專利名稱：免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鑒定、生產(chǎn)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫原性降低的新葡激酶衍生物，它們能通過連續(xù)輸注或單次靜脈內(nèi)大劑量注射施用，涉及它們的鑒定、生產(chǎn)和在治療動脈血栓形成中的應(yīng)用，涉及用于治療動脈血栓形成的藥用組合物的制備。本發(fā)明更特別地涉及基因工程葡激酶衍生物在制備治療心肌梗塞的藥用組合物中的應(yīng)用。
葡激酶，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些株產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，在超過40年前就證明其具有纖維蛋白溶解特性(1，2)，似乎成為急性心肌梗塞患者中的強(qiáng)溶栓劑(3，4)。已經(jīng)從噬菌體sakΦC(5)和sak42D(6)中以及從溶原性金黃色葡萄球菌株的基因組DNA(sakSTAR)中(7)克隆了葡激酶基因。葡激酶基因編碼一種163個氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基酸28對應(yīng)于全長成熟葡激酶的NH2端殘基(6，8，9)。

圖1顯示了野生型變體SakSTAR的成熟蛋白質(zhì)序列(9)。在sakΦC、sak42D和sakSTAR基因的編碼區(qū)中只發(fā)現(xiàn)了四個核苷酸差異，其中之一構(gòu)成沉默突變(6，8，9)。在血漿環(huán)境中，葡激酶能夠溶解纖維蛋白凝塊而沒有相關(guān)的纖維蛋白原降解(10-12)。葡激酶的這種纖維蛋白特異性是α2-抗纖溶酶對與纖維蛋白結(jié)合的纖溶酶。葡激酶復(fù)合物抑制降低、α2-抗纖溶酶抑制后葡激酶從纖溶酶。葡激酶復(fù)合物中的再循環(huán)、以及α2-抗纖溶酶防止循環(huán)纖溶酶原。葡激酶轉(zhuǎn)化為纖溶酶。葡激酶的結(jié)果(13-15)。另外，葡激酶對循環(huán)纖溶酶原具有弱親和力，但對纖維蛋白原結(jié)合的纖溶酶原具有高親和力(16)，葡激酶需要纖溶酶的NH2端加工來顯示其纖溶酶原激活能力(17)。在幾種實驗動物模型中，葡激酶在全血或血漿凝塊的溶解方面與鏈激酶似乎是同等的，但在富含血小板或回縮的血栓溶解方面明顯強(qiáng)于后者(18，19)。葡激酶是一種異源蛋白質(zhì)，在人中是有免疫原性的。葡激酶的固有的免疫原性，象鏈激酶一樣，顯然阻礙了其非限制性應(yīng)用。不僅先前存在高抗體效價的患者難以用這些藥劑的溶栓作用治療，而且可能發(fā)生變應(yīng)性副作用和偶然的危及生命的過敏反應(yīng)(20)。因為鏈激酶和葡激酶都是異源蛋白質(zhì)，所以顯然它們的免疫原性不能通過蛋白質(zhì)工程降低。實際上，未曾報道過從鏈激酶產(chǎn)生活性低分子量片段的成功嘗試。對于葡激酶，NH2端17個氨基酸或COOH端2個氨基酸的缺失使分子失活，另外它對位點專一誘變滅活是極敏感的(21)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供優(yōu)選地具有較高比活和／或較低血漿清除率和／或增強(qiáng)的溶栓能力的葡激酶的低免疫原性變體。
在最終導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)野生型葡激酶變體SakSTAR(9)含有三個非重疊的優(yōu)勢免疫表位，其中至少兩個可被特殊定點誘變消除，而不滅活分子。這已在EP-95200023．0中公開(22)。正如在兔和狒狒模型中和在外周動脈阻塞患者中所證明的，這些工程化葡激酶變體與用野生型葡激酶治療的患者中產(chǎn)生的抗體是低反應(yīng)性的，并且比野生型葡激酶有明顯低的免疫原性(22)。
本發(fā)明涉及用于鑒定、生產(chǎn)和應(yīng)用與野生型葡激酶相比顯示降低的抗原性和免疫原性的葡激酶衍生物，及用于用聚乙二醇選擇性衍生的變體的總方法。這些衍生物優(yōu)選地具有較高的比活和／或較低的血漿清除率和／或增強(qiáng)的溶栓能力。這些衍生物基本上具有野生型葡激酶或其修飾形式的氨基酸序列和基本上完全的生物活性，但與一系列鼠單克隆抗體和／或與用野生型SakSTAR治療在患者中誘導(dǎo)的抗體的反應(yīng)性降低。聚乙二醇取代(“PEG 化”)的變體具有降低的血漿清除率，使其特別適用于單次靜脈內(nèi)大劑量施用。也能使用其它藥學(xué)可接受的大分子代替PEG。
更特別地，本發(fā)明提供葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其具有如圖1所示的氨基酸序列，其中位點35的Lys、位點36的Gly、位點65的Glu、位點74的Lys、位點80的Glu、位點82的Asp、位點102的Lys、位點108的Glu、位點109的Lys、位點121的Lys、位點130的Lys、位點135的Lys和／或位點136的Lys中的氨基酸被替換為其它氨基酸，和／或其中在COOH端添加一個氨基酸，從而改變了向患者施用后的免疫原性，而不明顯降低比活。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案是表1、3、4、5、6、7、8、B、19和20中列出的葡激酶衍生物，其具有如圖1所示的氨基酸序列，其中指定的氨基酸被替換為其它氨基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體的吸附，而不降低比活。
比活升高而免疫原性降低的衍生物是下列衍生物SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、saksTAR(E8OA)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K13OT，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
其中，編碼為SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和編碼為SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)是特別優(yōu)選的。
除了上述置換衍生物之外，本發(fā)明還涉及另外氨基酸被Cys置換的衍生物。這類置換可導(dǎo)致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增強(qiáng)的溶栓能力。當(dāng)用聚乙二醇取代衍生物時特別獲得降低的血漿清除率。
這些葡激酶衍生物的優(yōu)選實施方案是其中Cys被分子量可達(dá)20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾的衍生物。在特別的實施方案中，NH2端區(qū)10個氨基酸中選擇的氨基酸被置換為用分子量可達(dá)20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾的Cys。這些衍生物的特征在于以降低的劑量單次靜脈內(nèi)大劑量施用后明顯降低的血漿清除率和保持的溶栓能力。
更特別地，位點2或3的絲氨酸被置換為半胱氨酸，而該半胱氨酸已用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾。這些衍生物的優(yōu)選實施方案是如表20所示的SY161(S3C-MP5)、SY161(S3C-P10)、SY161(S3C-P20)、SY19(S3C-MP5)、SY19(S3C-SP5)、SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)、SY19(S3C-P20)、SY19(S3C-P10)。
半胱氨酸的存在使得能形成本發(fā)明的兩種葡激酶衍生物的二聚體。
本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的衍生物的方法，包括制備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段；對該DNA片段進(jìn)行體外定點誘變，將野生型氨基酸的一種或多種密碼子替換為另一種氨基酸的密碼子；在適當(dāng)?shù)妮d體中克隆突變的DNA片段；用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；在適于表達(dá)該DNA片段的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；將表達(dá)的葡激酶衍生物純化為均一的，和用聚乙二醇衍生該變體。
該DNA片段優(yōu)選地是質(zhì)粒pMEX602sakB(22，23)的453bpEcoRI-HindⅢ片段，體外定點誘變優(yōu)選地通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行。這種重疊延伸PCR優(yōu)選地用可獲得的或產(chǎn)生的野生型SakSTAR或SakSTAR變體作為模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)或Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)進(jìn)行(24)。
本發(fā)明也涉及包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的葡激酶衍生物與適當(dāng)賦形劑的藥用組合物，其用于動脈血栓形成的治療。含有低免疫原性葡激酶變體或“PEG 化”的葡激酶變體作為有效成分，用于治療人的動脈血栓形成或獸醫(yī)實踐的藥用組合物，可以采用粉末或溶液的形式，并可用于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或腸胃外施用。這些組合物的制備可通過將活性化合物與藥學(xué)可接受的中性賦形劑(如水性或非水性溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、去污劑、添加劑)結(jié)合(例如混合、溶解等)，另外，必要時與染料結(jié)合。
此外，本發(fā)明還涉及葡激酶衍生物治療動脈血栓形成尤其是心肌梗塞的用途，涉及葡激酶衍生物制備用于治療動脈血栓形成尤其是心肌梗塞的藥用組合物的用途。在上文和下文中，術(shù)語“衍生物”、“突變體”和“變體”可交換使用。
根據(jù)本發(fā)明，其它變體和改進(jìn)對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯然的。因此隨機(jī)誘變可能產(chǎn)生免疫原性降低和功能活性可能升高的其它變體，而缺失或置換為其它氨基酸可產(chǎn)生具有降低的免疫原性的其它變體。
本發(fā)明將在下列實施例中更詳細(xì)地證明，然而這不是意在限制本發(fā)明的范圍。在實施例中，參照下列附圖圖1．野生型葡激酶SakSTAR的蛋白質(zhì)序列。編號從成熟全長葡激酶的NH2端氨基酸開始。
圖2．對外周動脈阻塞患者動脈內(nèi)輸注SakSTAR(空心圓，n=9)、SakSTAR(K74A)(實心圓，n=11)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(空心正方形，n=6)后，中和活性(左圖)和抗施用試劑的特異IgG(右圖)的時程。數(shù)據(jù)表示中值和四分位數(shù)間距，單位為μg／ml。
圖3．野生型葡激酶、具有指定的氨基酸置換的SakSTAR的蛋白質(zhì)序列。
正方形單氨基酸置換；圓形組合的(2-3個)氨基酸向Ala的置換。
圖4．SakSTAR，(A)；SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(B)；SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，(C)；和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(D)的溫度穩(wěn)定性。(○)4℃；(●)20℃；(_)37℃；(_)56℃；(□)70℃。
圖5．對外周動脈阻塞患者動脈內(nèi)輸注SakSTAR(圓形，n=6)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)(正方形，n=6)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(三角形，n=6)后，中和活性(左圖)和抗施用試劑的特異IgG(右圖)的時程。數(shù)據(jù)表示中值和15-85百分范圍，單位為μg／ml。
實施例實施例1野生型葡激酶的表位作圖用BIAcore儀器(Pharmacia，Biosensor AB，Uppsala，瑞典)，經(jīng)實時生物特異性相互作用分析(BIA)，測定抗野生型SakSTAR的一系列15種鼠MAb(22)的表位特異性。如廠商推薦，用胺偶聯(lián)試劑盒(Pharmacia，Biosensor AB)如廠商推薦將這些MAb固定于Sencor Chip CM5的表面(25)。在6分鐘內(nèi)，以5μL／分鐘的流速，以在pH5．0的10mmol／L乙酸鈉中20μg／mL的濃度，從蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行固定。這導(dǎo)致5000-10000共振單位(RU)的抗體(相當(dāng)于0．035-0．07pmol／mm2)的共價連接。SakSTAR溶液在20℃下連續(xù)流動通過傳感器表面。溶于10mmol／LHEPES、3．4mmol／L EDTA、0．15mol／L NaCl和0．005％表面活性劑P20，pH7．2中的至少四個濃度的每種分析物(范圍，50nmol／L-50mol／L)在6分鐘內(nèi)以5μL／分鐘的流速注射到締合相中。然后將樣品替換為緩沖液，同樣是在6分鐘內(nèi)以5μL／分鐘的流速。每一循環(huán)后，傳感器芯片表面通過注射5μL 15mol／L HCl再生。表觀締合(kass)和表觀解離(kdiss)速率常數(shù)如另文(26)詳述由sensorgram得出，締合平衡常數(shù)(KA)計算為其比率。
野生型和變體SakSTAR與固定化的(insolubilized)MAb結(jié)合的平衡締合常數(shù)的測定(表1)得出107-108(mol／L)-1的表觀締合常數(shù)，這比以前對這些MAb與固定野生型SakSTAR結(jié)合獲得的表觀締合常數(shù)(22)低一到兩個數(shù)量級。如果固定MAb而非SakSTAR變體是固定化的，則可避免二價MAb的親合作用。該值確實極好地符合MAb的已知締合常數(shù)，因此在本發(fā)明中使用其“相反”過程。
在表中，標(biāo)明“變體”的列說明多種葡激酶衍生物，它們的識別方法是在括號中以單字母符號列出被置換的氨基酸，隨后是其在成熟葡激酶序列的位置號，再之后是單字母符號的替換氨基酸；列“Exp．”表明表達(dá)水平，單位為mg／L，列“比活”表明如實施例2所述的內(nèi)部單位(HomeUnit)的比活。標(biāo)識“17G11”、“26A2”等是指如參考文獻(xiàn)22所述可與指定的表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ結(jié)合的單克隆抗體。表位I可被抗體簇17G11、26A2、30A2、2B12和3G10識別，而表位Ⅱ可被抗體簇18F12、14H5、28H4、32B2和7F10識別，表位Ⅲ可被抗體簇7H11、25E1、40C8、24C4和1A10識別。人血漿“庫”表明最初16名和隨后10名通過SakSTAR治療免疫的患者的血漿庫，“亞庫B”表明吸附少于50％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)誘導(dǎo)抗體的三名患者的血漿庫，“亞庫C”表明吸附＞90％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)誘導(dǎo)抗體的三名患者的血漿庫(22)。
在表6、7和8中，也使用通過SakSTAR治療免疫的40名患者血漿的另一種庫(庫40)。實施例2葡激酶“帶電簇-丙氨酸”突變體的“丙氨酸-野生型”回復(fù)變體的構(gòu)建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合并血漿的吸附1．引言如上所述，野生型葡激酶(SakSTAR變體(9))含有三個非重疊的優(yōu)勢免疫表位，其中的兩個能通過兩個(K35A，E38A或E80A，D82A)或三個(K74A，E75A，R77A)帶電氨基酸簇被替換為Ala的特殊定點置換消除(22)。組合突變體SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，其中Lys35、Glu38、Lys74、Glu75和Arg77被替換為Ala，和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)，其中Lys74、Glu75、Arg77、Glu80和Asp82被替換為Ala(以前分別稱為SakSTAR．M3．8和SakSTAR．M8．9(22))，發(fā)現(xiàn)它們與抗三個優(yōu)勢免疫表位之中兩個的鼠單克隆抗體的反應(yīng)性降低，并且平均僅吸附用野生型SakSTAR治療的16名患者中產(chǎn)生的2／3的中和抗體(22)。在兔和狒狒的實驗血栓溶解模型中和在外周動脈阻塞患者中，這些突變體也誘導(dǎo)比野生型SakSTAR更少的抗體形成(22)。然而，它們的比活降低為野生型SakSTAR的大約50％，這將在這些化合物的臨床應(yīng)用方面受到一定程度的關(guān)注。
在提高活性和穩(wěn)定性而不喪失降低的抗體識別的嘗試中，研究了這些置換氨基酸中的一種或多種向野生型殘基系統(tǒng)回復(fù)的影響。構(gòu)建、純化并在比活、與一系列鼠單克隆抗體的反應(yīng)性、用野生型SakSTAR治療的患者血漿中抗體的吸附等方面表征了14個新突變體(表1)，本實施例因此集中于丙氨酸向以上所列SakSTAR的7種氨基酸即K35、E38、K74、E75、R77、E80和D82中的一個或多個野生型殘基的回復(fù)。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報道(22)。限制酶購自Pharmacia(Uppsala，瑞典)或Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)。T4 DNA連接酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和堿性磷酸酶從Boehringer Mannheim獲得。酶促反應(yīng)用供應(yīng)商建議的條件進(jìn)行。質(zhì)粒DNA用QIAGEN純化方案(Westburg，Leusden，荷蘭提供)分離。pMEX．602sakB(即pMEX．SakSTAR)如另文所述(23)構(gòu)建。SakSTAR、SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)如另文所述(22)產(chǎn)生并純化。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化用磷酸鈣法進(jìn)行。DNA測序用雙脫氧鏈終止反應(yīng)法和自動激光熒光A．L．F．TM(Pharmacia)進(jìn)行。顯色底物(S2403)L-焦谷氨?；?L-苯丙氨?；?L-賴氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽購自Chromogenix(比利時)。125I標(biāo)記的纖維蛋白原購自Amersham(UK)。本實施例中使用的其它所有方法都曾在以前描述(22，27)。3．表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以可獲得的或產(chǎn)生的SakSTAR變體作為模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷蘭)，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)(24)構(gòu)建編碼SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(E75A)的質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增兩個片段，第一個用引物5’-CAGGAAACAGAATTCAGGAG-3’從葡激酶基因的5’端開始到待誘變區(qū)(正向引物)，第二個用引物5’-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3’從相同區(qū)(反向引物)到葡激酶基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(qū)(引物未顯示)。然后用Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以新的無引物PCR將兩個純化片段裝配在一起。7個循環(huán)(94℃1分鐘，70℃1分鐘)后，通過向PCR反應(yīng)液中加入5’和3’末端引物(見上)并循環(huán)25次(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘)再擴(kuò)增延伸產(chǎn)物。純化終產(chǎn)物，用EcoRI和HindⅢ消化，并克隆到pMEX602sakB的相應(yīng)位點。編碼SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)的質(zhì)粒的裝配方法包括，用BpmI消化pMEX602sakB和pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，該酶在SakSTAR的K35和E38密碼子之間切開，并連接所需的片段。編碼SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)的質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括，用BpmI消化pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和pMEX．SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，并再連接所需的片段。編碼SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)的質(zhì)粒的構(gòu)建方法是，用pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)作為模板進(jìn)行兩個PCR，隨后是限制連接和向pMEX602sakB的再克隆。4．SakSTAR變體的表達(dá)和純化如下所述，從在LB培養(yǎng)基中[SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)和SakSTAR(E75A，D82A)或在優(yōu)質(zhì)肉湯(TB)(28)培養(yǎng)基中[SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)和SakSTAR(D82A)]生長的轉(zhuǎn)化大腸桿菌WK6中表達(dá)并純化SakSTAR變體。
對于LB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的衍生物，用20mL等份過夜飽和培養(yǎng)物接種2L體積的含100μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。37℃溫育3小時后，加入IPTG(200μmol／L)誘導(dǎo)從tac啟動子開始的表達(dá)。生產(chǎn)階段可進(jìn)行4小時，之后以4000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／20體積(100mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸緩沖液中，并通過在0℃超聲處理破碎。20000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘除去細(xì)胞碎片，將含有胞質(zhì)可溶蛋白質(zhì)部分的上清液貯存于-20℃直到純化。
對于TB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的衍生物，用4mL等份過夜飽和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)物接種2L含100μg／mL氨芐青霉素的優(yōu)質(zhì)肉湯培養(yǎng)液。在30℃劇烈通氣下培養(yǎng)該培養(yǎng)物20小時。離心沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／10體積(200mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸緩沖液中，并通過在0℃超聲處理破碎。然后以20000轉(zhuǎn)每分離心懸液20分鐘，將上清液貯存于-20℃直到純化。含有SakSTAR變體的澄清細(xì)胞裂解液在1．6×6cm SP-Sephadex柱上進(jìn)行層析，隨后在1．6×5cm Q-Sepharose柱上層析[變體SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)]，或在1．6×6cm苯基-Sepharose柱上層析[變體SakSTAR(K35A，E38A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)]。合并經(jīng)SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用于進(jìn)一步分析。5．物理化學(xué)和生物化學(xué)分析根據(jù)Bradford(29)測定蛋白質(zhì)濃度。SakSTAR溶液的比活用顯色底物試驗測定，該試驗用80μL SakSTAR溶液和如另文所述(30)制備的100μL Glu-纖溶酶原溶液的混合物(終濃度0．5μmol／L)在微量滴定板中進(jìn)行。37℃溫育30分鐘后，通過加入20μL S2403(終濃度1mmol／L)并測定405nm的吸光度定量產(chǎn)生的纖溶酶?；钚砸詢?nèi)部單位(HU)表示，比較根據(jù)氨基酸組成測定(7)，每mg蛋白質(zhì)推定100，000HU(100kHU)活性的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(lot STAN5)。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍(lán)染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進(jìn)行SDS-PAGE。通過在1％ SDS和1％二硫蘇糖醇存在下于100℃加熱3分鐘進(jìn)行樣品的還原。用顯色底物試驗測定的不同SakSTAR突變體的比活總結(jié)于表1中。6．與鼠單克隆抗體的結(jié)合與以前的發(fā)現(xiàn)(22)一致，SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不與識別表位Ⅰ的5種MAb中的4種反應(yīng)，而SakSTAR(K35A，E38A)不與識別表位Ⅲ的5種MAb中的3種反應(yīng)，SakSTAR(E80A，D82A)不與這5種中的4種反應(yīng)。這些降低的反應(yīng)性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)中累加。SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的降低的反應(yīng)性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)中完全保留，在SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(E75A)中大部分保留，但在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K74A)中保留很少，表明E75是識別SakSTAR表位I的4種MAb結(jié)合的主要貢獻(xiàn)者。然而，令人吃驚地，表位Ⅰ抗體與SakSTAR(E75A，D82A)的結(jié)合在由具有確定DNA序列的表達(dá)質(zhì)粒的兩種獨立制備中正常。表位Ⅲ的3種MAb與SakSTAR(K35A，E38A)的降低的反應(yīng)性需要K35和E38兩者，這用SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)，用SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A)，用SakSTAR(E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)得到證明。簇Ⅲ的4種MAb與SakSTAR(E80A，D82A)的降低的反應(yīng)性在SakSTAR(D82A)中保留，但在SakSTAR(E80A)中不保留。7．通過用野生型SakSTAR治療在患者中產(chǎn)生的抗體的吸附使用用SakSTAR治療(4，31)數(shù)周后獲得的16名急性心肌梗塞患者的血漿樣品。這些樣品的葡激酶中和活性如下測定。向300μL檸檬酸鹽人血漿和50μL緩沖液或待測血漿的混合液中加入漸增濃度的野生型或變體SakSTAR(50μL體積，含有0．2-1000μg／mL)，隨后立即加入100μL含有凝血酶(50NIH單位／mL)和CaCl2，(25mmol／L)的混合液。測定血漿凝塊溶解時間，并對SakSTAR部分的濃度作圖。從該曲線確定20分鐘后引起完全凝塊溶解的葡激酶部分的濃度。中和活性效價確定為待測血漿與緩沖液值之間的差，并以μg每mL待測血漿表示。另文(22)曾報道了個體患者的結(jié)果。對于本發(fā)明，制備三種血漿庫，一種來自于可獲得充足殘余血漿的10名患者，一種來自于用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附少于50％抗體的三名患者(亞庫B)，一種來自于用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％抗體的三名患者(亞庫C)。稀釋這些血漿庫(1／30-1／200)直到它們在BIAcore儀器中與SakSTAR置換芯片的結(jié)合總計達(dá)大約2000RU。用另外一系列兩倍稀釋液從該稀釋液中構(gòu)建抗體結(jié)合的校準(zhǔn)曲線。這些血漿庫用100nmol／L SakSTAR變體吸附10分鐘，測定與固定化SakSTAR的殘余結(jié)合。用校準(zhǔn)曲線以未吸附血漿的百分?jǐn)?shù)表示殘余結(jié)合。
結(jié)果總結(jié)于表1中。野生型SakSTAR吸附10名患者合并血漿中超過95％的結(jié)合抗體，用SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)觀察到不完全的吸附(＜60％)，但用SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)吸附幾乎是完全的。這些結(jié)果令人驚奇地證明，由于用野生型SakSTAR治療在患者中產(chǎn)生的抗體的大約40％在結(jié)合方面依賴于K74(表1)。用3名患者的合并血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＜50％的抗體(亞庫B)-的吸附證實了K74對于抗體識別的重要作用。如預(yù)期的，對于所有待測變體，用3名患者的合并血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％的抗體(亞庫C)-的吸附幾乎是完全的。實施例3SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)與SakSTAR在外周動脈阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比較1．體內(nèi)應(yīng)用的SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)的純化如上所述，變體SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K74A)的12-24L培養(yǎng)液(2L每批)在補加有100μg／mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并IPTG誘導(dǎo)，沉淀，重懸浮，超聲處理破碎并澄清。通過用另文(22，23)所述的緩沖系統(tǒng)在5×20cm SP-Sephadex柱、5×10cm Q-Sepharose柱和／或5×13cm苯基-Sepharose柱上層析純化這些化合物。然后在無菌Superdex 75上凝膠過濾該物質(zhì)，進(jìn)一步降低其內(nèi)毒素含量。合并含SakSTAR變體的級分，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為1mg／mL，并將該物質(zhì)通過0．22μm Millipore濾器過濾除菌。用來測定體內(nèi)應(yīng)用所需最終物質(zhì)的生物性質(zhì)的方法在以上和另文(22)中有描述。2．材料與方法如上所述測定血漿中的葡激酶中和活性?？乖禺愋訧gG和IgM抗體的定量基本如前所述(22)，用酶聯(lián)免疫吸附測定法在聚苯乙烯微量滴定板中進(jìn)行。在IgG測定中，每板包括親和特異性抗SakSTAR IgG抗體的稀釋曲線。這些抗體分離自從3名患者中獲得的血漿，方法是在用野生型SakSTAR溶栓治療后，在蛋白A-Sepharose和固定化的SakSTAR上層析，并用0．1mol／L甘氨酸-HCl，pH2．8洗脫結(jié)合的抗體。IgG制品的純度通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳確定。在IgM測定中，測定效價，效價被定義為492nm的吸光率等于1／640稀釋的合并血漿吸光率時的血漿稀釋度，并將其與治療前基線樣品的效價相比較(中值1／410，四分位數(shù)間距1／120-1／700)。3．溶栓能力在閉塞性血栓近端處或之中以2mg大劑量動脈內(nèi)施用野生型SakSTAR或變體SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，隨后對每組6-12名血管造影證實為外周動脈阻塞或少于120天持續(xù)時間的旁路移植患者以1mg／小時輸注(在某些患者中過夜降至0．5mg／小時)。給予書面承諾后研究患者，方案由Leuven大學(xué)的人類研究委員會批準(zhǔn)。包含和排除標(biāo)準(zhǔn)、聯(lián)合抗血栓治療(包括連續(xù)靜脈內(nèi)肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表2顯示了個體患者的有關(guān)基線特征。大多數(shù)PAO在股骨腘水平。包括兩個髂支架和8個移植物阻塞。8名患者顯示致殘性跛足，5名顯示慢性缺血性靜止痛，7名顯示亞急性缺血，7名顯示急性缺血。一名兩年前用SakSTAR治療的患者(POE)包括于SakSTAR(K74A)組中。該患者不包括于統(tǒng)計分析中。
表2也總結(jié)了各治療和結(jié)果。劑量6．0-25mg、持續(xù)時間4．0-23小時的動脈內(nèi)輸注在24名患者中誘導(dǎo)完全的再通，在3名患者中誘導(dǎo)部分再通。在17名患者中進(jìn)行補充的血管內(nèi)方法(主要是PTA)，在3名患者中在血栓溶解后進(jìn)行補充的重建血管手術(shù)。沒有患者者進(jìn)行重大的截肢術(shù)。在4名患者中發(fā)生了血管造影術(shù)結(jié)束后血栓形成的早期復(fù)發(fā)。除了5名需要輸血的患者之外(數(shù)據(jù)未顯示)，沒有出血并發(fā)癥，或者僅限于血管造影穿刺部位的輕度到中度血腫形成。未觀察到顱內(nèi)或內(nèi)臟出血。循環(huán)纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR部分輸注期間基本保持不變(數(shù)據(jù)未顯示)，證實葡激酶在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性。纖維蛋白片段D-二聚體水平的升高證明發(fā)生了明顯的體內(nèi)纖維蛋白消化。動脈內(nèi)肝素治療使aPPT水平延伸到可變范圍(數(shù)據(jù)未顯示)。4．抗體誘導(dǎo)抗體相關(guān)的SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG在基線時和在輸注后第一周內(nèi)較低(圖2)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達(dá)到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別為每mL血漿中和20μg SakSTAR(K74A)和2．4μg SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，這顯著低于用SakSTAR治療的患者中每mL中和93μg野生型SakSTAR的中值(根據(jù)Kruskal-Wallis分析，三組之間的差異為p=0．024，根據(jù)Mann-Whitney秩和檢驗，變體與野生型的差異分別為p=0．01和p=0．036)?？筍akSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG的水平在3-4周時升高到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別為270和82μg／mL血漿，這顯著低于用SakSTAR治療的患者中每mL血漿1800μg抗SakSTAR的中值(根據(jù)Kruskal-Wallis分析，三組之間的差異為p=0．024，根據(jù)Mann-Whitney秩和檢驗，變體與野生型的差異分別為p=0．07和p=0．05)。
抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgM的效價在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別從1／460和1／410的中值基線值升高到1周時1／510和1／450的中值，這顯著不同于用SakSTAR治療的患者中基線時1／320的中值和1周時1／640的中值。在施用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的患者中，2周時的相應(yīng)值為1／590和1／550，與使用SakSTAR的1／930沒有顯著性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。用SakSTAR治療誘導(dǎo)的抗體被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不完全吸附，這證實了K74、E75、R77表位的免疫原性和K74在抗該表位抗體結(jié)合中的顯性作用。用SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療誘導(dǎo)的抗體被SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)完全吸附，表明免疫不是由于Lys74置換為Ala產(chǎn)生的新表位，而是由于不同于K74、E75、R77表位的表位。
因此，本實施例說明，能產(chǎn)生具有降低的抗體誘導(dǎo)但有完整溶栓能力的葡激酶變體。用SakSTAR(n=9)、SakSTAR(K74A)(n=11)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=6)治療的26名患者的經(jīng)驗，加上以前用SakSTAR(n=7)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)(n=7)(31)治療的14名患者的經(jīng)驗，和用SakSTAR治療的24名患者的經(jīng)驗(32)，以及隨后在用SakSTAR(n=30)、SakSTAR(K74A)(n=12)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=7)治療的患者中的非隨機(jī)化經(jīng)驗(數(shù)據(jù)未顯示)，使得能最初估計用SakSTAR或具有改變的K74、E75、R77表位的變體[SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)]動脈內(nèi)治療引起的免疫普遍性。在由動脈內(nèi)施用SakSTAR的70名外周動脈阻塞患者獲得的2-4周后的中和活性數(shù)據(jù)顯示，56名患者(80％)具有中和＞5μg化合物／mL血漿的水平。在施用SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)的患者中，43名中的27名(63％)具有＞5μg化合物每mL血漿的中和活性水平。此差異在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的(根據(jù)Fisher精確檢驗，p=0．05)，表明K74、E75、R77表位是抗體誘導(dǎo)的主要決定簇。實施例4葡激酶的丙氨酸置換突變體的構(gòu)建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和用免疫患者合并血漿的吸附1．引言定點誘變適用于除“帶電氨基酸”之外的殘基，用來鑒定ⅰ)用一系列鼠Mab鑒定的屬于表位Ⅰ和Ⅲ的其它殘基，ⅱ)決定免疫患者抗血清吸附的氨基酸。由于功能表位通常包含多于一個的抗體結(jié)合所必需的氨基酸，所以這些表位中其它殘基的鑒定能導(dǎo)致顯示較低抗原性而保持野生型葡激酶的比活和溫度穩(wěn)定性的新組合衍生物的構(gòu)建，在本實施例中，描述了一個或至多兩個氨基酸(相鄰或緊接)被替換為丙氨酸的SakSTAR變體的構(gòu)建和表征。表3中列出了本實施例中描述的突變體。這些變體在大腸桿菌中表達(dá)、純化并對比活、與一系列鼠單克隆抗體的反應(yīng)性和野生型SakSTAR治療的患者血漿中抗體的吸附等方面進(jìn)行表征。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報道(22)，或在以下詳述。誘變模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應(yīng)按照供應(yīng)商建議進(jìn)行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質(zhì)粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)或BIO 101 RPM試劑盒(Vista，CA)分離。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞用眾所周知的磷酸鈣法制備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質(zhì)粒DNA進(jìn)行。聚合酶鏈反應(yīng)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶或Vent聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷蘭)進(jìn)行。構(gòu)建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經(jīng)很好地建立(22，27)。3．表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用pMEX．SakSTAR載體作為模板，按照廠商說明書，用Stratagene(La Jolla．美國)的Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒，構(gòu)建變體SakSTAR(Y17A，F(xiàn)18A)、SakSTAR(F104A)、SakSTAR(F111A)、SakSTAR(Y9A)、SakSTAR(Y91A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(I87A)、SakSTAR(I106A)和SakSTAR(I120A)。誘變寡核苷酸(未顯示)與選擇引物L(fēng)Y34 5’CAAAACAGCCGAGCTTCATTCATTCAGC一起使用，后者破壞位于pMEX．SakSTAR中葡激酶編碼基因3’的唯一HindⅢ位點，并使得能通過HindⅢ消化反選擇未突變的子代。HindⅢ位點的缺失在大多數(shù)情況中與存在用誘變寡核苷酸引入的希望突變有關(guān)。變體SakSTAR(I133A)的構(gòu)建方法是用位于sakSTAR基因5’端的引物818A(5’CAGGAAACAGAATTCAGGAG)和誘變引物L(fēng)Y58(5’TTCAGCATGCTGCAGTTATTTCTTTTCTGCAACAACCTTGG)對pMEX．SakSTAR質(zhì)粒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物(30循環(huán)94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)，用EcoRI和PstI消化，并連接于pMEXSakSTAR的相應(yīng)位點。變體SakSTAR(I128A)、SakSTAR(L127A)和SakSTAR(N126V)的構(gòu)建方法是用位于sakSTAR基因5’端的引物818A和誘變引物(未顯示)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。純化擴(kuò)增產(chǎn)物(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，用EcoRI和StyI消化，并連接于pMEXSakSTAR的相應(yīng)位點。
通過進(jìn)行兩個連續(xù)PCR反應(yīng)(30循環(huán)94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)構(gòu)建變體SakSTAR(F125A)。在第一個反應(yīng)中，用引物818A和誘變引物擴(kuò)增pMEX．SakSTAR的片段。然后在第二個PCR反應(yīng)中用該擴(kuò)增片段作為模板，用一種誘變引物進(jìn)一步延伸sakSTAR基因中存在的StyI位點下游的片段(對應(yīng)于SakSTAR的氨基酸130-131)。用EcoRI和StyI消化得到的產(chǎn)物，并將其連接于pMEX．SakSTAR的相應(yīng)位點。
編碼表3列出的其它所有變體的質(zhì)粒是用pMEX．SakSTAR或可獲得的編碼SakSTAR變體的質(zhì)粒作為模板，通過直接PCR或剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)(22)構(gòu)建的。PCR擴(kuò)增兩個片段(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，第一個從葡激酶基因的5’端開始(引物818A)到待誘變區(qū)(正向引物)，第二個用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(qū)(反向引物)到基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(qū)(引物未顯示)。然后用外部引物818A和818D在第二個PCR反應(yīng)中將兩個純化片段裝配在一起(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應(yīng)物中純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRI和HindⅢ消化，連接于pMEX．SakSTAR的相應(yīng)位點。對于每一構(gòu)建，通過對完整SakSTAR編碼區(qū)測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達(dá)和純化如下所述，從在優(yōu)質(zhì)肉湯(TB)培養(yǎng)基(28)中生長的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中表達(dá)并純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養(yǎng)基的過夜飽和培養(yǎng)物接種1-2L補加有100μg／mL氨芐青霉素的優(yōu)質(zhì)肉湯培養(yǎng)物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養(yǎng)物。溫育大約16小時后，向培養(yǎng)物中加入IPTG(200μmol／L)誘導(dǎo)從tac啟動子開始的表達(dá)。誘導(dǎo)3小時后，以4000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩沖液中，并通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘，上清液貯存于4℃或-20℃直到純化?；救缟纤?實施例2)純化該物質(zhì)含有SakSTAR變體的澄清細(xì)胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進(jìn)行層析，隨后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合并經(jīng)SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用于進(jìn)一步分析。5．物理化學(xué)和生物化學(xué)分析根據(jù)Bradford(29)測定蛋白質(zhì)濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍(lán)染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進(jìn)行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進(jìn)行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。不同SakSTAR變體的比活總結(jié)于表3中。6．SakSTAR變體與一系列鼠單克隆抗體的反應(yīng)性用來測定SakSTAR變體與一系列鼠單克隆抗體的反應(yīng)性的方法已在上文實施例1中描述。結(jié)果總結(jié)于表3中(該表的格式對應(yīng)于如實施例1所述的表1的格式)。比野生型葡激酶至少低10倍的表觀締合常數(shù)被認(rèn)為是顯著的，并在表中以黑體標(biāo)出。
為了獲得SakSTAR分子Ala置換變體性質(zhì)的全面情況，構(gòu)建、表達(dá)并純化了67個編碼一個或兩個相鄰氨基酸被Ala替換的變體的質(zhì)粒。與以前描述(22和實施例2)的35個帶電殘基-Ala置換變體一起，該分析覆蓋了SakSTAR中除Gly、Ala和Pro之外的所有殘基，如圖3所示。8種變體不能以純化形式獲得，主要是由于表達(dá)水平低，11種變體是無活性的，56種比活降低，27種具有保持的或升高的比活(≥100 KHU／mg)。從表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)中產(chǎn)生純化物質(zhì)的產(chǎn)量為16mg／L(中值，10-90百分范圍為4-41mg／L)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳一致顯示一條Mr≈16000的主帶，通常代表總蛋白質(zhì)的95％(未顯示)。
K35、N95、S103或K135替換為Ala產(chǎn)生比活≥200 kU／mg的變體。W66、Y73或E75替換為Ala降低了變體與表位簇I的≥3種抗體的反應(yīng)性，H43或V45替換為Ala降低了變體與表位簇II的3種抗體的反應(yīng)性，V32、K35、D82和K130替換為Ala降低了變體與表位簇III的≥3種抗體的反應(yīng)性。7．SakSTAR治療在患者中產(chǎn)生的抗體的吸附對于本實施例，使用如實施例2所述的三種血漿庫。用來評估野生型葡激酶和SakSTAR變體吸附SakSTAR治療患者中產(chǎn)生的抗體的方法在實施例2詳細(xì)描述。結(jié)果總結(jié)于表3中。野生型SakSTAR和本實施例中分析的大多數(shù)變體吸附10名患者合并血漿中超過95％的結(jié)合抗體，用SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)觀察到不完全吸附(＜60％)，前文已經(jīng)證明了Lys74對于抗體識別的重要作用(見實施例2)。該結(jié)果表明，Tyr73參與與Lys74相同的主要表位，或者另外，Tyr73的置換可間接誘導(dǎo)“K74表位”的結(jié)構(gòu)修飾。對于大多數(shù)待測變體，用3名患者的合并血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞95％的抗體(亞庫C，見實施例2)一的吸附幾乎是完全的。實施例5具有S34、G36和／或H43置換的葡激酶變體的構(gòu)建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合并血漿的吸附天然變體Sak42D在三個氨基酸處不同于SakSTAR，相當(dāng)于SakSTAR(S34G，G36R，H43R)。Sak42D的特征在于與表位簇Ⅱ和Ⅲ的某些鼠抗體的反應(yīng)性降低，SakSTAR治療患者血漿中抗體的吸附略微降低(表4)。SakSTAR中這些殘基的誘變表明，與表位簇Ⅲ和免疫患者血漿的降低的反應(yīng)性可能是由于G36R置換、H43R置換介導(dǎo)與表位簇Ⅱ的降低的反應(yīng)性，但對與免疫患者血漿的反應(yīng)性無影響，而S34A置換沒有影響。G36R置換能與K74R結(jié)合，但不能與K74A置換結(jié)合，而不明顯降低比活(表4)。實施例6具有K35、E65、Y73、K74、E80+D82、N95、K130、V132和／或K135置換的葡激酶變體的構(gòu)建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合并血漿的吸附根據(jù)實施例4中丙氨酸置換分析的結(jié)果，選擇K35、N95和K135進(jìn)行進(jìn)一步的分析，因為SakSTAR(K35A)、SakSTAR(N95A)和SakSTAR(K135A)具有增高兩倍的比活，選擇Y73和K74，因為SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)與表位簇I抗體的反應(yīng)性明顯降低，并且降低了通過SakSTAR治療而免疫的患者血漿抗體的吸附，選擇K35、E80+D82、K130和V132，因為SakSTAR(K35A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTkR(K130A)和SakSTAR(V132A)與表位簇Ⅲ抗體的反應(yīng)性降低。
在使活性／抗原性比成為最大的嘗試中，將這些氨基酸替換為Ala之外的氨基酸。如表5所總結(jié)的，K35置換為A、E或Q表明，SakSTAR(K35A)具有最值得關(guān)注的特性，Y73被F、H、L、S或W的置換不能挽回比活的明顯降低，K74證實了它在免疫患者血漿抗體結(jié)合中的重要作用，用SakSTAR(K74Q)和SakSTAR(K74R)獲得最佳比活／抗原性比。SakSTAR(E80A，D82A)優(yōu)于單殘基變體SakSTAR(E80A)或SakSTAR(D82A)，因為它與免疫患者血漿的反應(yīng)性略有降低。用E、G、K或R替換N95不能進(jìn)一步改進(jìn)SakSTAR(N95A)，它不能將升高的比活賦予含有K74A或K135R的變體。最后，SakSTAR(K130T)在比活方面優(yōu)于SakSTAR(K130A)，SakSTAR(V132R)優(yōu)于SakSTAR(V132A)。實施例7SakSTAR(K130T，K135R)和SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它氨基酸的組合變體的構(gòu)建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合并血漿的吸附在本實施例和下列實施例中，從SakSTAR治療幾周后的40名患者中制備另一種血漿庫(庫40)。來源于10名患者的原始庫進(jìn)一步被確定為庫10。如上及另文(22)所述定量葡激酶特異抗體的吸附。
SakSTAR(K130T，K135R)變體作為添加誘變的模板，因為它具有高比活，與表位簇Ⅲ抗體的結(jié)合和免疫患者血漿抗體的吸附適度降低(表6)。向模板中添加G36R、K74R或K74Q或兩者，不能明顯降低比活，降低與表位簇Ⅲ的單克隆抗體的反應(yīng)性(G36R置換)，降低免疫患者血漿抗體的吸附(K74R或K74Q置換)。SakSTAR(K130T，K135R)模板中E65A或E65Q與K74Q的組合使庫10和庫40抗體的吸附分別降低為50-60％左右，而不明顯降低比活。在SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)模板中選擇的氨基酸的添加置換不能再進(jìn)一步降低庫10和庫40的抗體吸附。令人驚訝地，用顯色底物試驗測定，K136被置換為A和在位點137中加入K導(dǎo)致比活明顯增高。
SakSTAR(E80A，D82A)和SakSTAR(K130T，K135R)模板的組合不影響比活，與表位簇III抗體的反應(yīng)性降低(表7)。因此，選擇SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)模板進(jìn)一步誘變。K74R以至K74Q的添加大大降低了與免疫患者血漿的反應(yīng)性。最后，向SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)模板中添加E65D或K35A或E65S產(chǎn)生具有完全比活的變體，它們只結(jié)合免疫患者合并血漿中≤45％的抗體，和超過50％與K74、E75、R77表位反應(yīng)的亞庫不到15％。實施例8選擇的葡激酶變體的表征，其具有完整的比活和用野生型SakSTAR治療在患者中產(chǎn)生的SakSTAR特異性合并人抗體的低于50％的吸附1．引言在上述實施例中構(gòu)建并表征的23種變體具有以下兩種特性≥100kHU／mg的殘余比活，和從野生型SakSTAR治療的10名患者中獲得的抗血清庫的≤50％的吸附。結(jié)果總結(jié)于表8中。包括用亞庫B和亞庫C和用野生型SakSTAR治療的40名患者的庫獲得的結(jié)果。選擇SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)進(jìn)一步表征。2．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解性質(zhì)如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解性質(zhì)。使用選擇的變體獲得浸于人血漿中的125I-纖維蛋白標(biāo)記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解(表9)。實驗期間自發(fā)的凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(2小時后使50％凝塊溶解；C50)為0．11+0．01至0．24+0．04g／mL，此時殘余纖維蛋白原水平為基線的92±30％和97+30％(表9)。由劑量反應(yīng)曲線(未顯示)圖表確定無纖維蛋白時在2小時后使人血漿中50％纖維蛋白原降解的化合物濃度。這些值(3個獨立實驗的平均值±SD)為14+3．2-29+3．1μg／mL(表9)。令人驚訝地，SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)在顯色測定中的極高比活與血漿環(huán)境中增強(qiáng)的溶栓能力無關(guān)。3．選擇的SakSTAR變體的溫度穩(wěn)定性圖4顯示了在不同溫度下，在0．15mol／L NaCl、0．01mol／L磷酸鹽緩沖液，pH7．5中溶解為1．0mg／mL濃度的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)制劑的溫度穩(wěn)定性。在高達(dá)37℃的溫度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。然而在56℃和70℃下，三種變體比野生型SakSTAR更不穩(wěn)定。4．在倉鼠中大劑量注射后SakSTAR變體的藥物動力學(xué)特性靜脈內(nèi)大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體后，在4只一組的倉鼠中評估血液處理SakSTAR變體的藥物動力學(xué)參數(shù)。用另文描述的ELISA測定SakSTAR相關(guān)抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準(zhǔn)該ELISA。藥物動力學(xué)參數(shù)包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc=劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘-1)，Clp=劑量／AUC(33)。
在每組4只倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體后，血液對葡激酶相關(guān)抗原的處置率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數(shù)項充分描述(結(jié)果未顯示)，由此得出表10中所總結(jié)的藥物動力學(xué)參數(shù)。突變體的藥物動力學(xué)參數(shù)與野生型SakSTAR沒有顯著性差異。初始半衰期(t1／2(α))為2．0-3．2分鐘，血漿清除率(Clp)為1．6-4．1mL／分鐘。實施例9SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)與SakSTAR在外周動脈阻塞患者中溶栓能力和免疫原性比較1．為了體內(nèi)應(yīng)用的純化變體SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的18升培養(yǎng)物(2L每批)在補加有100μg／mL氨芐青霉素的優(yōu)質(zhì)肉湯培養(yǎng)基(28)中培養(yǎng)20小時，在最后3小時中用IPTG誘導(dǎo)。沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／10體積的0．01mol／L磷酸鹽緩沖液，pH6．0中，超聲處理破碎，離心使其澄清。通過在10×7cm的SP-Sepharose柱上層析純化化合物，該柱用0．01mol／L磷酸鹽緩沖液，pH6．0平衡，用1mol／L NaCl梯度(3倍柱體積)洗脫。合并含有SakSTAR變體的級分，加入固體NaCl至2．5mol／L的濃度，在10×20cm的苯基-Sepharose柱上層析該物質(zhì)，隨后用0．01mol／L磷酸鹽緩沖液，pH6．0分步洗脫。該物質(zhì)在10×45cm的Sephadex G25柱上脫鹽，加到5×10cm的SP-Sepharose柱上并用1．0mol／L NaCl分步洗脫濃縮，最后在0．15M NaCl、0．01mol／L磷酸鹽緩沖液，pH7．5平衡的6×60cmSuperdex 75柱上凝膠過濾，進(jìn)一步降低內(nèi)毒素含量。合并含有SakSTAR變體的級分，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)為1mg／mL，并將該物質(zhì)通過0．22μmMillipore濾器過濾除菌。用來測定比活、內(nèi)毒素污染、細(xì)菌無菌和在小鼠中毒性的方法在上文或另文(22)中有描述。通過在加樣40g化合物的10％凝膠上進(jìn)行SDS凝膠電泳來估計制品的純度。
從18升培養(yǎng)體積的SakSTAR變體中，純化出840mg比活為140kHU／mg的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和800mg比活為150kHU／mg的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。內(nèi)毒素含量為＜0．1IU／mg和0．26IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析范圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(zhì)(曲線下的總面積)(未顯示)。40g樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分(未顯示)。在如另文(22)所述的3天檢驗中，證明過濾除菌的制品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在每組5只小鼠中靜脈內(nèi)大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應(yīng)，也不能在8天內(nèi)降低體重增加。2．溶栓能力在閉塞性血栓近端處或之中以2mg大劑量動脈內(nèi)施用野生型SakSTAR或變體SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，隨后分別對15、6、6名一組的血管造影證實為外周動脈阻塞或少于120天持續(xù)時間的旁路移植患者以1mg／小時輸注(在某些患者中過夜降至0．5mg／小時)。給予書面承諾后研究患者，方案由Leuven大學(xué)的人類研究委員會批準(zhǔn)。包含和排除標(biāo)準(zhǔn)、聯(lián)合抗血栓治療(包括連續(xù)靜脈內(nèi)肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表11顯示了個體患者的有關(guān)基線特征和治療結(jié)果和后果。劑量3．5-27mg、持續(xù)時間2-44小時的動脈內(nèi)輸注在22名患者中誘導(dǎo)完全的再通，在5名患者中誘導(dǎo)部分再通。在13名患者中進(jìn)行補充的血管內(nèi)方法(主要是PTA)，在5名患者中在血栓溶解后進(jìn)行補充的重建血管手術(shù)。一名患者者進(jìn)行重大的截肢術(shù)。通常沒有出血并發(fā)癥，或者僅限于血管造影穿刺部位的輕度到中度的血腫形成(數(shù)據(jù)未顯示)。施用野生型SakSTAR的一名患者有非致死性顱內(nèi)出血，一名(BUE)有腹膜后血腫，兩名(MAN和STRO)有胃腸道出血。
循環(huán)纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR部分輸注期間保持不變(數(shù)據(jù)未顯示)，反映這此藥劑在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。纖維蛋白片段D-二聚體水平的升高證明發(fā)生了明顯的體內(nèi)纖維蛋白消化。動脈內(nèi)肝素治療使aPPT水平延伸到可變范圍(數(shù)據(jù)未顯示)。4．抗體誘導(dǎo)基本如上文和另文(22)所述定量血漿的葡激酶中和活性和抗原特異性IgG抗體?？贵w相關(guān)的SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG在基線時和在輸注后第一周內(nèi)較低(圖5)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達(dá)到中值，在用相應(yīng)部分治療的患者中分別為每mL血漿中和9μg SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和0．5μg SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，與之相比，用SakSTAR治療的15名患者中中值為每mL中和24μg野生型SakSTAR?？筍akSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG的水平在3-4周時升高到中值，在用相應(yīng)部分治療的患者中分別為420和30μg／mL血漿，與之相比，用SakSTAR治療的患者中中值為每mL血漿590μg抗SakSTAR(圖5)。以2-4周后血漿中和活性超過5g／ml定義的免疫普遍性為，與用SakSTAR的70名患者中的56名(80％)相比，用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有3名(50％)，用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有1名(17％)。此差異在統(tǒng)計學(xué)上是非常顯著的(根據(jù)2×3卡方分析，p=0．01)。
用SakSTAR治療誘導(dǎo)的抗體被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)不完全吸附(表12)。用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)治療誘導(dǎo)的抗體，在6名患者中的4名中可檢測到，被SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附(≥90％)，表明免疫不是由于野生型氨基酸置換產(chǎn)生的新表位。用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治療誘導(dǎo)的抗體，在一名患者(URB)中可檢測到，可用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附，但用野生型SakSTAR不完全吸附(85％)，提示誘導(dǎo)抗體的小部分可能針對輸注用變體中的新表位。實施例10SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)與所選其它氨基酸的組合變體的構(gòu)建、用免疫患者合并血漿的吸附1．引言在添加置換誘變的最后一輪，將SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)變體作為模板，因為它顯示高比活，合并的免疫患者血漿(庫40)抗體的吸附明顯降低(為65％)。與最終選擇的變體組合物有關(guān)的中間變體總結(jié)于表13中。K35、D82和S84A的添加，T90A、E99D和T101S的添加，E108A和K109A的添加，使抗體吸附降低為50％左右，而D82A、S84A和E108A、K109A的組合添加使之降低為41％。K136A的置換與COOH端Lys的添加(-137K)結(jié)合，在純化系統(tǒng)中，而不是在血漿環(huán)境或倉鼠肺栓塞模型(未顯示)中提高了比活，并且進(jìn)一步使患者合并血漿抗體的吸附降低為30％。最后，向該模板中添加K35A和T90A、E99D、T101S置換產(chǎn)生了一種具有完全溶栓能力的突變體，它只能結(jié)合免疫患者合并血漿中24％的抗體。
根據(jù)該分析，選擇SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)進(jìn)一步表征。另外，構(gòu)建并評價在位點74含Lys的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)。2．在倉鼠中大劑量注射后SakSTAR變體的藥物動力學(xué)特性在每組4只倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體后，血液對葡激酶相關(guān)抗原的處置率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數(shù)項充分描述(結(jié)果未顯示)。從這些血漿消失曲線中得出突變體的藥物動力學(xué)參數(shù)，與野生型SakSTAR沒有明顯差異(結(jié)果極其類似于表10，數(shù)據(jù)未顯示)。實施例11由SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)產(chǎn)生的選擇變體的表征1．選擇的SakSTAR變體對人血漿的體外纖維蛋白溶解特性使用選擇的三種變體獲得浸于人血漿中的125I-纖維蛋白標(biāo)記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解(表14)。實驗期間的自發(fā)凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時后使50％凝塊溶解；C50)為0．15±0．2至0．19±0．01μg／mL，此時不發(fā)生明顯的纖維蛋白原降解。由劑量反應(yīng)曲線(未顯示)圖表確定無纖維蛋白時在2小時后使人血漿中50％纖維蛋白原降解的化合物濃度。這些值(3個獨立實驗的平均值±SD)為7．0±0．6至24±3．6μg／mL(表14)。2．選擇的SakSTAR變體的溫度穩(wěn)定性在不同溫度下，在0．15M NaCl、0．01M磷酸鹽緩沖液，pH7．5中溶解為1．0mg／ml濃度的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)制劑的溫度穩(wěn)定性。在高達(dá)37℃的溫度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。在56℃和70℃下，變體一般比野生型SakSTAR更不穩(wěn)定(結(jié)果極其類似于圖4，數(shù)據(jù)未顯示)。實施例12SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，V_137K)(SY141)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)在外周動脈阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比較1．體內(nèi)應(yīng)用的SakSTAR變體的大規(guī)模純化和條件從18升培養(yǎng)體積中，將物質(zhì)純化為均勻的。內(nèi)毒素含量低于2IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析范圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(zhì)(曲線下的總面積)(未顯示)。30μg樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分。在3天檢驗中證明過濾除菌的制品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在每組5只小鼠中靜脈內(nèi)大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應(yīng)，8天內(nèi)也不能降低體重增加。
研究了血管造影術(shù)證明為外周動脈阻塞(PAO)的每組6名患者。個體患者的有關(guān)基線特征顯示于表15中。表16總結(jié)了各治療和結(jié)果。劑量6-24mg、持續(xù)時間4-29小時的動脈內(nèi)輸注在大多數(shù)患者中誘導(dǎo)完全的再通。循環(huán)纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR變體輸注期間基本保持不變(數(shù)據(jù)未顯示)，反映了這些藥劑在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性。抗體相關(guān)的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E650，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)中和活性在基線時和在輸注后第一周內(nèi)較低(圖17)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達(dá)到中值，在用各自化合物治療的患者中為每mL血漿中和19μg SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、0．7μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)和4．3μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)，對于SY141和SY145而不是SY118，低于用野生型SakSTAR治療的69名患者中每mL中和12μg野生型SakSTAR的中值。
在用SakSTAR治療的70名患者中的56名中，在接觸SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)的6名患者中的5名中，只在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)的6名患者中的2名中，在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)的3名患者中的1名中，觀察到明顯的免疫(3-4周時中和活性為每ml血漿5g化合物)。
有關(guān)研究的主要變體在患者中的免疫原性的結(jié)果總結(jié)于表18中。顯然，與野生型蛋白質(zhì)相比，變體SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)具有明顯降低的免疫原性。實施例13葡激酶的半胱氨酸置換突變體的構(gòu)建、純化和表征1．引言進(jìn)行定點誘變，用單半胱氨酸殘基替代暴露的氨基酸，以構(gòu)建ⅰ)在分子間二硫鍵形成之后，葡激酶的同型二聚體形式，和ⅱ)聚乙二醇偶聯(lián)的分子(PEG-衍生物)。本實施例的目的在于兩點第一，增加注射分子的大小(通過二聚化或與大分子如PEG的偶聯(lián))能降低清除率，第二，PEG-衍生物也顯示在動物模型中誘導(dǎo)降低的免疫反應(yīng)性(綜述見參考文獻(xiàn)34)。在這兩種情況中，延長的體內(nèi)半衰期有助于降低患者中葡激酶的藥理學(xué)劑量。這種降低可能伴隨有對溶栓劑的降低的免疫原性反應(yīng)，從而增強(qiáng)其作為一種溶栓劑的藥理活性。
在本實施例中，描述了其中單氨基酸被替換為半胱氨酸的兩種SakSTAR變體的構(gòu)建和表征。本實施例描述的突變體列于表19中。這些變體在大腸桿菌中表達(dá)、純化，并對比活、在人血漿中的體外纖維蛋白溶解和在倉鼠中大劑量注射后的藥物動力學(xué)特性等方面進(jìn)行表征。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報道(22)，或在以下詳述。誘變模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應(yīng)按照供應(yīng)商建議進(jìn)行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質(zhì)粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)分離。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞用眾所周知的磷酸鈣法制備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質(zhì)粒DNA進(jìn)行。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶進(jìn)行。構(gòu)建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經(jīng)很好地建立(22，27)。3．表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用編碼SakSTAR的pMEX．SakSTAR作為模板，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)(24)構(gòu)建變體SakSTAR(K102C)和SakSTAR(K109C)。PCR(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)擴(kuò)增兩個片段，第一個從葡激酶基因的5’端(引物818A)開始到待誘變區(qū)(正向引物)，第二個用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(qū)(反向引物)到該基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(qū)(對于K102C的構(gòu)建TAT GAT AAG AAT TGC AAA AAA GAA GAA(反向)和TTC TTC TTT TTT GCA ATT CTT ATC ATA(正向)，對于K109C的構(gòu)建AAA AAG AAG AAA CGT GCT CTT TCC CTA(反向)和TAG GGA AAG AGC ACG TTT CTT CTT TTT(正向))。然后用外部引物818A和818D在第二個PCR反應(yīng)中將兩個純化片段裝配在一起(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應(yīng)物中純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRI和HindⅢ消化，并連接于pMEX．SakSTAR的相應(yīng)位點。對于每一構(gòu)建，通過對完整編碼區(qū)測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達(dá)和純化如下所述，從在優(yōu)質(zhì)肉湯(TB)培養(yǎng)基(28)中生長的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中表達(dá)并純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養(yǎng)基的過夜飽和培養(yǎng)物接種1-2L補加有100μg／mL氨芐青霉素的優(yōu)質(zhì)肉湯培養(yǎng)物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養(yǎng)物。溫育大約16小時后，向培養(yǎng)物中加入IPTG(200μmol／L)誘導(dǎo)從tac啟動子開始的表達(dá)。誘導(dǎo)3小時后，以4000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩沖液中，并通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘，上清液貯存于4℃或-20℃直到純化?；救缟纤?實施例2)純化該物質(zhì)含有SakSTAR變體的澄清細(xì)胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進(jìn)行層析，隨后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合并經(jīng)SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用于進(jìn)一步分析。5．生物化學(xué)分析根據(jù)Bradford(29)測定蛋白質(zhì)濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍(lán)染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進(jìn)行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進(jìn)行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。不同SakSTAR變體的比活總結(jié)于表19中。
經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色顯示，變體SakSTAR(K102C)基本上是單體的。其比活相當(dāng)于野生型葡激酶。相反，SakSTAR(K109C)顯示形成二聚體的傾向(＞60％)。這導(dǎo)致在纖溶酶原偶聯(lián)的顯色底物試驗中比活明顯增高(見表19)。在用二硫蘇糖醇(DTT)還原(20倍摩爾過量，37℃，1．5小時)，并用碘乙酰胺烷化(100倍摩爾過量，37℃，1小時)后，K109C二聚體轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的單體，其最終比活在野生型葡激酶的希望的范圍之內(nèi)(表19)。該結(jié)果證實，同型二聚體的形成是比活大大增加的唯一決定因素。通過在Source S(Pharmacia)(5×50mm)上層析將二聚體SakSTAR(K109C)與單體SakSTAR(K109C)分開。加樣緩沖液為10mM磷酸鹽緩沖液，pH6．0，二聚體SakSTAR(K109C)用相同緩沖液中的鹽梯度(可達(dá)1M)洗脫。合并經(jīng)SDS凝膠電泳定位、含有二聚體SakSTAR(K109C)的級分(純度＞95％)用于進(jìn)一步分析。6．SakSTAR的半胱氨酸突變體與聚乙二醇的化學(xué)交聯(lián)半胱氨酸突變體SakSTAR(K102C)的硫醇基用于與活化的聚乙二醇OPSS-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷蘭)偶聯(lián)。OPSS-PEG是一種5kDa的PEG分子，在一端帶有一個活化的硫醇基，在弱堿性pH時可與游離硫醇特異反應(yīng)。SakSTAR(K102C)的修飾通過使該分子(100μM)與三倍過量的溶于5mM磷酸鹽，pH7．9溶液的SS-PEG在室溫下溫育而完成。通過測定412nm處2-巰基吡啶酮從OPSS-PEG的釋放監(jiān)測反應(yīng)的程度。反應(yīng)后(約15分鐘)，如上所述(見實施例2)通過在1．6×5cm SP-Sephadex柱上純化衍生的SakSTAR(K102C-PEG)除去過量的OPSS-PEG。合并根據(jù)280nm的光密度定位、含有SakSTAR(K102C-PEG)的級分用于進(jìn)一步分析。SDS-PAGE分析和考馬斯亮藍(lán)染色證實PEG在SakSTAR(K102C)上的交聯(lián)是定量的。如表19所示，與野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影響。7．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解性質(zhì)。使用下列四種分子獲得浸于人血漿中的125I-纖維蛋白標(biāo)記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解作為二聚體和單體的SakSTAR(K109C)(還原并用碘乙酰胺烷化后)、單體SakSTAR(K102C)和PEG衍生的SakSTAR(K102C)。實驗期間的自發(fā)凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時后使50％凝塊溶解；C50)，單體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C)與SakSTAR相當(dāng)(表19)。然而，觀察到，二聚體SakSTAR(K109C)凝塊溶解的C50僅為0．12μg／mL，這比野生型葡激酶大約低三倍。相反，對于SakSTAR(K102C-PEG)測量到0．60μg／mL的C50，這只比野生型葡激酶高兩倍。因此，SakSTAR通過二硫鍵的二聚化或者通過PEG衍生提高分子大小不妨礙葡激酶的纖維蛋白溶解活性。盡管PEG-分子似乎降低擴(kuò)散，并因此降低衍生葡激酶對纖維蛋白凝塊內(nèi)的纖維蛋白溶解能力，但葡激酶的二聚化導(dǎo)致對人纖維蛋白凝塊的協(xié)同纖維蛋白溶解作用。8．在倉鼠中大劑量注射后二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學(xué)特性在靜脈內(nèi)大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體后，在4只一組的倉鼠中評估血液處理二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學(xué)參數(shù)。用另文所述的ELISA測定SakSTAR相關(guān)抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準(zhǔn)該ELISA。藥物動力學(xué)參數(shù)包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc=劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘-1)，Clp=劑量／AUC(32)。
在每組4只倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體后，血液對葡激酶相關(guān)抗原的處理率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數(shù)項充分描述(結(jié)果未顯示)，由此得出表19中總結(jié)的藥物動力學(xué)參數(shù)t1／2α和Clp。二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學(xué)參數(shù)與野生型SakSTAR明顯不同。對于二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)，初始血漿半衰期(t1／2(α))分別為3．6和3．0分鐘，血漿清除率(Clp)分別為0．52和0．32mL／分鐘。這些結(jié)果可能是由于二聚化或與PEG交聯(lián)引起的SakSTAR斯托克斯(Stokes)半徑的增加。根據(jù)通過HPLC在Superdex50上的大小排阻層析，二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)分別具有33kDa和40kDa的表觀分子量。實施例14免疫原性降低的葡激酶變體半胱氨酸置換突變體的構(gòu)建、純化和表征1．引言根據(jù)實施例13的結(jié)果，構(gòu)建、純化并表征SakSTAR變體的其它聚乙二醇衍生物。免疫原性最低的變體SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)用作模板，條件是后者的COOH端回復(fù)為野生型序列，S84A替換為E80，K74Q替換為K74R，產(chǎn)生SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161)。引入的半胱氨酸，作為聚乙二醇分子的受體，位于氨基端區(qū)(優(yōu)選地，但不是排他地，成熟葡激酶變體的位置號3處的Ser)，以在葡激酶激活后釋放(10個NH2端氨基酸的釋放)；最后使用不同分子量的聚乙二醇分子(Mr=5000-20000)，用OPSS或馬來酰亞胺置換。
本實施例描述的突變體列于表20中。這些變體在大腸桿菌中表達(dá)、純化，并對比活、在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性、在倉鼠中大劑量注射后的藥物動力學(xué)特性、在倉鼠肺栓塞模型中大劑量注射后的溶栓特性、免疫患者合并血漿(庫40)抗體的吸附等方面進(jìn)行表征。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報道(22)，或在以下詳述。誘變的模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應(yīng)按照供應(yīng)商建議進(jìn)行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質(zhì)粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)分離。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞用眾所周知的磷酸鈣法制備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質(zhì)粒DNA進(jìn)行。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶進(jìn)行。構(gòu)建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經(jīng)很好地建立(22，27)。3．表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用編碼SakSTAR的pMEX．SakSTAR作為模板，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)(24)構(gòu)建變體SakSTAR(S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(2SC，3SC))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S2C，S3C))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY160(S3C))和SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161(S3C))，PCR(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)擴(kuò)增兩個片段，第一個從葡激酶基因的5’端(引物818A)開始到待誘變區(qū)(正向引物)，第二個用引物818D(5’CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(qū)(反向引物)到該基因的3’端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(qū)。然后用外部引物818A和818D在第二個PCR反應(yīng)中將兩個純化片段裝配在一起(30循環(huán)94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應(yīng)物中純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRI和HindⅢ消化，并連接于pMEX．SakSTAR的相應(yīng)位點。對于每一構(gòu)建，通過對完整編碼區(qū)測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達(dá)和純化如下所述，從在優(yōu)質(zhì)肉湯(TB)培養(yǎng)基(28)中生長的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中表達(dá)并純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養(yǎng)基的過夜飽和培養(yǎng)物接種1-2L補加有100μg／mL氨芐青霉素的優(yōu)質(zhì)肉湯培養(yǎng)物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養(yǎng)物。溫育大約16小時后，向培養(yǎng)物中加入IPTG(200μmol／L)誘導(dǎo)從tac啟動子開始的表達(dá)。誘導(dǎo)3小時后，以4000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘沉淀細(xì)胞，重懸浮于1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩沖液中，并通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉(zhuǎn)每分離心20分鐘，上清液貯存于4℃或-20℃直到純化。基本如上所述(實施例2)純化該物質(zhì)含有SakSTAR變體的澄清細(xì)胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進(jìn)行層析，隨后在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合并經(jīng)SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用于進(jìn)一步分析。5．生物化學(xué)分析根據(jù)Bradford(29)測定蛋白質(zhì)濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍(lán)染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進(jìn)行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進(jìn)行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。6．SakSTAR的半胱氨酸突變體與聚乙二醇的化學(xué)交聯(lián)半胱氨酸突變體的硫醇基用于與活化的聚乙二醇OPSS-PEG或MAL-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷蘭)偶聯(lián)。OPSS-PEG是一種5kDa的PEG分子，在一端帶有一個活化的硫醇基，在弱堿性pH時可與游離硫醇特異反應(yīng)。MAL-PEG是一種5kDa、10kDa或20kDa的分子，帶有一個馬來酰亞胺基，在其它官能團(tuán)的存在下在溫和條件下可與硫醇基特異反應(yīng)。變體的修飾通過使該分子(100μM)與三倍過量的溶于5mM磷酸鹽，pH7．9溶液的OPSS-PEG或MAL-PEG在室溫下溫育而完成。反應(yīng)后(約15分鐘)，如上所述(見實施例2)在1．6×5cmSP-Sephadex柱上純化衍生的SakSTAR變體除去過量的OPSS-PEG或MAL-PEG。合并根據(jù)280nm的光密度定位、含有“PEG化”的SakSTAR變體的級分用于進(jìn)一步分析。SDS-PAGE分析和考馬斯亮藍(lán)染色證實PEG交聯(lián)是定量的。如表20所示，與野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影響。7．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解特性。使用所有待測分子獲得浸于人血漿中的125I-纖維蛋白標(biāo)記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時后使50％凝塊溶解；C50)，相當(dāng)于或者只是略微低于SakSTAR(表20)。P20(Mr為20kDa的PEG)衍生變體的凝塊溶解的C50大約兩倍于未衍生的變體。因此，通過PEG衍生提高分子大小不能顯著影響葡激酶的纖維蛋白溶解活性。PEG-分子似乎降低擴(kuò)散并因此降低衍生葡激酶對纖維蛋白凝塊的纖維蛋白溶解能力，但在NH2端區(qū)域-它在葡激酶加工過程中釋放-置換的變體似乎比在分子核心置換的變體更不明顯(參見表19、20)。8．在倉鼠中大劑量注射后聚乙二醇化學(xué)修飾的SakSTAR變體的藥物動力學(xué)特性在靜脈內(nèi)大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體后，在4只一組的倉鼠中評估血液處理PEG化變體的藥物動力學(xué)參數(shù)。用另文描述的ELISA測定SakSTAR相關(guān)抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準(zhǔn)該ELISA。藥物動力學(xué)參數(shù)包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘=-1)，Clp=劑量／AUC(32)。
在每組4只倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體后，血液對葡激酶相關(guān)抗原的處理率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數(shù)項充分描述(結(jié)果未顯示)，由此得出表20中總結(jié)的血漿清除率Clp。PEG化變體的清除率明顯不同于野生型SakSTAR，并且與PEG分子的分子量成反比，PEG 5kDa平均降低5倍，PEG 10kDa平均降低10倍，PEG 20kDa平均降低30倍。這些結(jié)果可能是由于與PEG交聯(lián)引起的SakSTAR斯托克斯半徑的增加。實施例15SakSTAR(S3C-P20，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C-P20))在兩名急性心肌梗塞患者中的溶栓能力和清除率比較體內(nèi)應(yīng)用的SakSTAR變體的大規(guī)模純化和條件從18升培養(yǎng)體積中，將物質(zhì)純化為均勻的。內(nèi)毒素含量低于1IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析范圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(zhì)(曲線下的總面積)(未顯示)。30μg樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分。在方法中所述的3天檢驗中證明過濾除菌的制品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在5只小鼠中靜脈內(nèi)大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應(yīng)，8天內(nèi)也不能降低體重增加。
對兩名急性心肌梗塞患者大劑量注射5mg SY19(S3C-P20)。根據(jù)冠狀血管造影術(shù)確定，在大劑量注射90分鐘后，這些患者的閉塞的梗塞相關(guān)動脈完全再通。物質(zhì)以3-4小時的初始半衰期從血漿中清除，與之相比，野生型SakSTAR為4-6分鐘。這些數(shù)據(jù)證實，SakSTAR的PEG化變體可通過以降低劑量單次大劑量注射用于溶栓治療。結(jié)論總之，本發(fā)明表明，能產(chǎn)生抗體誘導(dǎo)明顯降低但有完全溶栓能力的葡激酶變體。這一結(jié)果構(gòu)成了第一種情況，其中利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，使異源蛋白質(zhì)在人中的免疫原性明顯降低，而不降低其生物活性。另外，本發(fā)明表明，用不同分子量的聚乙二醇對葡激酶或其變體的選擇的化學(xué)修飾是可行的，導(dǎo)致與分子量成比例的血漿清除率的降低。在優(yōu)選實施方案中，葡激酶NH2端區(qū)域-通過加工去除的部分-中的氨基酸被替換為Cys，并用OPSS或MAL-PEG化學(xué)修飾引入的硫醇基。這產(chǎn)生均一的產(chǎn)物，它在實驗動物和患者中單次靜脈內(nèi)大劑量注射后，明顯降低的劑量即具有保持的溶栓能力。表1SakSTAR“帶電簇-丙氨酸”突變體的“丙氨酸-野生型”回復(fù)變體與固定鼠單克隆抗體(Mab)結(jié)合的締合常數(shù)(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表觀締合常數(shù)比野生型SakSTAR低≥10倍以黑體表示；比活≥100000HU／mg以黑體表示；≤60％吸附以黑體表示。表2用SakSTAR、SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77)治療的外周動脈阻塞患者的基線特征和治療結(jié)果化合物 性別 年齡 臨床缺血 阻塞部位 阻塞時間 阻塞長度 血栓溶解引 溶栓劑總劑 輸注總持續(xù) 其它治療患者身份 (歲) (天)(cm) 起的再通 量(mg) 時間(小時)SakSTARMEE F67靜止痛 左SFA 308 完全 7.0 5.0 PTAFOR M68 跛足左IA(支架) 14 18 完全 6.5 4.5PTA+支架DAN M73 跛足 右SFA 306 完全 7.5 5.5 PTABER F63靜止痛 左FT移植物 18 55 完全 18 28 PTADAM F43 急性 左臂和橈動脈 27 完全 19 17PTA+支架TOR M68 跛足 右SFA(腘動脈瘤)50 12 完全 6.0 4.0 PTA+腿腘旁路移植CLA M74 急性 左PA 1.5 20 完全 9.0 7.0-MAN M65 急性左EIA(支架) 4 20 完全 6.5 4.5 (左趾V截肢術(shù))MAT M64亞急性 右FP移植物3 45 完全 8.0 6.0 (-)平均值±SEM 65±3.017±5.6 21±5.8 9.7±1.79.1±2.7SakSTAR(K74A)LIE M70亞急性 右FF移植物 10 48 完全 11 9.0 PTAENG M50 跛足 右SFA 28 10 完全 12 10 PTACOX F48 跛足右PA移植物 257 部分 15 15 PTAMAN F68 跛足 右SFA≥120 9 完全 9.0 7.0 PTAVHE M47 急性右IF移植物 10 54 完全 18 16 手術(shù)移植矯正MUL F51 急性 右IF和FP移植物 1 63 完全 16 20 PTABUR F67靜止痛 右TF干9.0 38 部分 18 21-NIJ F60靜止痛 左AF移植物 23 78 完全 15 21-POE*M49亞急性 右TF干 230 部分 6.0 4.0rt-PA,手術(shù)移植延長VBE M39亞急性右BA(栓塞) 20 28 完全 18 23 右SC動脈支架,第一肋切除SME F50亞急性 TF干 18 32 完全 21 19無WOL M67亞急性 右PA 4 25 完全 16 22-平均值±SEM 56±3.0 23±9.2 35±6.4 15±1.2 16±1.9SakSTAR(K74A,E75A,R77A)JAC F65 急性 右BA和UA 0.3 5 完全 14 12-MAE M74靜止痛 左SFA10 50 完全 9.0 7.0 PTACRA F52 跛足右IA和FA動脈 14 28 完全 25 23 PTA+支架VDB M68 跛足左SFA90 12 完全 9.07.0 PTADUN M71亞急性 左SFA14 6 完全 9.07.0 PTADEL M59 急性 右FT移植物 3 42 完全 9.07.0 PTA平均值±SEM 65±3.3 22±14 24±7.813±2.611±2.6AF股主動脈；BA肱動脈；CIA髂總動脈；FF股腓；FP股腘；FT股脛；IA髂動脈；IF髂股；PA腘動脈；PTA經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)；SFA淺股動脈；TF脛腓；UA尺動脈。*1994年用SakSTAR治療。表3SakSTA的丙氨酸置換變體與固定鼠單克隆抗體(Mab)結(jié)合的締合常數(shù)(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表3(續(xù))
表3(續(xù))
表3(續(xù))
表4S34、G36和H43的誘變與固定鼠單克隆抗體(Mab)結(jié)合的締合常數(shù)(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表5K35、Y73、K74、E80／D82、N95、K130、V132和K135的誘變與固定鼠單克隆抗體(Mab)結(jié)合的締合常數(shù)(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表5(續(xù))
表6SakSTAR(K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它氨基酸的組合突變體
表6(續(xù))
表6(續(xù))
締合常數(shù)低≥10倍及抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示；≥100000HU／mg以黑體表示。NT未檢測。表7SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它氨基酸的組合突變體
表7(續(xù))
締合常數(shù)低≥10倍及抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示；≥100000HU／mg以黑體表示。NT未檢測。表8具有完全比活(≥100kHU／mg)和≤50％的野生型SakSTAR治療引起的人抗體的吸附的SakSTAR變體
抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示≥100000HU／mg以黑體表示。表9選擇的SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性
表11用SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治療的外周動脈阻塞患者的基線特征和治療結(jié)果
表12SakSTAR變體對外周動脈阻塞患者中SakSTAR變體引起的抗體的吸附
表13
表15用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治療的外周動脈阻塞患者的特征
表16用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治療的外周動脈阻塞患者的治療和結(jié)果
PTA經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)；IF髂股；FT股脛；FP股腘。表17對外周動脈阻塞患者施用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)之前和之后的中和抗體活性
表18SakSTAR變體存外周動脈阻塞患者中的免疫原性
數(shù)據(jù)表示中值和15-85百分范圍。表19SakSTAR的半胱氨酸置換變體
表20用馬來酰亞胺-聚乙二醇置換、免疫原性降低的SakSTAR的半胱氨酸置換變體
*SP5OPSS-PEG 5kDa；MP5MAL-PEG 5kDa；P10MAL-PEG 10kDa；P20MAL-PEG 20kDa。
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權(quán)利要求
1．與野生型葡激酶相比在向動脈血栓形成患者施用后顯示降低的免疫原性的葡激酶衍生物。
2．權(quán)利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸被替換為另一種氨基酸，從而降低了與一系列鼠單克隆抗體的反應(yīng)性。
3．權(quán)利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸被替換為另一種氨基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體吸附。
4．權(quán)利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸被替換為其它氨基酸，而不使比活降低超過50％。
5．具有如圖1所示氨基酸序列的葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其中位點35的Lys、位點36的Gly、位點65的Glu、位點74的Lys、位點80的Glu、位點82的Asp、位點102的Lys、位點108的Glu、位點109的Lys、位點121的Lys、位點130的Lys、位點135的Lys和／或位點136的Lys中的一個或多個氨基酸被替換為其它氨基酸，和／或其中在COOH端添加了一個氨基酸，從而改變了向患者施用后的免疫原性，而不明顯降低比活。
6．表1、3、4、5、6、7、8、13、19和20中所列的葡激酶衍生物，其具有如圖1所示的氨基酸序列，其中指定的氨基酸被替換為其它氨基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體的吸附，而不降低比活。
7．權(quán)利要求1-6的葡激酶衍生物，其選自SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
8．編碼為SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
9．編碼為SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)。
10．權(quán)利要求1-9的葡激酶衍生物，其含有一個替換為Cys的氨基酸，導(dǎo)致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增強(qiáng)的溶栓能力。
11．具有聚乙二醇取代的權(quán)利要求1-10的葡激酶衍生物，其特征在于保持的比活和明顯降低的血漿清除率。
12．權(quán)利要求10的葡激酶衍生物，其中Cys用分子量可達(dá)20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾。
13．權(quán)利要求12的葡激酶衍生物，其中NH2端區(qū)10個氨基酸中的所選氨基酸被替換為用分子量可達(dá)20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾的Cys，該衍生物的特征在于在以降低劑量單次靜脈內(nèi)大劑量施用后明顯降低的血漿清除率和保持的溶栓能力。
14．權(quán)利要求13的葡激酶衍生物，其中位點2或3的絲氨酸被替換為半胱氨酸，而該半胱氨酸用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化學(xué)修飾。
15．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-MP5)。
16．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-P10)。
17．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-P20)。
18．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-MP5)。
19．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-SP5)。
20．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)。
21．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-P20)。
22．權(quán)利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-P10)。
23．權(quán)利要求10的兩個葡激酶衍生物的二聚體。
24．生產(chǎn)權(quán)利要求1-10的葡激酶衍生物的方法，包括下列步驟a．制備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段；b．對該DNA片段進(jìn)行體外定點誘變，將野生型氨基酸的一個或多個密碼子替換為另一種氨基酸的密碼子；c．在適當(dāng)?shù)妮d體中克隆突變的DNA片段；d．用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；和e．在適于表達(dá)該DNA片段的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
25．權(quán)利要求24的方法，其中所述DNA片段是質(zhì)粒pMEX602sakB的453bp EcoRI-HindⅢ片段，進(jìn)行體外定點誘變，并在大腸桿菌中表達(dá)突變的DNA片段。
26．包含至少一種權(quán)利要求1-23的葡激酶衍生物與適當(dāng)賦形劑的藥用組合物。
27．用于治療動脈血栓形成的權(quán)利要求26的藥用組合物。
全文摘要
鑒定、生產(chǎn)和應(yīng)用葡激酶衍生物的方法,其特征在于在對患者施用后免疫原性降低,并且能通過單次靜脈內(nèi)大劑量注射施用。本發(fā)明的衍生物的獲得方法包括,制備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段;對該DNA片段進(jìn)行體外定點誘變,以將野生型氨基酸的一個或多個密碼子替換為另一種氨基酸的密碼子;在適當(dāng)?shù)妮d體中克隆突變的DNA片段;用該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞;在適于表達(dá)該DNA片段的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。將表達(dá)的葡激酶衍生物純化為均一的,并用硫醇基定點的聚乙二醇化學(xué)修飾置換的Cys;該DNA片段優(yōu)選地是質(zhì)粒pMEX602sakB(pMEX.sakSTAR)的453bp EcoRI－HindIII片段,通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行體外定點誘變,并在大腸桿菌株TG1或WK6中表達(dá)突變的DNA片段。本發(fā)明也涉及包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的葡激酶衍生物與適當(dāng)賦形劑的藥用組合物,用于動脈血栓形成的治療。
文檔編號C12N9/12GK1293712SQ99804195
公開日2001年5月2日 申請日期1999年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月4日
發(fā)明者德西雷·何塞·科倫 申請人:思羅姆-X股份有限公司, 德西雷·何塞·科倫