專利名稱：一種生產(chǎn)生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)生物酶制劑和酵母 飼料蛋白的方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和技術(shù)的不斷進(jìn)步，自20世紀(jì)60年代以來，味精生產(chǎn) 量逐年上升,目前我國已經(jīng)成為味精的生產(chǎn)和消費(fèi)大國。味精產(chǎn)量的不斷提高，味 精工業(yè)廢水對環(huán)境造成的污染問題日趨突出。而這些廢水的主要來源是在味精提 取過程中產(chǎn)生的離子交換尾液(簡稱離交尾液)。味精廢水的離交尾液中COD (化 學(xué)需氧量)、硫酸根和氨氮的含量非常高。因此味精廢水的處理成為制約味精生 產(chǎn)企業(yè)發(fā)展的重大難題。
近年來，國內(nèi)外眾多專家對味精廢水的治理進(jìn)行了大量研究，主要方法包括 物化處理、厭氧生物處理和好氧生物處理法。物化處理法COD去除率僅達(dá)30 40 %。厭氧生物處理雖然運(yùn)行費(fèi)用較低，但在厭氧環(huán)境下，高濃度氨氮和硫酸根對 甲烷菌具有較強(qiáng)的毒害和抑制作用，因此一般要采用預(yù)先脫硫脫銨、稀釋進(jìn)水等
措施，從而增加處理成本。好氧生物處理在處理高濃度有機(jī)廢水時易產(chǎn)生污泥膨 脹，因此也必須將廢水大量稀釋。目前一些味精廠利用離交尾液生產(chǎn)詞料酵母(通 常是熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母)，這種方法能夠去除40% 60n/。的COD，而 且產(chǎn)生的菌體能夠作為飼料蛋白得到利用。但飼料酵母法要求經(jīng)常性地進(jìn)行菌種 培養(yǎng)和比較嚴(yán)格的無菌條件，同時利用該法生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞干物質(zhì)較低， 約20 30g/L，這樣在后提取過程中需要消耗大量的熱能和電能，使得生產(chǎn)成本居高不下，而且由于上述酵母不能夠利用銨基氮因而生產(chǎn)的酵母蛋白產(chǎn)品仍含有較 高的銨基氮，對產(chǎn)品的質(zhì)量影響較大。因此尋求一種較理想的解決方案是擺在科 研人員面前的一項重大課題。
磷是動物生長、繁殖、骨骼礦化及代謝所必需的礦物元素之一。作為動物飼 料主要成分的植物性飼料中雖含有相當(dāng)數(shù)量的總磷，但其中50% 70%是以植酸 磷(六磷酸肌醇)的形式存在，單胃動物缺乏分解植酸磷所必需的酶，故磷的利用 率僅有0 % 40 %，從而造成磷源浪費(fèi)、飼料成本增加和動物生產(chǎn)性能的降低。同 時，植酸磷不能被動物有效利用，而直接排出體外還會造成嚴(yán)重的土壤和水源的 磷污染。另外，植酸磷在動物胃腸道的消化吸收過程中，還會與多種金屬離子和 蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，影響這些營養(yǎng)元素的有效利用。
植酸酶可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其對單胃動物的飼喂效果己得到了廣 泛的確證。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40 %，從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，它還可降低植酸鹽的抗?fàn)I養(yǎng)作用，因此對提 高畜牧生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的污染有重要意義。植酸酶廣泛存在于微生物、 麥芽、種子等中，但含量低，難以獲得大量產(chǎn)品，價格昂貴，從而一直限制著植 酸酶的推廣利用。通過基因工程的手段，已經(jīng)實現(xiàn)了在生物反應(yīng)器中高效表達(dá)植 酸酶基因，從而大幅度降低了植酸酶生產(chǎn)的成本。
畢赤酵母本身具有很好的安全性，自20世紀(jì)70年代起建立的以巴斯德畢赤 酵母作為單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)菌的高密度發(fā)酵方法己經(jīng)成熟，干細(xì)胞產(chǎn)量可高達(dá)100g/ L。同時，利用基因工程構(gòu)建的重組酵母中也不帶任何抗藥性標(biāo)記，所以重組酵母 本身作為飼料蛋白是安全的
發(fā)明內(nèi)容
為了解決氨基酸生產(chǎn)過程中離交尾液的污染和再利用問題，本發(fā)明的發(fā) 明人提出并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法。
根據(jù)本發(fā)明的方法以表達(dá)所述生物酶的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，以氨基酸 生產(chǎn)離子交換尾液為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)種子培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵和離心分離制 得所述的生物酶制劑和酵母飼料蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)實際的研究 和生產(chǎn)需求，將某特定酶的編碼基因?qū)氘叧嘟湍钢?，從而?gòu)建重組畢赤酵母。 巴斯德畢赤酵母是近十年來發(fā)展起來的較為完善的，被廣泛用來表達(dá)外源蛋白的 甲醇營養(yǎng)型酵母菌。在高效表達(dá)載體中最常用的啟動子是A0X1啟動子，它的甲 醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)，使在它控制下的外源基因能得到較高的表達(dá)。PGAP(三磷酸甘油醛 脫氫酶啟動子)是最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子，由于該 組成型啟動子不需甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵工藝更為簡單，而同時其產(chǎn)量很高，所以成為代 替PA0X1的最有潛力的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以將大腸桿菌的植酸酶 appA克隆到PGAP啟動子上，在流加葡萄糖的情況下可以組成性高效表達(dá)植酸酶， 來源于大腸桿菌的植酸酶appA具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)和較高的比活。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述酶為能在畢赤酵母中組成性表達(dá)的酶，優(yōu) 選植酸酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶、更優(yōu)選 來源于大腸桿菌的植酸酶appA。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述氨基酸為可用離子交換方法提取的氨基酸， 優(yōu)選谷氨酸或賴氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，在所述種子培養(yǎng)步驟中
所用種子培養(yǎng)基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間為20~24小時，溫度30'C，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。 根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，在所述液體深層發(fā)酵步驟中
所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方氨基酸生產(chǎn)離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/ 噸、CaS04 l.Okg/噸、MgS04 8kg/噸、用KOH調(diào)pH值5.0，培養(yǎng)過程中連續(xù)流 加50%的葡萄糖，流加量為2 10ml/L/h;
發(fā)酵培養(yǎng)條件在5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵時間60 64小時，溫度30'C，通風(fēng)量 1.5 2.0wm，攪拌轉(zhuǎn)速1000 rpm ， pH值用氨水維持在5.0，發(fā)酵過程溶氧不低于 20%。
本發(fā)明提出了一種處理工業(yè)廢水的方法，氨基酸生產(chǎn)過程中的離子交換尾液 通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)飼料用酶制劑和酵母飼料蛋白，利用重組畢赤酵母在富含 銨基氮的離子交換尾液中快速生長，并可以大幅度降低發(fā)酵液中銨基氮離子，提 升酵母蛋白產(chǎn)品的品質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，不僅減少了工業(yè)廢水的處理成本， 降低了對環(huán)境的污染，而且還將工業(yè)廢水變廢為寶，生產(chǎn)出較高價值的產(chǎn)品；用 該工業(yè)廢水經(jīng)液體深層發(fā)酵可制備植酸酶，酶活達(dá)到3025 u/ml，可添加到飼料中。 植酸酶可使飼料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性詞料中磷的利用率， 減少動物糞便中磷的排出量，從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，因此對提高畜牧
生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的污染有重要意義。


圖1為發(fā)酵過程培養(yǎng)曲線。
具體實施例方式
培養(yǎng)基成份
種子培養(yǎng)基(YPD): 1%酵母提取物(進(jìn)口)， 2%蛋白胨(進(jìn)口)， 2%葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/噸、CaS04 1.0 kg/噸、 MgSO48kg/噸、用KOH調(diào)pH值5.0。
PTM1成份
硫酸銅6.0g/L，碘化鉀0.18 g/L，硫酸錳10 g/L，鉬酸鈉0.2 g/L，硼
酸0.02 g/L，氯化鈷0.5 g/L，氯化鋅20 g/L，硫酸亞鐵65 g/L，硫酸5.0 mL/L(以
上成份配制后單獨(dú)高壓滅菌)，生物素0.2g/L(過濾滅菌)。
1、 種子液制備
從斜面上刮取兩環(huán)菌種，置于裝有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中進(jìn)行 種子培養(yǎng)。條件為培養(yǎng)時間24小時，溫度30 °C，搖床轉(zhuǎn)速250 rpm。再以10% 接種量接入裝有200 ml種子培養(yǎng)基的1000 ml三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為培 養(yǎng)時間24小時，溫度3(TC，搖床轉(zhuǎn)速250rpm。此時菌液的0D值應(yīng)達(dá)到12(以上)。
2、 發(fā)酵生產(chǎn)
在5L發(fā)酵罐內(nèi)裝3.0 L發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1 ， 5 10%接種種子液，溫度30。C，通風(fēng)量為1.6 0L/L/min， 1000卬m攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過 程中連續(xù)流加50% (w/v)葡萄糖(每升中含12mLPTMl)，流加量為2 8mL/h/L， pH用氨水維持在5.0，溶氧維持在20%以上。培養(yǎng)結(jié)束時，酶活可以達(dá)到3025 U/mL，菌體干重達(dá)到120-130 g/L (如圖1所示)。
3、 植酸酶活性測定的原理與定義
植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物， 在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的(NH4)3P04NH4V03 '16MoCb復(fù)合 物，在波長415nm下進(jìn)行比色測定。樣品在底物濃度為5.0mmol/L、溫度37。C、 pH值5.0的條件下，每分鐘從植 酸鈉中釋放l^mol無機(jī)磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法，其特征在于，所述方法以表達(dá)所述生物酶的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，以氨基酸生產(chǎn)離子交換尾液為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)種子培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵和離心分離制得所述生物酶制劑和酵母飼料蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶為能在畢赤酵母中組成性表達(dá)的酶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶為植酸酶、木聚 糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或半乳糖苷酶。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶為來源于大腸桿菌 的植酸酶appA。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為可用離子 交換方法提取的氨基酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸或 賴氨酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述種子培養(yǎng)步驟中 所用種子培養(yǎng)基配方1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間為20-24小時，溫度3(TC，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述液體深層發(fā)酵步驟中所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方氨基酸生產(chǎn)離子交換尾液300 kg/噸、KH2P04 5 kg/ 噸、CaS04 l.Okg/噸、MgS04 8kg/噸、用KOH調(diào)pH值5.0，培養(yǎng)過程中連續(xù)流 加50%的葡萄糖，流加量為2 10ml/L/h;發(fā)酵培養(yǎng)條件在5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵時間60-64小時，溫度30'C，通風(fēng)量 1.5 2.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速1000 rpm , pH值用氨水維持在5.0，發(fā)酵過程溶氧不低于 20%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)生物酶制劑和酵母飼料蛋白的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法以表達(dá)所述生物酶的重組畢赤酵母為出發(fā)菌株，以氨基酸生產(chǎn)離子交換尾液為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)種子培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵和離心分離制得所述含生物酶制劑和酵母飼料蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方法，不僅減少了工業(yè)廢水的處理成本，降低了對環(huán)境的污染，而且還將工業(yè)廢水變廢為寶，生產(chǎn)出較高價值的產(chǎn)品。植酸酶可使飼料中的植酸磷降解成肌醇和磷酸，提高植物性飼料中磷的利用率，減少動物糞便中磷的排出量，從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，因此對提高畜牧生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的污染有重要意義。
文檔編號C12N1/19GK101298596SQ20071009895
公開日2008年11月5日 申請日期2007年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者史秀云, 斌 姚, 昆 孟, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬軍, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所