬 (Saccharomyces)在懷孕的女性人類中用于增強(qiáng)她們的后代在出生后的免疫性的用途。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了益生菌劑在妊娠期期間和/或后代的哺乳期期 間的用途。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，益生菌劑在懷孕的母親的食物或飲料中或與懷孕的 母親的食物或飲料一起，并連同其它活性成分例如益生素或者其它食品添加物一起施用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及出于目的性引用的由上述方法所使用的組合物。附圖簡述

圖1和圖3圖解地強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2分別描述的實(shí)驗(yàn)程序。圖2和圖4顯示在后代中表現(xiàn)出免疫加強(qiáng)的研究結(jié)果。發(fā)明詳述定義在本說明書中，以下的術(shù)語具有下列含義“懷孕的雌性哺乳動(dòng)物”是在雌性哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)具有至少一個(gè)在發(fā)育的已 受精卵母細(xì)胞的雌性哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明考慮女性人類(例如母親或者準(zhǔn)母親)?！耙嫔鷦币庵妇哂袑?duì)宿主的保健或健康起有益的作用的微生物細(xì)胞制備物 或者微生物細(xì)胞的組分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人，“Probiotics howshould they be defined” Trends Food Sci.Technol.1999 10107-10)。益生菌劑可以包含微 生物的唯一菌株、多種菌株的混合物和/或多種微生物的混合物。在混合物的情況下， 單數(shù)術(shù)語“益生菌劑”也可以用于指益生菌劑混合物或制備物?！耙嫔亍?一般意指通過選擇性地刺激存在于宿主腸中的微生物的生長和/或活 性對(duì)宿主起有益的作用，并因此期望改善宿主健康的非可消化的食物成分。
“后代”指由受試的雌性哺乳動(dòng)物新出生的或?qū)⒁錾膵雰骸Ｌ貏e地，它包 括仍處于妊娠期的后代。優(yōu)選地，本發(fā)明考慮的是幼年期/嬰兒期(即，直到人類的青 春期-12-14歲)，更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及處于早期嬰兒期(直到人類年齡的2至4歲)的 后代的免疫狀態(tài)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，給懷孕的雌性哺乳動(dòng)物施用益生菌劑可以影響后代的免疫 系統(tǒng)，并且更特別地，可以增強(qiáng)后代的免疫系統(tǒng)例如在暴露于抗原后使免疫系統(tǒng)能更好 和更強(qiáng)的應(yīng)答。當(dāng)后代的免疫系統(tǒng)在成熟的時(shí)候，他們的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可以在他們的 子宮內(nèi)生活時(shí)或者子宮外生活的早期時(shí)非常早的發(fā)生。本發(fā)明人證明了在后代的腸系統(tǒng)與施用給懷孕的雌性的益生菌劑組合物之間不 存在明顯的直接接觸的情況下，即在后代的子宮內(nèi)生活期間的加強(qiáng)的作用。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，包含益生菌劑的此種組合物也可以對(duì)哺乳期期間的后代 的免疫系統(tǒng)起有益的作用。不被理論所束縛，推斷由于益生菌劑在懷孕女性的腸道的局部群集誘導(dǎo)了分子 信號(hào)的產(chǎn)生。認(rèn)為后代接收并對(duì)這些分子信號(hào)作出了反應(yīng)。進(jìn)一步認(rèn)為，后代的免疫系 統(tǒng)受到了那些信號(hào)的影響。那些信號(hào)對(duì)后代的免疫系統(tǒng)的成熟具有積極的作用。這可以 導(dǎo)致出生后對(duì)抗原反應(yīng)的更好能力。更特別地，如果在后代的妊娠期期間對(duì)信號(hào)存在預(yù) 適應(yīng)，進(jìn)一步推斷，該信號(hào)可以在哺乳期期間傳輸給后代。懷孕雌性本發(fā)明的組合物的用途和本發(fā)明的組合物是在懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中實(shí)施并施 用給懷孕的雌性哺乳動(dòng)物，即預(yù)期生育后代的雌性。本發(fā)明所考慮的用途從后代的開始 (受精)經(jīng)歷整個(gè)妊娠期延伸至后代的分娩。它也可以延伸至哺乳期直到斷奶。部分?jǐn)?奶，直到哺乳期的完全終止，也包括于本發(fā)明中。并不排除本發(fā)明所考慮的用途也延伸 至緊接在受精之前的時(shí)期，該時(shí)期對(duì)雌性的健康狀態(tài)和間接地對(duì)后代的健康狀態(tài)具有影 響。哺乳動(dòng)物可以是懷孕的人類女性。在這種情況下，妊娠期是大約9個(gè)月，且哺 乳期可以根據(jù)習(xí)慣、文化和女性的健康狀態(tài)相當(dāng)大地變化。雌性哺乳動(dòng)物也可以是其它 的雌性哺乳動(dòng)物，包括馬和寵物例如貓和狗。本發(fā)明并不排除其它懷孕的雌性哺乳動(dòng) 物。益生菌微生物本發(fā)明考慮的益生菌微生物可以包括選自雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球 菌屬、腸球菌屬和酵母屬或者它們的混合物的任一種益生菌，優(yōu)選地選自長雙 歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳桿 菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、畐0 干酪乳 桿菌(Lactobacillus paracasei)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantaram)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌 (Lactobacillus reuteri)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、鏈球菌屬中的禾中(Streptococcus sp.)和布拉酵母(Saccharomyces boulardii)或者它們的混合物。本發(fā)明并不排除其它的益
生菌微生物，只要它們能遞送所述的免疫加強(qiáng)作用。
更優(yōu)選地，益生菌選自鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.3724 (別名NCC4007和LPR)、 尤其由丹麥的Christian Hansen公司在商標(biāo)Bb 12 (別名NCC2818)下出售的乳雙歧桿 菌CNCM 1-3446、由日本的Morinaga Milk工業(yè)有限公司在商標(biāo)BB536下出售的長 雙歧桿菌ATCC BAA-999、約漢遜氏乳桿菌CNCM 1-1225 (別名NCC533和Lal)、 由Probiomics (澳大利亞)在商標(biāo)PCC下出售的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum) VRI003、長雙歧桿菌CNCM 1-2170、長雙歧桿菌CNCM 1-2618、由Danisco (丹麥)在商 標(biāo)Bb-03下出售的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、由Morinaga (日本)在商標(biāo)M-16V 下出售的短雙歧桿菌和由Institut Rosell (Lallemand)(加拿大)在商標(biāo)R0070下出售的短雙 歧桿菌的菌株、副干酪乳桿菌CNCM 1-1292、尤其從芬蘭的Valio Oy在商標(biāo)LGG下可獲 得的鼠李糖乳桿菌ATCC 53103、屎腸球菌SF 68、和它們的混合物。優(yōu)選的益生菌是鼠 李糖乳桿菌CGMCC 1.3724。益生菌的劑量只要所用的特定益生菌遞送所述的免疫加強(qiáng)作用，益生菌可以在組合物中以廣 的％范圍存在。然而，優(yōu)選地，益生菌在組合物中以相當(dāng)于干的組合物的IO3和IOuiCfo/ g之間的量存在(Cfu=集落形成單位)。這種表述包括細(xì)菌為活的、無活性的或死的或者 甚至以片段例如DNA或細(xì)胞壁材料存在的可能性。換言之，將制劑含有的細(xì)菌的量根據(jù) 那些有集落形成能力的細(xì)菌的量來表述，就好比所有的細(xì)菌都是活的，而不考慮是否它 們實(shí)際上是活的、無活性的或死的、片段化的或者是任一或所有這些狀態(tài)的混合物。優(yōu) 選地，益生菌以相當(dāng)于干的組合物的IO4至IO9CiVg之間的量存在，甚至更優(yōu)選地以相當(dāng) 于干的組合物IO6至IO8 cfu/g之間的量存在。施用的方法組合物可以通過多種方式施用給懷孕的雌性，只要它誘導(dǎo)組合物與雌性的胃腸 道接觸。優(yōu)選地，組合物作為雌性的食物、飲料或者食品添加物的部分施用。組合物也 可以以藥物組合物的方式施用。優(yōu)選地，施用是經(jīng)口的或者經(jīng)腸的。經(jīng)口施用是最優(yōu)選 的，因?yàn)樗鼘?duì)雌性具有更小的創(chuàng)傷性影響。然而，在病理學(xué)條件中或者當(dāng)除非要使用腸 內(nèi)喂飼時(shí)，可以將組合物的施用加入到腸內(nèi)喂飼中。與其它化合物的施用在任一情況下，化合物可以單獨(dú)(例如純地或者稀釋于水的)或者以與其它化合 物(例如食品添加物、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、藥物、運(yùn)載體、調(diào)味料、可消化的或不可消化的成 分)混合的方式施用。維生素和礦物質(zhì)是一般的食品添加物的例子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，組合物與其它化合物一起施用，該化合物增強(qiáng)對(duì)后代的免疫性的所述作用。此 類協(xié)同性化合物可以是運(yùn)載體或基質(zhì)，它們促進(jìn)遞送益生菌劑到雌性的腸道，優(yōu)選地以 活性的形式。此類協(xié)同性化合物也可以影響懷孕的雌性的健康狀態(tài)或代謝，例如增強(qiáng)組 合物對(duì)后代的免疫系統(tǒng)的作用。此類協(xié)同性化合物可以是其它活性化合物，它們協(xié)同地 或者單獨(dú)地影響嬰兒的免疫應(yīng)答和/或潛在影響益生菌劑的作用。此類協(xié)同性化合物的例子是麥芽糖糊精。麥芽糖糊精的作用之一是為益生菌劑提供運(yùn)載體、增強(qiáng)其作用、和 防止聚合。其它的例子包括已知的益生素化合物例如選自菊粉、果寡糖(FOS)、短鏈果 寡糖(短鏈F0S)、半乳寡糖(GOS)、木寡糖(XOS)、神經(jīng)節(jié)苷脂(glanglioside)、部分水 解的瓜爾豆膠(PHGG)、阿拉伯樹膠、大豆膠、乳枸杞(Lactowolfterry)、枸杞提取物或 它們的混合物的碳水化合物?？梢源嬖谄渌奶妓衔?，例如與第一碳水化合物協(xié)同 作用的第二碳水化合物，且其選自木寡糖(X0S)、樹膠、阿拉伯樹膠、淀粉、部分水解 的瓜爾豆膠或它們的混合物。碳水化合物在組合物的每日劑量中可以以大約Ig至20g或者至80%或20% 至60%存在。備選地，碳水化合物以干的組合物的10%至80%存在。總之，無論如何， 碳水化合物的每日劑量應(yīng)當(dāng)遵照已發(fā)布的安全指南和法規(guī)要求。對(duì)于兒童，一般的限制 例如是6g/L/天的最大量。在一個(gè)實(shí)施方案中，營養(yǎng)組合物優(yōu)選地包含蛋白質(zhì)源。飲食蛋白質(zhì)是優(yōu)選的作 為蛋白質(zhì)的源。飲食蛋白質(zhì)可以是任一合適的飲食蛋白質(zhì)；例如動(dòng)物性蛋白質(zhì)(例如乳 蛋白質(zhì)、肉類蛋白質(zhì)或者蛋類蛋白質(zhì))；植物性蛋白質(zhì)(例如大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、 稻蛋白質(zhì)和豌豆蛋白質(zhì))；游離氨基酸的混合物；或者它們的組合物。乳蛋白質(zhì)例如酪 蛋白、乳清蛋白和大豆蛋白質(zhì)是特別優(yōu)選的。組合物也可以包含碳水化合物的源和/或脂肪的源。如果本發(fā)明的組合物是營養(yǎng)組合物并包括脂肪源，脂肪源優(yōu)選地提供營養(yǎng)組合 物的能量的大約5%至大約55%;例如能量的大約20%至大約50%。組成脂肪源的脂類 可以是任一合適的脂肪或者脂肪混合物。植物性脂肪是特別合適的；例如大豆油、棕櫚 油、椰子油、紅花油、葵花油、玉米油、菜籽油、卵磷脂等。動(dòng)物性脂肪例如乳脂肪如 果需要也可以添加?？梢詫㈩~外的碳水化合物的源添加到營養(yǎng)組合物中。它優(yōu)選地提供營養(yǎng)組合物 的能量的大約40%至大約80%?？梢允褂萌我缓线m的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡 萄糖、果糖、玉米糖漿固形物、麥芽糖糊精或者它們的混合物。如果需要也可以添加額外的飲食纖維。如果添加，其優(yōu)選地包含直到營養(yǎng)組合 物的能量的大約5%。飲食纖維可以來自任一合適的來源，包括例如大豆、豌豆、燕麥、 果膠、瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、果寡糖或者它們的混合物。合適的維生素和礦物質(zhì)也可以以滿足適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)則的量包含于營養(yǎng)組合物中。如果需要，可以將一種或多種食品級(jí)乳化劑包括于營養(yǎng)組合物中；例如單和雙 甘油酯的雙乙酰酒石酸酯、卵磷脂和單或雙甘油酯或者它們的混合物。也可以包括類似 合適的鹽和/或穩(wěn)定劑。調(diào)味料也可以加入到組合物中。施用時(shí)期施用時(shí)期從受精開始或者盡可能早地在受精后(分別地為在準(zhǔn)母親意識(shí)到她懷 孕后)施用。然而，施用時(shí)期也可以更早開始。例如，施用時(shí)期可以先于受精1或2個(gè) 月。在這種情況下，相信受精準(zhǔn)母親的健康狀態(tài)對(duì)準(zhǔn)后代(offspring-to-be)的健康狀態(tài) 具有影響。施用的時(shí)期也可以在懷孕期間相對(duì)晚的開始，優(yōu)選地在懷孕的第3、第5或者 第7月(當(dāng)考慮是人類女性時(shí))或者與其它哺乳動(dòng)物相對(duì)應(yīng)的時(shí)期。也可以考慮非常晚 地開始組合物的施用，即在或者大約在第8或第9月(出生前幾周)。在這種情況下，推測對(duì)后代的免疫系統(tǒng)的作用是短期和快速的作用，最好在出生后就使它為暴露于抗原 做好準(zhǔn)備。施用的時(shí)期可以是連續(xù)的(例如一直到和包括哺乳期直到斷奶)，或者不連 續(xù)的。優(yōu)選地，為了更好的延長作用，施用的時(shí)期是連續(xù)的。然而，推測不連續(xù)的模式 (例如每月在一周期間每日施用)可以提供誘導(dǎo)對(duì)后代起積極的作用的“不連續(xù)的免疫加 強(qiáng)信號(hào)”。施用的持續(xù)時(shí)間可以不同。如果用相對(duì)短的施用持續(xù)時(shí)間預(yù)期得到了積極的 作用(例如一周或1月期間每日施用)，那么相信長的持續(xù)時(shí)間可以提供增強(qiáng)作用(例如 在人類中持續(xù)3月、5月或8月，和在其它哺乳動(dòng)物中相對(duì)應(yīng)的時(shí)期)。優(yōu)選地施用時(shí)期 覆蓋妊娠期的基本全長。在一個(gè)實(shí)施方案中，其覆蓋了妊娠期的多于50%、多于70%或 者多于80%。施用的持續(xù)時(shí)間也可以覆蓋整個(gè)或部分哺乳期。最優(yōu)選地，它也覆蓋了哺 乳期的全長。持續(xù)時(shí)間可以覆蓋哺乳期的0%、30%或更長、50%或更長或者80%或更 長。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，組合物的施用時(shí)期可以覆蓋哺乳期(它的整個(gè)或部分) 但不覆蓋妊娠期；在那樣的情況下，組合物的益處通過雌性的乳汁傳輸給后代。最優(yōu)選 的施用時(shí)期覆蓋部分(或者整個(gè))妊娠期和部分(或者整個(gè))哺乳期。優(yōu)選的施用是每 日攝入(每天服用一次或兩次)，或者每周攝入(每周服用一次或兩次)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果母親在妊娠期接受了組合物，組合物也可以直接地施 用給后代。優(yōu)選地，組合物是在哺乳期期間或者在部分或完全斷奶后直接施用，最優(yōu)選 的是經(jīng)口施給后代。將母親(在妊娠期期間)和后代(直接的施用)雙重暴露給組合物確 實(shí)可以以協(xié)同的方式提供增強(qiáng)的益處。推測在妊娠期期間的暴露誘導(dǎo)了后代的預(yù)適應(yīng)， 以更好的對(duì)后來的直接施用作出反應(yīng)。組合物的作用將本發(fā)明的組合物施用給懷孕的雌性哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)了后代的免疫性的加強(qiáng)。那 種加強(qiáng)在出生后但是也可以在妊娠期期間開始是尤其可測量的。特別地，本文中所用的術(shù)語“加強(qiáng)免疫”排除了過敏性反應(yīng)。術(shù)語“加強(qiáng)免 疫”定義為加強(qiáng)先天免疫功能和促進(jìn)特異的針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。先天免疫應(yīng)答可以是 細(xì)胞應(yīng)答、吞噬活性、白細(xì)胞活性和/或多反應(yīng)性抗體。特異的免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞活 化和/或特異的抗體反應(yīng)。術(shù)語“加強(qiáng)免疫”可以包含或者可以定義為增強(qiáng)身體的免疫 防御和/或增強(qiáng)身體對(duì)感染性抗原的攻擊的應(yīng)答的能力。所述抗原的攻擊可以是病毒的 和/或細(xì)菌的和/或寄生蟲物質(zhì)或者它們的抗原衍生物、亞單位、細(xì)胞表面化合物和/或在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物強(qiáng)化了從所述雌性到所述后代的 免疫能力 的傳輸。這樣，組合物能給后代提供更好的機(jī)會(huì)來經(jīng)受住他們生命早期的攻擊。最后， 組合物幫助后代一生中具有最好的開始和/或更好的抗感染的保護(hù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該種加強(qiáng)作用是后代針對(duì)抗原暴露的應(yīng)答的能力增加。在 出生時(shí)，嬰兒的免疫系統(tǒng)是處于能使他們對(duì)抗原暴露做出合適的應(yīng)答的狀態(tài)和處于快速 成熟的狀態(tài)這二種狀態(tài)。暴露于抗原也參與了增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的成熟。出生后，所有嬰兒 都自然地暴露于環(huán)境的或病原的抗原。后代的免疫系統(tǒng)對(duì)該種暴露做出應(yīng)答。在本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方案中，后代的免疫系統(tǒng)能以更有效的方式對(duì)暴露于抗原作出應(yīng)答。在一個(gè) 實(shí)施方案中，對(duì)抗原暴露作出的應(yīng)答可以通過特異地針對(duì)所述抗原的抗體的量來進(jìn)行測 量。在本發(fā)明的上下文中，可以測量特異性抗體的定量以及定性升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，該種升高可以在暴露于抗原的后代的血清中和/或唾液中和/或糞便中測量。在一 個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)抗原暴露的應(yīng)答包含全部多反應(yīng)性抗體的升高，優(yōu)選地在后代的血 清中和/或唾液中和/或糞便中。在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)抗原暴露的應(yīng)答包含在后代 的血液中細(xì)胞免疫應(yīng)答的升高，優(yōu)選地是所述后代的白細(xì)胞的數(shù)量的增加和/或活性的 增強(qiáng)(為了說明，參見實(shí)施例2的結(jié)果)。應(yīng)當(dāng)理解，應(yīng)答的類型高度取決于暴露的類 型，盡管一些抗原可以誘導(dǎo)可通過多于一種的上述引用作用(例如特異抗體的升高和多 反應(yīng)性抗體的升高，和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的升高)測量的復(fù)雜的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的 測量可以通過常規(guī)已知的免疫測定方法來進(jìn)行，例如細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗體測定、吞噬活性以 及細(xì)胞毒性細(xì)胞活性(中性粒細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞活性)、免疫標(biāo)志物的量，包括細(xì)胞因 子、生長因子以及細(xì)胞表面免疫標(biāo)志物等。升高是針對(duì)來自下述后代的相應(yīng)樣品(=對(duì) 照樣品)中的水平來測量的，所述后代的母親沒有暴露于本發(fā)明的組合物。 在本發(fā)明的上下文中，特別相關(guān)的抗原性暴露包括但不限于暴露于病毒，優(yōu)選 的是輪狀病毒和腺病毒，或者暴露于感染性細(xì)菌，優(yōu)選的是大腸桿菌(Escherichia coli)、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、沙門氏菌屬(salmonellae)、梭菌屬(Clostridia)、志賀氏桿菌 屬(shigella)，或者暴露于感染性寄生蟲感染，優(yōu)選的是蘭伯氏賈第蟲(Giardia lamblia)、 痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica)和隱孢子蟲(Cryptosporidium spp)，或者它們的混合 物。對(duì)嬰兒顯示出更好的能力來對(duì)此種病原性暴露作出應(yīng)答的健康狀態(tài)是特別感興趣 的。這可以參與更好的保護(hù)后代對(duì)抗這些病原體，并最終更好的保護(hù)他們抵抗由這些病 原體誘導(dǎo)的相應(yīng)感染。更一般地，它可以參與更好的保護(hù)后代對(duì)抗許多類型的病原體 (=總體上增強(qiáng)的免疫系統(tǒng))。對(duì)過敏的積極作用也可以考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因?yàn)閷?duì) 免疫系統(tǒng)起的作用可以是對(duì)過敏原作出的更平衡和更好控制的應(yīng)答。對(duì)后代的免疫系統(tǒng)的加強(qiáng)作用可以在哺乳期時(shí)期，或者幼年期/童年期時(shí)期達(dá) 到最大。對(duì)于人類，加強(qiáng)的最大值優(yōu)選地獲得于出生(第O天)和生命的第24個(gè)月之 間，更優(yōu)選地在出生(第O天)和生命的第180天之間。在...之內(nèi)并不排除加強(qiáng)作用可 以持續(xù)直到后代生命的成年早期時(shí)期。對(duì)于非人類哺乳動(dòng)物，應(yīng)當(dāng)考慮相應(yīng)的時(shí)期?，F(xiàn)通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)施例1，小鼠研究1材料和方法在所有實(shí)驗(yàn)中使用常規(guī)的六周齡大的雌性BALB/c小鼠 (18-20g), 購 自 Charles River (Domaine des Oncins，BP 010969592, L，Arbresle Cedex,法國)。將小鼠在特定的無病原體條件下安置于CliniqueMedical Universitaire of Geneva (CMU-Geneva)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，并且將來自每窩的6至8只嬰兒小鼠分批成每一研究組別。動(dòng)物自由獲得正規(guī)的常規(guī)飲食。懷孕的小鼠接受懸浮于飲用水中的益生菌劑或 安慰劑粉末。每天更換飲用水。將三組進(jìn)行對(duì)比-組別A對(duì)照(麥芽糖糊精)-組別B副干酪乳桿菌CNCM1-2116 (STll)-組別C鼠李糖乳桿菌CGMCC1.3724 (LPR)所有產(chǎn)品都獲自通常的公共來源。名稱“ST11”和“LPR”是引用的微生物 的簡稱或別名。
麻疹減毒活疫苗(MV-S)購自Aventis-Pasteur(Lyon，法國)。測量 -根據(jù)標(biāo)準(zhǔn),在 University Medical center of Geneva (瑞士)的 Centerfor vaccinology and Neonatal Immunology(CVNI)通過ELISA進(jìn)行針對(duì)麻疹病毒的抗體(IgGl和IgG2a同
種型)和全部血清IgG的測定。實(shí)驗(yàn)過程(圖1提供了該過程的示意圖)1.在懷孕期間和斷奶期間將每組的4只懷孕小鼠接受含有A、B或C的飲用水。2.從斷奶(3周)起，所有幼崽都接受無任一添加物的常規(guī)水。將母親處死。3.在第3周(嬰兒免疫)，將幼崽(每窩5-8只幼崽；每組28只幼崽)用麻疹 減毒活疫苗(5 X IO5CCID5tl)免疫。4.每周監(jiān)測幼崽的體重增加(從3至8周齡)，并每周收集一次糞便(從3至8 周齡)。5.免疫后3周和5周，將幼崽取血用于測定總的IgG和麻疹特異的IgGl和IgG2a抗體。6.免疫后5周，將所有小鼠處死。為了評(píng)價(jià)不同的麻疹疫苗，應(yīng)用Krsukal-Wallis檢驗(yàn)然后 Mann-Withney (Wilcoxon)檢驗(yàn)。結(jié)果圖2提供了獲得的結(jié)果的圖表說明。鑒定了對(duì)新生兒的生長沒有作用。 沒有觀察到與窩別、性別、或具體的體重相關(guān)的疫苗應(yīng)答的差別。在所有組別中觀察到 了在麻疹疫苗接種后抗體應(yīng)答的顯著增加，反映了正常抗體成熟過程。在所有組別中觀 察到了通過良好平衡的IgGl和IgG2a水平來說明的以混合的Thl:Th2應(yīng)答為特征的免疫 應(yīng)答。用STll補(bǔ)充的母親對(duì)針對(duì)麻疹疫苗的幼崽的應(yīng)答沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著影響(在測 試條件下)。然而，與沒有改變對(duì)麻疹疫苗應(yīng)答的一般免疫譜的對(duì)照相比較，LPR補(bǔ)充 的懷孕母親促進(jìn)了更高的IgG滴度。結(jié)論這些結(jié)果似乎表明作用是益生菌菌株特異的。事實(shí)上，STll對(duì)幼崽的腸 免疫成熟和針對(duì)麻疹疫苗的應(yīng)答似乎只具有很小的作用。相反，LPR補(bǔ)充的懷孕母親在 年輕的成年小鼠中促進(jìn)了針對(duì)麻疹疫苗的增加的外周IgG應(yīng)答。實(shí)施例2，小鼠研究2材料和方法在所有實(shí)驗(yàn)中使用常規(guī)的六周齡大的懷孕雌性BALB/c小鼠 (18-20g)，購自Janvier，法國。將小鼠在特定的無病原體條件下安置于NestMresearch Center動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，并且將來自每窩的10至12只幼崽分批成每一研究組別。動(dòng)物自由獲得正規(guī)的常規(guī)飲食。懷孕的小鼠接受懸浮于飲用水中的益生菌劑或 安慰劑粉末。每天更換飲用水。將兩組進(jìn)行對(duì)比-組別A對(duì)照(麥芽糖糊精)-組別B 乳雙歧桿菌 CNCMI-3446 (BL)所有產(chǎn)品都獲自通常的公共來源。名稱“BL”是引用的微生物的縮寫。破傷風(fēng)類毒素疫苗，TetanolPur (40UI)購自 Novartis (瑞士)。測量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟在抗CD3抗體存在下進(jìn)行脾T細(xì)胞增殖的測定。簡而言之，在37°C在96孔板中，將脾細(xì)胞與結(jié)合了抗小鼠CD3的平板(2.5 μ g/ml在37°C孵育2小時(shí)， BD Pharmingen,目錄號(hào) 553056)孵育 72 小時(shí)。通過(DeCicco，K丄.，Youngdahl, J.D.和 Ross, A.C.2001 Immunologyl04, 341-348)所述的摻入[甲基 _3H]胸腺嘧啶(Amersham PharmaciaBiosciences)來測定細(xì)胞增殖。數(shù)據(jù)表示為每分鐘的計(jì)數(shù)，通過實(shí)際上存在于測 試的小鼠的脾中的CD3陽性細(xì)胞的百分比來歸一化。對(duì)破傷風(fēng)類毒素特異的血清IgG抗體的量通過ELISA來進(jìn)行。簡而言之，將96 孔微滴定板用在PBS中的0.1 μ g全TT抗原(Calbiochem，破傷風(fēng)類毒素來自破傷風(fēng)梭菌 (Clostridium tetani)，目錄號(hào)582231)包被。用PBS-0.05 %吐溫20洗滌3次后，將平板 用PBS-20% FCS-0.05%吐溫20緩沖液在37°C封閉1小時(shí)，并然后再洗滌3次。將在封 閉緩沖液中連續(xù)稀釋的小鼠血清在37°C孵育2小時(shí)。洗滌3次后，通過與生物素綴合的 山羊抗小鼠IgG抗體(SouthemBiotech，目錄號(hào)SouthernBiotech)在37 °C孵育1小時(shí)來檢 測結(jié)合了 TT的特異IgG。洗滌3次后，將ELISA平板用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素 (KPL,目錄號(hào)14-30-00)在37°C孵育30分鐘。在3次最后的洗滌步驟后，加入過氧化 物酶底物(KPL，目錄號(hào)50-76-00)。用硫酸阻止比色反應(yīng)，并然后在分光光度計(jì)中測量 在450nm處的光密度。然后如上所述計(jì)算抗體滴度(Ma，Y.和Ross，A.C.，2005，Proc Natl Acad Sci.2005 年 9 月 20 日；102(38) 13556-61)。實(shí)驗(yàn)過程(圖3提供了該過程的示意圖)
1.在懷孕期間和哺乳期的最初兩周期間，將每組的2至3只懷孕小鼠接受含有安 慰劑或BL的飲用水。2.從斷奶(3周)起，所有幼崽都接受無任一添加物的常規(guī)水。將母親處死。3.在第3周，將每組中的幼崽亞組(每組5-6只幼崽)處死以評(píng)估脾細(xì)胞增殖。4.在第3周(嬰兒免疫)，將剩下的幼崽(每組5-6只幼崽)用TT疫苗皮下免 疫(人類劑量的1/4)。5.第一次免疫后4周，向幼崽施用疫苗加強(qiáng)。6.將幼崽在第一次免疫后4周和加強(qiáng)后2周取血用于測定抗TT IgG抗體，然后 處死小鼠。為了評(píng)價(jià)T細(xì)胞增殖和TT疫苗的差異，應(yīng)用了 Mann-Withney (Mann-Withney)檢驗(yàn)。結(jié)果圖4顯示，在所有組別中，TT疫苗接種后抗體應(yīng)答顯著的增加，反映了 正?？贵w成熟過程。在妊娠期和哺乳期期間用BL補(bǔ)充的母親對(duì)比安慰劑促進(jìn)了更高的全 身性T細(xì)胞反應(yīng)性并顯著地增強(qiáng)了 IgG滴度。結(jié)論實(shí)施例1和2的兩個(gè)研究強(qiáng)調(diào)了通過圍產(chǎn)期干預(yù)，特別是通過在妊娠期和 哺乳期用益生菌劑補(bǔ)充母親可能促進(jìn)后代的免疫發(fā)育的事實(shí)。如研究1所表明，這種作 用是菌株特異的，然而，它們似乎并不是種特異的。事實(shí)上，給妊娠期的母親補(bǔ)充LPR 或BL似乎促進(jìn)了后代中更高的免疫成熟。
權(quán)利要求
1.益生菌劑的用途，用于制備施用給懷孕的雌性哺乳動(dòng)物的組合物，以加強(qiáng)她們的 后代出生后的免疫性。
2.權(quán)利要求1所述的用途，用于加強(qiáng)所述后代的先天免疫功能和/或促進(jìn)針對(duì)感染性 抗原的特異性免疫應(yīng)答。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物強(qiáng)化了免疫能力從所述雌性 向所述后代的傳輸。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述益生菌劑選自雙歧桿菌 屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球 菌屬(Enterococcus)和酵母屬(Saccharomyces)或它們的混合物，優(yōu)選地選自長雙 歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、嗜酸乳桿 菌(Lactobacillus acidophilus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、鼠李糖乳桿 菌(Lactobacillusrhamnosus)、畐U 干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、約漢遜氏乳 桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantaram)、唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、或者它們的混合物。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述益生菌劑選自鼠李糖乳桿菌 CGMCC 1.3724、乳雙歧桿菌CNCM 1-3446、長雙歧桿菌ATCC BAA-999、約漢遜氏乳桿 菌CNCM 1-1225、發(fā)酵乳桿菌VRI003、長雙歧桿菌CNCM 1-2170、長雙歧桿菌CNCM 1-2618、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve) Bb_03、短雙歧桿菌M-16V、短雙歧桿菌 R0070、副干酪乳桿菌CNCM 1-1292、鼠李糖乳桿菌ATCC 53103、屎腸球菌SF 68、和它 們的混合物。
6.權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述益生菌劑是鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.3724或乳雙歧桿菌CNCM 1-3446、或者它們的組合物。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述雌性哺乳動(dòng)物是人類。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物是經(jīng)口地施用給所述雌性， 優(yōu)選地以食物、飲料、飲食添加物或藥物組合物施用。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物是在施用期期間施用的，所 述施用期包含所述雌性的部分妊娠期。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述施用期包含所述后代的部分哺乳期。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述施用期包含部分所述妊娠期和部分 所述哺乳期。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物包含進(jìn)一步的成分或益生 素，優(yōu)選地選自菊粉、果寡糖(F0S)、短鏈果寡糖(短鏈F0S)、半乳寡糖(G0S)、木寡 糖(XOS)、神經(jīng)節(jié)苷脂、部分水解的瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、大豆膠、乳枸杞、枸杞提 取物或它們的混合物。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述免疫加強(qiáng)包含增加后代對(duì)抗原性暴 露的應(yīng)答的能力。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中對(duì)所述抗原性暴露的所述應(yīng)答包含針對(duì)所述抗原的特異性抗體的升高，所述特異性抗體優(yōu)選地在所述后代的血清中和/或唾液 中和/或糞便中。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中對(duì)所述抗原性暴露的所述應(yīng)答包含總的 多反應(yīng)性抗體的升高，所述總的多反應(yīng)性抗體優(yōu)選地在所述后代的血清中和/或唾液中 和/或糞便中。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中對(duì)所述抗原性暴露的所述應(yīng)答包含在所 述后代的血液中細(xì)胞免疫應(yīng)答的升高，優(yōu)選的是所述后代的白細(xì)胞的數(shù)量的增加和/或 活性的增加。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述抗原性暴露包含暴露于病毒，優(yōu)選 的是輪狀病毒和腺病毒，或者暴露于感染性細(xì)菌，優(yōu)選的是大腸桿菌(Escherichia coli)、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、沙門氏菌屬(salmonellae)、梭菌屬(Clostridia)、志賀氏桿菌 屬(shigella)，或者暴露于感染性寄生蟲感染，優(yōu)選的是蘭伯氏賈第蟲(Giardia lamblia)、 痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica)和隱孢子蟲(Cryptosporidium spp)，或者它們的混合 物。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中對(duì)所述抗原性暴露的所述增加的應(yīng)答 能力有助于更好地保護(hù)所述后代在生命早期抵抗感染，優(yōu)選的所述感染包含病毒感染， 例如輪狀病毒感染和腺病毒感染，或者細(xì)菌感染，例如大腸桿菌感染、霍亂弧菌感染、 沙門氏菌屬感染、梭菌屬感染、志賀氏桿菌屬感染，或者寄生蟲感染，例如蘭伯氏賈第 蟲、痢疾阿米巴和隱孢子蟲感染。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述免疫加強(qiáng)在所述哺乳期期間，或者 在所述后代的幼年期，優(yōu)選地在出生(第O天)和生命的第24月之間，更優(yōu)選地在出生 (第O天)和生命的第180天之間達(dá)到其最大。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物在哺乳期期間或者在完全或 部分?jǐn)嗄毯筮M(jìn)一步施用給所述后代。
全文摘要
本發(fā)明涉及益生菌劑在懷孕的雌性哺乳動(dòng)物中加強(qiáng)后代的免疫狀態(tài)的用途。該用途可以誘導(dǎo)后代在出生后對(duì)感染性抗原暴露的增強(qiáng)應(yīng)答。最終，益生菌劑在懷孕的雌性中的使用可以誘導(dǎo)對(duì)后代更好的抗感染性疾病的保護(hù)。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102014673SQ200980116112
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者F·羅沙, J·本雅各布, S·布蘭-斯佩里森, 德 韋德 T·馮 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司