專利名稱：飼料制劑中的熱穩(wěn)定性植酸酶及植物表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及熱穩(wěn)定性植酸酶，也就是說(shuō)，熱穩(wěn)定性植酸酶在制備動(dòng)物飼料過(guò)程中的應(yīng)用及其在植物中的表達(dá)。
背景技術(shù)：
WO91／14782描述表達(dá)衍生自曲霉屬ficuum NRRL3135的植酸酶的轉(zhuǎn)基因煙草和菜籽植物。該轉(zhuǎn)基因煙草種子用于喂食筍雞。
US 5824779描述如何以標(biāo)準(zhǔn)方式制備表達(dá)同樣的曲霉屬ficuum植酸酶的轉(zhuǎn)基因苜蓿，和本身可作為動(dòng)物飼料添加劑使用的含有植酸酶濃縮物的制備。
EP 0556883 B1描述基于擠壓技術(shù)制備飼料球粒的方法。在飼料粒擠出之后進(jìn)行溫度敏感試劑(其中一個(gè)實(shí)例是植酸酶)的添加，且在減壓下將溫度敏感試劑裝載到球粒上。
EP 0556883 B1中指出，飼料調(diào)制過(guò)程中熱敏感物質(zhì)活性的損失是眾所周知的問(wèn)題。上述EP專利提出，在擠出過(guò)程之后，在減壓下加入這些物質(zhì)來(lái)解決這一問(wèn)題。然而，這種解決方法需要液態(tài)形式的溫度敏感物質(zhì)，以及需要配備額外的昂貴的工藝設(shè)備。
本發(fā)明提供制備動(dòng)物飼料的改進(jìn)的方法以及改進(jìn)的表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供制備動(dòng)物飼料的方法，該方法包括飼料成分的團(tuán)聚，在團(tuán)聚之前或期間加入熱穩(wěn)定性植酸酶。
本發(fā)明也提供含有編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA-構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物或植物的一部分。
轉(zhuǎn)基因植物或其部分(如種子或葉子)可以用于本發(fā)明的飼料配制過(guò)程，從而在一優(yōu)選的實(shí)施方案中同時(shí)提供養(yǎng)分(飼料成分)和飼料添加劑植酸酶。
附圖簡(jiǎn)述結(jié)合下面的附圖，詳細(xì)描述本發(fā)明，其中

圖1是共有植酸酶-1和共有植酸酶-10的差示掃描量熱圖(DSC)；圖2是共有植酸酶-10-熱-Q50T和共有植酸酶-10-熱-Q50T-K91A的DSC；圖3是共有植酸酶-1-熱[8]-Q50T和共有植酸酶-10-熱[8]-Q50T-K91A的DSC；圖4是來(lái)自煙曲霉ATCC 13073和其α-變株的植酸酶的DSC；和圖5顯示共有-植酸酶-1氨基酸序列的設(shè)計(jì)；圖6是五種擔(dān)子菌植酸酶的對(duì)比和擔(dān)子菌共有序列；圖7是共有-植酸酶-10氨基酸序列的設(shè)計(jì)；圖8是為共有-植酸酶-11設(shè)計(jì)的對(duì)比(對(duì)于每一個(gè)擔(dān)子菌序列，賦予0．2的權(quán)重，所有擔(dān)子菌植酸酶作為獨(dú)立序列而被使用；進(jìn)一步使用黑曲霉T213的氨基酸序列)；圖9是共有植酸酶-1-熱(8)-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列；圖10是共有植酸酶-10-熱(3)-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列；圖11是煙曲霉ATCC 13073α-變株的DNA和氨基酸序列；和圖12是共有-植酸酶-7的DNA和氨基酸序列，共有植酸酶-7與共有-植酸酶-1相比，包括下列突變S89D，S92G，A94K，D164S，P201S，G203A，G205S，H212P，G224A，D226T，E255T，D256E，V258T，P265S，Q292H，G300K，Y305H，A314T，S364G，M365I，A397S，S398A，G404A和A405S。
發(fā)明詳述本文中，“食物”或“動(dòng)物飼料”指打算或適宜于由動(dòng)物吃入、攝入、消化的任何天然或人工飲食、乳品或類(lèi)似物。人類(lèi)的食物包括在上述食物的定義中。
“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，無(wú)論它是多胃動(dòng)物(反芻動(dòng)物)還是單胃動(dòng)物如人類(lèi)、家禽、豬和魚(yú)類(lèi)。優(yōu)選的動(dòng)物是單胃的動(dòng)物，特別是豬和筍雞。
“飼料成分”的概念包括將被或被加工成飼料的原料。非人動(dòng)物的飼料成分通常是并且優(yōu)選地選自下列非窮舉的物質(zhì)取自植物的產(chǎn)品如種子、谷粒、葉子、根、塊莖、花、豆、皮-它們可以是鱗片狀、餅狀、渣狀、粉狀等；
取自動(dòng)物的產(chǎn)品如魚(yú)肉、奶粉、骨提取物(extract)、肉類(lèi)提取物、血液提取物等；添加劑如礦物質(zhì)、維生素、芳香族化合物和飼料增強(qiáng)酶。
植酸或肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氫酯(或簡(jiǎn)稱為肌醇六磷酸酯)是肌醇的主要來(lái)源并且是植物種子和谷粒中磷酸的主要儲(chǔ)存形式。在豆類(lèi)種子中，其含量占磷酸酯含量的約70％。種子、谷粒和豆是重要的飼料成分。
除非另外聲明，植酸或其鹽即植酸鹽是抗?fàn)I養(yǎng)劑，所述術(shù)語(yǔ)在本文中是同義使用或者隨意使用，是抗?fàn)I養(yǎng)因子。部分由于它結(jié)合營(yíng)養(yǎng)必需離子如鈣離子、微量礦物質(zhì)如錳，還結(jié)合蛋白質(zhì)(通過(guò)靜電相互作用)。部分由于它們的亞磷不能被營(yíng)養(yǎng)地利用的事實(shí)，因?yàn)橹菜岷推潲}，即植酸常常不被代謝。
這導(dǎo)致需要用諸如無(wú)機(jī)磷酸鹽補(bǔ)充食品和飼料制劑。
不能被代謝的含亞磷的植酸通過(guò)動(dòng)物的胃腸道并隨糞尿排泄，導(dǎo)致不期望的磷酸鹽環(huán)境污染，引發(fā)例如水環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)和藻類(lèi)過(guò)渡生長(zhǎng)。
植酸被植酸酶降解。本文中“植酸酶”是具有植酸酶活性的多肽或酶，即，催化植酸酯(肌醇六磷酸)轉(zhuǎn)化為(1)肌醇和／或(2)其單-、二-、三-、四-、和／或五-磷酸鹽和(3)無(wú)機(jī)磷酸鹽。
由植物及微生物產(chǎn)生的植酸酶已有報(bào)道。在微生物中，產(chǎn)生植酸酶的細(xì)菌以及產(chǎn)生植酸酶的真菌是已知的。
對(duì)產(chǎn)生植酸酶的屬于子囊(Ascomycota)(子囊菌(ascomycete))真菌門(mén)的絲狀真菌有數(shù)種描述。更具體而言，有數(shù)篇有關(guān)產(chǎn)生植酸酶的曲霉屬子囊菌如土曲霉的文獻(xiàn)(Yamada等，1986，農(nóng)用生物化學(xué)(Agric．Bio1．Chem．)3221275-1282)。也已描述了由黑曲霉變株Awamori的植酸酶基因的克隆和表達(dá)(Piddington等，1993，基因(Gene)13355-62)。EP 0420358描述了曲霉ficuum(黑曲霉)的植酸酶的克隆和表達(dá)。EP 0684313描述了子囊菌黑曲霉、嗜熱毀絲霉、土曲霉的植酸酶的克隆和表達(dá)。另外，給出了構(gòu)巢曲霉、嗜熱踝節(jié)菌、煙曲霉和另一土曲霉菌株的植酸酶的部分序列。
WO97／35017描述了Thermomyces lanuginosus的植酸酶的克隆和表達(dá)。
WO98／28409描述了數(shù)種擔(dān)子菌植酸酶的克隆和表達(dá)，如由隔孢伏革菌lycii(Peniophora lycii)、平田頭菇(Agrocybe pediades)、卷蠋毛頭棘菌(Paxillus involutus)和絨毛栓菌(Trametes pubescens)產(chǎn)生的植酸酶。
根據(jù)酶命名數(shù)據(jù)庫(kù)ExPASy(主要根據(jù)國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)命名委員會(huì)推薦與酶命名有關(guān)的描述每種類(lèi)型被鑒定的酶的信息的貯存庫(kù)，所述酶已被EC(酶委員會(huì))提供一個(gè)號(hào)碼)，目前已知有兩種不同類(lèi)型的植酸酶一種是所謂的3-植酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC3．1．3．8)和所謂的6-植酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC 3．1．3．26)。3-植酸酶首先水解3-位的酯鍵，而6-植酸酶首先水解植酸中6-位的酯鍵。這兩種類(lèi)型的植酸酶包括在上述定義的植酸酶中。
已知許多測(cè)定植酸酶活性的方法，任何一個(gè)均可用于本發(fā)明的目的。優(yōu)選的植酸酶測(cè)定包括在實(shí)施例中。
“團(tuán)聚”的概念定義為在熱的影響下各種成分混合的過(guò)程。產(chǎn)生的產(chǎn)品優(yōu)選是“團(tuán)聚物”或“成簇物”，其中成分相互粘附而形成具有滿意物理穩(wěn)定性的產(chǎn)品。由這類(lèi)團(tuán)聚物形成的粉塵是其物理穩(wěn)定性的指征--形成的粉塵越少，穩(wěn)定性越好。對(duì)于由團(tuán)聚物形成的粉塵的適宜的分析方法是ASAE標(biāo)準(zhǔn)S 269-1。滿意的團(tuán)聚物具有少于20％、優(yōu)選少于15％、更優(yōu)選少于10％、更加優(yōu)選少于6％的粉塵。
“在熱的影響下”指于團(tuán)聚單元出口處在產(chǎn)品上測(cè)得的溫度至少為65℃。更優(yōu)選的溫度至少為70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、或者甚至至少為130℃。
優(yōu)選的團(tuán)聚過(guò)程是在加壓下進(jìn)行。通常，壓力使成分緊密結(jié)合，任選地與橫截面或通過(guò)面積的降低相結(jié)合。優(yōu)選地，適度調(diào)整加工參數(shù)如溫度和壓力，產(chǎn)生的剪切力和剪切速度具有如此的大小以致于含有淀粉和蛋白質(zhì)的飼料成分變成流體。
“加壓”指相對(duì)于正常大氣壓壓力的增加，在團(tuán)聚單元內(nèi)部測(cè)到最大壓力。
在團(tuán)聚中通常包括添加水蒸汽(vapour)或蒸汽(steam)，但并不作為絕對(duì)必要條件。
團(tuán)聚包括但不限于眾所周知的稱為擠出、膨脹(或壓力調(diào)節(jié))和造粒(或壓粒)的過(guò)程。
擠出尤其在通過(guò)索取即可得到的來(lái)自Danish Company Sprout-Matador，Glentevej 5-7，DK-6705 Esbjergφ或Niels Finsensvej 4，DK-7100 Vejle的手冊(cè)(“Handbog i Pilleteringsteknik 1996”)第149-153頁(yè)中描述。然而，在本發(fā)明的團(tuán)聚過(guò)程中，在上述手冊(cè)中提到的下列加工步驟完全是任選的(ⅰ)在級(jí)聯(lián)混合器中預(yù)加熱飼料成分；(ⅱ)將離開(kāi)噴口-截面的產(chǎn)品切割成小片；(ⅲ)具有所需的尺寸；(ⅳ)馴化或調(diào)整；(ⅴ)包衣；(ⅵ)干燥；(ⅶ)冷卻。
膨脹過(guò)程(壓力調(diào)節(jié))尤其在上述相同手冊(cè)的第61-66頁(yè)中描述。同時(shí)對(duì)于膨脹來(lái)說(shuō)，上述加工步驟(ⅰ)-(ⅵ)，特別是步驟(ⅰ)和(ⅵ)是完全任選的步驟。
對(duì)于下列加工步驟也是同樣的(ⅱ’)粉碎產(chǎn)品(使用例如在第65頁(yè)所示的葉片制粒機(jī))；(ⅶ)將產(chǎn)品造粒(使用例如在第62頁(yè)所示的造粒壓榨機(jī))；造粒過(guò)程尤其描述在上述相同手冊(cè)的第71-107頁(yè)。這里，上述步驟(ⅰ)-(ⅶ)也是完全任選的步驟。這些步驟詳細(xì)描述在上述手冊(cè)的第29-70頁(yè)。
在本發(fā)明一優(yōu)選的團(tuán)聚加工中，包括一個(gè)或多個(gè)上述提到的其它加工步驟(ⅰ)-(ⅶ)。
特別優(yōu)選的進(jìn)一步的步驟是步驟(ⅰ)。
在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一個(gè)步驟(a)中將飼料-成分被預(yù)熱到至少45℃，優(yōu)選至少50、55、60、65、70、75、80℃的溫度；然后在第二個(gè)步驟(b)中加熱到至少65℃，優(yōu)選70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125或甚至至少130℃的溫度。
在步驟(a)之前或期間和／或步驟(b)之前或之間加入熱穩(wěn)定性植酸酶。
優(yōu)選在步驟(a)加入水。更優(yōu)選，在各成分混合(步驟(a)和／或(b))期間加入熱蒸汽。
加工步驟(a)優(yōu)選在級(jí)聯(lián)混合器(見(jiàn)上述引證的手冊(cè)第44頁(yè))中進(jìn)行。
“熱穩(wěn)定性”植酸酶是具有至少65℃ Tm(解鏈溫度)的植酸酶，使用差示掃描量熱法(DSC)在純化的植酸酶蛋白測(cè)得，優(yōu)選對(duì)于DSC來(lái)說(shuō)使用恒定加熱速度，更優(yōu)選為10℃／分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm是至少66、67、68、69、70、71、72、73、74或75℃。優(yōu)選地，Tm等于或低于150℃，更優(yōu)選等于或低于145、140、135、130、125、120、115或110℃。相應(yīng)地，優(yōu)選的Tm間隔是65-150℃、66-150℃……(等)到75-150℃；65-145℃、66-145℃……(等)到75-145℃；65-140℃……(等)到75-110℃……(等)到65-110℃、66-110℃……(等)到75-110℃。
特別優(yōu)選的Tm范圍是下列65～110℃；70～110℃；70～100℃；75～95℃或80～90℃。
在下述實(shí)施例3中，描述了由DSC測(cè)定的Tm，給出了多種植酸酶的Tm。
也指出了最適溫度，因此--可供選擇地-熱穩(wěn)定性植酸酶可被定義為具有至少60℃最適溫度的植酸酶。優(yōu)選地，最適溫度是在pH5．5的底物植酸鹽或者在pH5．0的底物植酸上測(cè)定的。優(yōu)選的設(shè)備是FYT、FTU或?qū)嵤├?的設(shè)備。實(shí)施例3的植酸酶測(cè)定是最優(yōu)選的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，最適溫度為至少61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃。優(yōu)選地，最適溫度等于或低于140℃，更優(yōu)選等于或低于135、130、125、120、115、110、105或100℃。相應(yīng)地，優(yōu)選的最適溫度間隔是60-140℃、61-140℃、……(等)至70-140℃；60-135℃、61-135℃、……(等)至70-135℃；60-130℃、……(等)至70-130℃；……(等)至60-100℃、61-100℃、……(等)至70-100℃；本發(fā)明優(yōu)選的植酸酶顯示出一定程度的與下面(iii)中所提到的任一植酸酶的全部氨基酸序列相似或同源，優(yōu)選地相同，-優(yōu)選地與共有-植酸酶-10-熱-Q50T-K91A的全部氨基酸序列至少48％，優(yōu)選至少50、52、55、60、62、65、67、70、73、75、77、80、82、85、88、90、92、95、98或99％同源。
使用本領(lǐng)域已知的任何對(duì)比程序可以測(cè)定相似或同源或者相同的程度。優(yōu)選的序列對(duì)比程序是在GCG第8版程序包中提供的GAP(Wisconsin程序包的程序手冊(cè)，第8版，1994年8月，遺傳計(jì)算機(jī)組，575科學(xué)大道(Science Drive)，Madison，Wisconsin，USA 53711)(也參見(jiàn)Needleman，S．B．和Wunsch，C．D(1970)，分子生物學(xué)雜志(Joumal of Molecular Biology)48，443-453)。多肽序列比較使用具有如下設(shè)置的GAPGAP權(quán)重(weight)為3．000和GAP縱向權(quán)重(lengthweight)為0．100。
多序列對(duì)比可以使用程序堆(program pileUp)(Wisconsin程序包的程序手冊(cè)，第8版，1994年8月，遺傳計(jì)算機(jī)組，575科學(xué)大道，Madison，Wisconsin，USA 53711)GAP權(quán)重為3．000和GAP縱向權(quán)重為0．100。
使用GAP程序，一些選擇的植酸酶顯示出與共有-植酸酶-10-熱(3)-Q50T-K91A氨基酸序列具有下列百分比的相似性(括號(hào)中的值是同一性)煙曲霉ATCC-13073α-變株 86．7％(81．8％)擔(dān)子菌共有 61．4％(49．0％)共有-植酸酶-198．7％(97．9％)共有-植酸酶-10 96．6％(94．4％)共有-植酸酶-1-熱(8)-Q50T-K91A97．4％(95．5％)共有-植酸酶-11 96．5％(94．2％)共有-植酸酶-12 92．5％(89．9％)共有-植酸酶-795．5％(93．4％)“純化的”植酸酶是指基本上不含有其它非植酸酶多肽，例如用SDS-PAGE測(cè)定純度至少約20％，優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選約60％，甚至更優(yōu)選約80％，更加優(yōu)選約90％，甚至最優(yōu)選約95％。
優(yōu)選的熱穩(wěn)定性植酸酶是EP 98113176．6(EP 0897985)中所謂的共有植酸酶，即(ⅰ)由其中描述的方法獲得的任何熱穩(wěn)定性植酸酶；(ⅱ)含有其中的圖2所示的氨基酸序列的植酸酶或其任何變體或突變蛋白，優(yōu)選的突變蛋白是那些含有取代Q50L；Q50T；Q50G；Q50T-Y51N或Q50L-Y51N的突變蛋白。
其它優(yōu)選的熱穩(wěn)定性植酸酶是(ⅲ)含有至少一種下列氨基酸序列(其中一些在本文圖5-12中顯示)的熱穩(wěn)定性植酸酶，優(yōu)選是下列植酸酶共有-植酸酶-1(或只是共有植酸酶)；共有-植酸酶-1-熱(3)；共有-植酸酶-1-熱-Q50T；擔(dān)子菌-共有(或只是擔(dān)子的)；共有-植酸酶-10(或Fcp 10)；共有-植酸酶-11(或共有序列11)；共有-植酸酶-1-熱(8)-Q50T-K91A；共有-植酸酶-1-熱(8)-Q50T；共有-植酸酶-1-熱(8)；共有-植酸酶-10-熱(3)-Q50T-K91A；共有-植酸酶-10-熱(3)-Q50T(有時(shí)，在該表達(dá)式中省略“(3)”)；煙曲霉ATCC 13073植酸酶α-變體、煙曲霉ATCC 13073植酸酶α-變體加上突變E59A、S126N、R329H、S364T、G404A；煙曲霉ATCC 13073植酸酶α-變體加上突變E59A、K68A、S126N、R329H、S364T、G404A；共有-植酸酶-7；共有-植酸酶-12。
(ⅳ)以及植酸酶(iv)和(v)的熱穩(wěn)定變體和突變蛋白，特別是那些含有一種或多種下列取代的那些變體和突變蛋白Q50L，T，G；Q50L-Y51N；Q50T-Y51N。
術(shù)語(yǔ)“植物”是指包括不僅完整植物而且也包括植物部分或器官如葉子、種子或谷粒、莖、根、塊莖、花、胼胝(callus)、果實(shí)等；組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等；以及它們的任何結(jié)合或部分結(jié)合。植物組織培養(yǎng)物和植物細(xì)胞系以及植物原生質(zhì)體也特別包括在本文中。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因植物”是指上面定義的植物，所述植物已被基因修飾，以及保留基因修飾的其子代和其繁殖物質(zhì)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物包括用重組基因技術(shù)引入祖代植物的至少一種特異基因。該術(shù)語(yǔ)不限定于單個(gè)植物品種。
本發(fā)明涉及含有編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA-構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是以含有編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA-構(gòu)建體為特征的植物群。該植物群的成員可以具有很強(qiáng)的個(gè)性，但是它們共有的熱穩(wěn)定植酸酶DNA-構(gòu)建體的特性使它們明顯區(qū)別于其它品種的植物群。
相應(yīng)地，本技術(shù)可用于一種以上的植物品種。本發(fā)明植物中不包括自然產(chǎn)生的植物品種。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及轉(zhuǎn)基因植物變種或它們的變種；轉(zhuǎn)基因植物種，轉(zhuǎn)基因植物屬，轉(zhuǎn)基因植物科和／或轉(zhuǎn)基因植物目。更優(yōu)選，將這樣的植物品種排除在外。
本發(fā)明可以使用任何熱穩(wěn)定性植酸酶，例如任何野生型植酸酶、基因工程植酸酶、共有植酸酶、植酸酶突變蛋白、和／或植酸酶變體?；蚬こ讨菜崦赴ǖ幌抻谟啥c(diǎn)誘變、基因改組(gene shuffling)、隨機(jī)誘變等制備的植酸酶。
編碼野生型熱穩(wěn)定植酸酶的核苷酸序列可以是任何起源的，包括哺乳動(dòng)物、植物和微生物起源，使用慣常方法可以從這些來(lái)源中分離出來(lái)。優(yōu)選地，核苷酸序列取自微生物，如真菌例如酵母或絲狀真菌，或細(xì)菌。使用本領(lǐng)域熟知的各種方法(參見(jiàn)例如WO98／28409和EP 0897985)可以將編碼熱穩(wěn)定植酸酶的DNA序列從產(chǎn)生植酸酶的細(xì)胞中分離出來(lái)。
編碼熱穩(wěn)定性基因工程的或共有植酸酶(包括突變蛋白或其變體)的核苷酸序列，可以按照任何方法制備，例如按照本文中實(shí)施例3和在EP0897985中所描述的方法。
為了完成熱穩(wěn)定性植酸酶在本發(fā)明植物中的表達(dá)，將編碼植酸酶的核苷酸序列插入含有調(diào)節(jié)元件或能夠引導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的序列的表達(dá)構(gòu)建體中，以及，如果需要或期望，引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌或?qū)⒒虍a(chǎn)物靶向植物種子。
為了使轉(zhuǎn)錄發(fā)生，將編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的核苷酸序列可操作地連接到能夠介導(dǎo)所研究的植物轉(zhuǎn)錄的適宜啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子。典型地，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子介導(dǎo)以組織-特異性或生長(zhǎng)-階段特異性方式的轉(zhuǎn)錄，而組成型啟動(dòng)子在所有細(xì)胞組織中提供持續(xù)轉(zhuǎn)錄。適于本發(fā)明的適宜組成型啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。優(yōu)選的組成型啟動(dòng)子的進(jìn)一步的實(shí)例是來(lái)自土壤桿菌屬的腫瘤-誘導(dǎo)質(zhì)粒(Ti)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列如章魚(yú)氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶或甘露氨酸合成酶。
適宜的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括，種子-特異性啟動(dòng)子如小麥種子中表達(dá)α-淀粉酶的啟動(dòng)子(見(jiàn)Stefanov等，Acta Biologica Hungarica第42卷，第4期第323-330(1991))，編碼水稻種子儲(chǔ)藏蛋白如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白的基因的啟動(dòng)子(Wu等，植物和細(xì)胞生理學(xué)(Plant and CellPhysiology)第39卷第8期第885-889頁(yè)(1998))，來(lái)自豆球蛋白B4和來(lái)自Conrad U等在植物生理學(xué)雜志(Journal of Plant Physiology)第152卷第6期第708-711頁(yè)(1998)描述的蠶豆的未知種子蛋白基因的蠶豆(vicia faba)啟動(dòng)子，來(lái)自Brassica napus的儲(chǔ)藏蛋白napA啟動(dòng)子，或者本領(lǐng)域已知的任何其它種子特異性啟動(dòng)子，如在WO91／14772中描述的。
為了增加熱穩(wěn)定性植酸酶的表達(dá)，希望使用啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子可以是置于啟動(dòng)子和淀粉酶基因之間的內(nèi)含子。內(nèi)含子可以是來(lái)自水稻W(wǎng)axy(Wx)基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Li等，植物科學(xué)(Plant Science)第108卷第2期第181-190頁(yè)(1995))，來(lái)自玉米Ubil(遍在蛋白)基因的第一個(gè)內(nèi)含子(Vain等，植物細(xì)胞報(bào)告(Plant Cell Reports)第15卷第7期第489-494頁(yè)(1996))或者來(lái)自Actl(肌動(dòng)蛋白)基因的第一個(gè)內(nèi)含子。作為雙葉內(nèi)含子的實(shí)例，提到了chsA內(nèi)含子(Vain等，出處同上)。而且，種子特異增強(qiáng)子可用于增加種子中熱穩(wěn)定性植酸酶的表達(dá)。種子特異性增強(qiáng)子的一個(gè)實(shí)例是由Vandergeest和Hall在植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)第32卷第4期第579-588頁(yè)(1996)所公開(kāi)的一個(gè)衍生自編碼豆(菜豆)主要種子儲(chǔ)存蛋白的β-菜豆球蛋白基因。
此外，表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選含有使熱穩(wěn)定性植酸酶基因信號(hào)轉(zhuǎn)錄終止的終止子序列如rbcS2’和nos3’終止子。
為了便于篩選成功轉(zhuǎn)化的植物，表達(dá)構(gòu)建體還應(yīng)當(dāng)優(yōu)選包括一種或多種標(biāo)志，如抗生素抗性選擇性標(biāo)志或提供除草劑抗性的選擇性標(biāo)志。一種廣泛應(yīng)用的選擇性標(biāo)志是提供卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)。其它適宜標(biāo)志的實(shí)例包括提供可測(cè)得酶活性的標(biāo)志如二氫葉酸還原酶、螢光素酶和b-葡糖醛酸酶(glucoronidase)(GUS)。膦絲菌素乙基轉(zhuǎn)移酶可與除草劑basta或bialaphos聯(lián)合用作選擇性標(biāo)志。
本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物可以按照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備。所用的轉(zhuǎn)化方法將取決于要被轉(zhuǎn)化的植物種屬并可選自本領(lǐng)域已知的任何轉(zhuǎn)化方法如土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zambryski等，EMBO Journal 2，第2143-2150頁(yè)，1993)、粒子轟擊、電穿孔(Fromm等，1986年，自然(Nature)319，第791-793頁(yè))，和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。對(duì)于單葉的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選胚胎細(xì)胞系或培養(yǎng)胚胎的粒子轟擊(即biolistic轉(zhuǎn)化)。下面，列出參考文獻(xiàn)，其中公開(kāi)了轉(zhuǎn)化各種植物的各種方法水稻(Cristou等，1991，生物技術(shù)(Bio／Technology)9，第957-962頁(yè))、玉米(Gordon-Kamm等，1990，植物細(xì)胞(Plant Cell)2，第603-618頁(yè))、燕麥(Somers等，1992，生物技術(shù)(Bio／Technology)10，第1589-1594頁(yè))、小麥(Vasil等，1991，生物技術(shù)(Bio／Technology)10，第667-674頁(yè)，Weeks等，1993，植物生理學(xué)(Plant Physiology)102，第1077-1084)和大麥(Wan和Lemaux 1994，植物生理學(xué)(Plant Physiology)102，第37-48頁(yè)，review Vasil1994，植物分子生物學(xué)(Plant Mol．Biol．)25，第925-937)。
更具體而言，土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以按照下列方法很方便地完成構(gòu)建攜帶熱穩(wěn)定性植酸酶的載體系統(tǒng)。載體系統(tǒng)可以包括一個(gè)載體，但是也可以包括兩個(gè)載體。如果是兩個(gè)載體的話，載體系統(tǒng)被看作是雙載體系統(tǒng)(Gynheung An等(1980)，雙載體，植物分子生物學(xué)手冊(cè)(PlantMolecular Biology Manual)A3，第1-19頁(yè))。
基于土壤桿菌屬的植物轉(zhuǎn)化載體由大腸桿菌和土壤桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)以及細(xì)菌選擇標(biāo)志構(gòu)成。對(duì)于植物的轉(zhuǎn)化，來(lái)自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)?；蛘邅?lái)自發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒的右側(cè)并且優(yōu)選還有左側(cè)邊緣是必要的。在兩側(cè)邊緣之間放置含有熱穩(wěn)定性植酸酶基因和適宜的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和終止子序列的表達(dá)構(gòu)建體。另外，將來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn5的選擇基因如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)基因和報(bào)告基因如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因克隆在邊緣之間。用上述載體轉(zhuǎn)化裝載含有病毒基因的輔助質(zhì)粒的disarmed土壤桿菌株。然后將轉(zhuǎn)化后的土壤桿菌株用于植物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明也涉及制備能夠表達(dá)熱穩(wěn)定性植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括下列步驟(ⅰ)分離編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的核苷酸序列；(ⅱ)將(ⅰ)的核苷酸序列插入能夠介導(dǎo)該核苷酸序列在選定的宿主植物進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體中；和(ⅲ)用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化選定的宿主植物。
當(dāng)相對(duì)于熱穩(wěn)定性植酸酶使用時(shí)，用“至少一種”代替“一種”的上述方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
該方法基本上是非-生物學(xué)方法。
任何植物可以被選作宿主植物。更具體而言，植物可以是雙葉或單葉植物，簡(jiǎn)稱雙葉或單葉。主要感興趣的是可能成為食物或飼料成分的那些植物。這些植物可以含有植酸。單葉植物的實(shí)例是草類(lèi)如牧草(蘭草，Poa)，飼草如羊茅屬、毒麥屬，溫草如翦股潁屬，谷類(lèi)如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱和玉米。
雙葉植物的實(shí)例是豆類(lèi)如羽扇豆、豌豆、黃豆和大豆，十字花科類(lèi)(蕓苔科)如花椰菜、油菜和非常相關(guān)的典型生物(model organism)擬南芥。
特別感興趣的是單葉植物，尤其是農(nóng)作物或谷類(lèi)植物如小麥(小麥屬，如夏令小麥)大麥(Hardeum，如普通小麥)、燕麥、黑麥、稻米、高粱和玉米(玉米屬，玉米)。
另外特別感興趣的是雙葉植物，如上面提到的那些植物。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，祖代植物或宿主植物本身是期望的飼料成分。
實(shí)施例實(shí)施例1FYT-分析-分析植酸酶制劑使用下列分析能夠測(cè)定植酸酶的活性10μl稀釋的酶樣品(稀釋在0．1M醋酸鈉、0．01％吐溫20，pH5．5中)加入到250μl 5mM植酸鈉在0．1M醋酸鈉、0．01％吐溫20、pH5．5的溶液中(溶解植酸鈉后調(diào)節(jié)pH，將底物預(yù)熱)，于37℃孵育30分鐘。加入250μl 10％TCA終止反應(yīng)，加入500μl7．3g FeSO4在100ml鉬酸鹽試劑(2．5g (NH4)6Mo7O24·4H2O在8mlH2SO4的溶液稀釋到250ml)中的溶液中來(lái)測(cè)定游離的磷酸鹽。在96孔微量滴定板上測(cè)定200μl樣品在750nm處的吸光度。包括底物和酶的空白樣。也包括磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-2mM磷酸鹽)。在給定條件下，1FYT等于釋放1μmol磷酸鹽／分鐘的酶的量。該分析法優(yōu)選用于植酸酶制劑(在沒(méi)有與其它飼料成分混合時(shí))。
實(shí)施例2FTU分析-分析與飼料成分混合的植酸酶1FTU定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，pH5．5；反應(yīng)時(shí)間為60分鐘，植酸起始濃度為5mM)釋放相當(dāng)于每分鐘1μmol磷酸鹽的酶的量。
1FTU=1FYTFTU分析優(yōu)選用于動(dòng)物飼料預(yù)混物和類(lèi)似的復(fù)合組合物的植酸酶活性的測(cè)定。
試劑／底物飼料等的提取緩沖液該緩沖液也用于制備PO4-標(biāo)準(zhǔn)物和預(yù)混合樣品的進(jìn)一步稀釋。
pH5．5的含有吐溫20的0．22M醋酸鹽緩沖液稱量出每升30g三水醋酸鈉(MW=136．08g／mol)例如Merck Art 46267和每升0．1g吐溫20例如Merck Art 22184。
將醋酸鈉溶于去離子水中。
加入吐溫20，用醋酸調(diào)節(jié)pH為5．50±0．05。
加入去離子水補(bǔ)足總?cè)莘e。
預(yù)混物的提取緩沖液含有吐溫20、EDTA、PO43-和BSA的0．22M醋酸鹽緩沖液。
每升30g三水醋酸鈉如Merck Art 6267。
每升0．1g吐溫20如Merck Art 22184。
每升30g EDTA如Merck Art 8418。
每升20gNa2HPO4·2H2O如Merck Art 6580。
每升0．5g BSA(牛血清白蛋白，如Sigma Art A-9647)。
這些成分溶于去離子水中，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5．50±0．05。
加入去離子水補(bǔ)足總?cè)莘e。
BSA不穩(wěn)定，因而必須在緩沖液使用當(dāng)天加入。
50mM PO43-儲(chǔ)備溶液稱量0．681g KH2PO4(MW=136．09g／mol)如Merck Art 4873，溶于100ml pH5．5的含有吐溫的0．22M醋酸鈉溶液中。
儲(chǔ)存穩(wěn)定性在冰箱中1周。
不含吐溫的pH5．5的0．22M醋酸鹽緩沖液該緩沖液用于配制植酸底物。
稱量出150g三水醋酸鈉(MW=136．08)如Merck Art 6267并溶于去離子水中，用醋酸調(diào)節(jié)pH至5．50±0．05。
加入去離子水至5000ml。
儲(chǔ)存穩(wěn)定性室溫下1周。
植酸底物；5mM植酸根據(jù)所用的批中水的含量可以計(jì)算出植酸的體積。
例如，如果水的含量為8．4％，則按下面的計(jì)算得到0．005mol／l×932．8g／mol=5．04g／l(1÷0．084)稱量植酸(Na-鹽)(MW=923．8g／mol)如Sigma P-8810并溶于0．22M醋酸鹽緩沖液(不含吐溫)中。稀釋醋酸的加入增加了溶解速度。
用醋酸調(diào)節(jié)pH至5．50±0．05。
加入0．22M醋酸鹽緩沖液至總?cè)莘e。
21．7％硝酸溶液用于終止溶液。
1份濃縮的(65％)硝酸與2份去離子水混合。
鉬酸鹽試劑用于終止溶液。
100g四水六鉬酸氨(NH4)6Mo7O24·4H2O如Merck Art 1182溶于去離子水中。加入10ml 25％的NH3。
加入去離子水至1升。
0．24％釩酸銨購(gòu)自fra Bie & Berntsen。
鉬酸鹽／釩酸鹽終止溶液1份釩酸鹽溶液(0．24％釩酸銨)+1份鉬酸鹽溶液混合。加入2份21．7％的硝酸溶液。
使用前不超過(guò)2小時(shí)時(shí)制備該溶液并用錫箔包裹瓶子。
樣品冷凍樣品在冰箱中解凍過(guò)夜。
飼料樣品的大小至少70g，優(yōu)選100g。
飼料樣品選擇溶液的體積以使得加入10倍于樣品重量的緩沖液，例如將100g溶于1000ml 0．22M含有吐溫的醋酸緩鹽沖溶液中，見(jiàn)刻度圈(erclosure)1。四舍五入至最接近的溶液容積。
如果樣品大小接近100g，將所有樣品在咖啡研磨機(jī)中進(jìn)行研磨，接下來(lái)放入配衡燒杯中。記錄樣品重量。不必要研磨不-成粒的樣品。如果樣品太大而難以操作，則將樣品分裂為大約100g的各份。
將磁鐵放入燒杯中，加入0．22M含有吐溫的醋酸鹽緩沖液。
提取樣品90分鐘。
提取后，靜置樣品30分鐘以使飼料沉淀。用移液管取出5ml樣品。樣品是在溶液表面下2-5cm處取出的，將樣品放入離心玻璃管中，加蓋。
以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。
預(yù)混合樣品選擇溶液的體積以使得加入10倍于樣品重量的緩沖液。四舍五入至最接近的溶液容積。
樣品稱量好后(50-100g)，將所有樣品放入配衡燒杯中。記錄樣品重量。如果樣品太大而難以操作，則將樣品分裂為大約100g的各份。
將磁鐵放入燒杯中，加入0．22M含吐溫、EDTA和PO43-的醋酸鹽緩沖液。
提取樣品60分鐘。
提取后，靜置樣品30分鐘以使預(yù)混合物沉淀。用移液管取出5ml樣品。樣品是在溶液表面下2-5cm處取出的，將樣品放入離心玻璃管中，加蓋。
樣品于4000rpm下離心10分鐘。
分析直接分析飼料樣品提取物。
將預(yù)混合物的提取物稀釋至約1．5FTU／g(A415(主樣品)＜1．0)。
將0．22M含有吐溫20的醋酸緩沖液用于稀釋。
主樣品從提取和離心的樣品中取出2×100ml的上清液置于標(biāo)記的玻璃試管中，每個(gè)管中放入一根磁鐵。
所有樣品準(zhǔn)備好后，將樣品置于伴有攪拌的水浴中。溫度37℃。
加入3．0ml底物。
加入底物后孵育正好60分鐘。
將樣品從水浴中取出，加入2．0ml終止溶液(加入底物后精確地為60分鐘)。
攪拌樣品1分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
在4000rpm下將飼料樣品離心10分鐘(不必要離心預(yù)混合物樣品)。
盲樣品從提取和離心的樣品中取出100ml上清液置于標(biāo)記的玻璃試管中，每個(gè)管中放入一根磁鐵。
向樣品中加入2．0ml終止溶液。
向樣品中加3．0ml底物。
室溫下孵育樣品60分鐘。
攪拌樣品1分鐘或更長(zhǎng)些。
在4000rpm下離心飼料樣品10分鐘(不必要離心預(yù)混合物樣品)。
標(biāo)準(zhǔn)品從8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的每一個(gè)中取出2×100ml，以及4×100ml 0．22M醋酸緩沖液(盲試劑)。
測(cè)定所有樣品的A415。
計(jì)算
FTU／g=μmol PO43-(分鐘*g(樣品))稱量出Cg樣品(研磨后)。
從提取和離心的樣品中取出100μl。
PO43-標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的。
從PO43-標(biāo)準(zhǔn)物的回歸曲線可以找到樣品的實(shí)際濃度(濃度單位是mM)[PO43-]=(x-b)／a x=A415a=斜率 b=與y軸的截距μmol PO43-／分={[PO43-](mM)×體積(升)×1000μmol／mmol}／tt=以分鐘為單位的孵育時(shí)間。
體積=以升為單位的樣品體積=0．0001升。
1000=由mmol到μmol的轉(zhuǎn)化系數(shù)。
FTU／G檢驗(yàn)={(x-b)×體積×1000×Fp}／{a×t×C}C=稱量出來(lái)的樣品克數(shù)Fp=取出的樣品與總樣品(提取后)之間的關(guān)系。實(shí)例從1000ml中取出0．100ml→Fp=1000／0．100=10000。
將下列值代入的簡(jiǎn)化表達(dá)式為t=60體積=0．00011Fp=10000FTU／g樣品={(x-b)×0．0001×1000×10000}／{a×60×C}實(shí)施例3測(cè)定各種植酸酶的最適溫度和熔點(diǎn)Tm已經(jīng)測(cè)定了各種植酸酶的熱穩(wěn)定性，即熔化溫度，Tm，和／或最適溫度。
按照EP 0420358和van Hartingsveldt等(基因(Gene)，127，87-94，1993)所述制備黑曲霉NRRL 3135的植酸酶。
按照EP-0897985和其中的文獻(xiàn)描述的方法制備煙曲霉ATCC 13073、土曲霉9A-1、土曲霉CBS 116．46、構(gòu)巢曲霉、嗜熱毀絲霉和嗜熱踝節(jié)菌的植酸酶。
EP 0897985中顯示共有-植酸酶-1(圖5)和共有-植酸酶-1-Q50T并描述了其制備。
根據(jù)EP-0897985(分別為實(shí)施例1-2和3-7)中描述的技術(shù)衍生和制備共有-植酸酶-10，然而向圖1序列中加入Thermomyces lanuginosa(Berka等，Appl．Environ．Microbio1．64，4423-4427，1998)，擔(dān)子菌共有序列(按照下面描述衍生)-省略黑曲霉T213的序列，賦予余留的黑曲霉植酸酶序列權(quán)重0．5。圖7顯示共有-植酸酶-10序列的衍生。
擔(dān)子菌共有序列也根據(jù)EP-0897985的原則誘導(dǎo)，即由WO98／28409的5個(gè)擔(dān)子菌植酸酶，以成熟植酸酶(排除信號(hào)肽)的第一個(gè)氨基酸殘基開(kāi)始。賦予兩個(gè)Paxillus植酸酶權(quán)重0．5，賦予所有其它基因權(quán)重1．0，見(jiàn)圖6。
類(lèi)似于EP-0897985中實(shí)施例5-8的方法，通過(guò)引入三個(gè)回復(fù)-突變K94A、V158I和A396S(“熱(3)”或“熱”)，以及也可使用突變Q50T或Q50T-K91A，而由共有-植酸酶-10制備突變蛋白共有-植酸酶-10-熱、共有-植酸酶-10-熱-Q50T-K91A(圖10)和共有-植酸酶-10-熱-Q50T。
類(lèi)似于EP-0897985中實(shí)施例8的方法，通過(guò)引入八個(gè)突變E58A、D197N、E267D、R291I、R329H、S364T、A379K和G404A(“熱(8)”)，以及，也可使用突變Q50T或Q50T-K91A，而由共有-植酸酶-1制備突變蛋白共有-植酸酶-1-熱(8)、共有-植酸酶-1-熱(8)-Q50T-K91A(圖9)和共有-植酸酶-1-熱(8)-Q50T。
通過(guò)引入三個(gè)突變K94A、V158I和A396S而由共有-植酸酶-1制備共有-植酸酶-1-熱(3)。
按照上述總體描述，制備表1中所示的煙曲霉所謂的α-變株(突變?yōu)镼51(27)T、F55Y、V100I、F114Y、A243L、S265P、N294D突變)和它們的其它突變蛋白。位置編號(hào)指本文的圖11，括號(hào)中的數(shù)字指在EP0897010中使用的編號(hào)。
根據(jù)例如EP 0897985的描述可以制備編碼上述熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA構(gòu)建體。為使它們?cè)谥参锉磉_(dá)，參考本發(fā)明的描述。
為了測(cè)定植酸酶的解疊溫度或熔化溫度，Tm，使用以前由Brugger等(1977)公布的差示掃描量熱法“用差示掃描量熱法研究植酸酶和pH2．5酸性磷酸酶的熱變性”，植酸鹽和植酸酶的生物化學(xué)(Rasmussen編著，S．K；Raboy，V．；Dalbφge，H．和Loewus，F(xiàn)．；Kluwer學(xué)術(shù)出版社出版)。
配制50-60mg／ml蛋白質(zhì)的均相的或純化的植酸酶溶液，用pH5．0 10mM醋酸鈉進(jìn)行廣泛透析。以10℃／分的恒定加熱速度加熱至90-95℃。
對(duì)上述植酸酶測(cè)得的Tm的結(jié)果見(jiàn)下面表1；對(duì)選擇的植酸酶的測(cè)定結(jié)果也由圖1-4所示。
在下表1中，也給出了各種植酸酶的最適溫度。對(duì)于此測(cè)定，植酸酶的活性基本上是根據(jù)Mitchell等(微生物學(xué)(Microbiology)143；245-252，1997)的描述進(jìn)行測(cè)定的在含有0．5％植酸(～5mM)的pH5．0的200mM醋酸鈉的分析混合物中測(cè)定酶的活性。于37℃孵育15分鐘后，加入等體積的15％三氯乙酸終止反應(yīng)。通過(guò)100μl分析混合物與900μl H2O和1ml的0．6MH2SO4、2％抗壞血酸及0．5％鉬酸銨進(jìn)行混合來(lái)測(cè)量釋出的磷酸鹽。將磷酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)溶液用作參照。一個(gè)單位酶活性定義為37℃下每分鐘釋放1μmol磷酸鹽的酶的量。根據(jù)Pace等(蛋白質(zhì)科學(xué)(Prot．Sci．)4；2411-2423，1995)等的描述，利用在280nm下的酶消光系數(shù)測(cè)定蛋白濃度共有植酸酶，1．101；共有植酸酶7，1．068；共有植酸酶10，1．039。
為測(cè)定最適溫度，酶(100μl)和底物溶液(100μl)在指定溫度下預(yù)熱5分鐘。向酶中加入底物溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。孵育15分鐘后，用三氯醋酸終止反應(yīng)，測(cè)定釋出的磷酸鹽的量。植酸酶活性對(duì)溫度作圖，植酸酶活性達(dá)到最大值時(shí)的溫度即是最適溫度。
表1各種植酸酶的最適溫度和Tm
權(quán)利要求
1．制備動(dòng)物飼料的方法，所述方法包括飼料成分的團(tuán)聚，其中在團(tuán)聚前或團(tuán)聚期間加入熱穩(wěn)定性植酸酶。
2．權(quán)利要求1所述方法，其中飼料成分被加熱到至少65℃的溫度。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中熱穩(wěn)定性植酸酶是具有用DSC測(cè)得的Tm為至少65℃的植酸酶，DSC使用的是10℃／分鐘的恒定加熱速度。
4．權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，在飼料膨脹機(jī)中進(jìn)行。
5．權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述方法，在擠出機(jī)中進(jìn)行。
6．權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述方法，在造粒壓榨機(jī)中進(jìn)行。
7．權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述方法，其中熱穩(wěn)定性植酸酶存在于轉(zhuǎn)基因植物中。
8．權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法，其中團(tuán)聚包括下列步驟(a)將飼料成分預(yù)熱到至少45℃的溫度；和(b)加熱步驟(a)的產(chǎn)物到至少65℃的溫度；其中熱穩(wěn)定性植酸酶是在步驟(a)和／或(b)之前或期間加入的。
9．一種轉(zhuǎn)基因植物，其含有編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA-構(gòu)建體。
10．權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA-構(gòu)建體可操作地與能夠介導(dǎo)所述植酸酶編碼序列在至少植物的一部分中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列連接。
11．含有編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的DNA構(gòu)建體的表達(dá)構(gòu)建體，可操作地與能夠介導(dǎo)所述植酸酶編碼序列在植物的至少一部分中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列連接。
12．一種載體，其含有權(quán)利要求11所述的表達(dá)構(gòu)建體。
13．制備能夠表達(dá)熱穩(wěn)定性植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括下列步驟(ⅰ)離編碼熱穩(wěn)定性植酸酶的核苷酸序列；(ⅱ)將(ⅰ)的核苷酸插入到能夠介導(dǎo)該核苷酸序列在選定的宿主植物中表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體中；和(ⅲ)用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化選定的宿主植物。
14．權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括從植物中提取植酸酶的步驟。
全文摘要
熱穩(wěn)定性植酸酶在動(dòng)物飼料制劑中的應(yīng)用和該植酸酶在植物中的表達(dá)。為了制備動(dòng)物飼料,在團(tuán)聚步驟之前或期間加入熱穩(wěn)定性植酸酶。優(yōu)選的方法是造粒、擠出和膨脹。表達(dá)熱穩(wěn)定性植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物可以直接用于動(dòng)物飼料制劑中。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1293542SQ99804009
公開(kāi)日2001年5月2日 申請(qǐng)日期1999年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月23日
發(fā)明者斯文德·彼得森 申請(qǐng)人:諾維信公司 被以下專利引用 (1),