專利名稱：水稻的與耐逆性相關(guān)的dreb類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及來源于水稻AP2/EREBP家族的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在培育耐逆性提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、低溫和高鹽等環(huán)境脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素。在這些脅迫因素的影響下，植物體內(nèi)有很多基因受誘導(dǎo)而表達(dá)，并且它們的表達(dá)產(chǎn)物能夠減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存(Shinozaki，K.and Yamaguchi-Shinozaki，K.(1994).Molecular responses to drought and cold stress.Curr.Opin.Biotechnol 7，161-167)。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物；第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducibletranscription factor.Nature biotechnol.17，287-291)。其中，轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起到重要作用。
轉(zhuǎn)錄因子和植物基因啟動子中的順式元件的相互作用是調(diào)節(jié)抗逆相關(guān)基因表達(dá)的重要途徑(Kazuo shinozaki，Kazuko Yamaguchi，Sehi M.2003 Regulatory networkof gene expression in the drought and cold stress responses.Current opinionin plant biology 6，410-417.)。植物對干旱的應(yīng)答途徑可以分為兩大類依賴于ABA的ABA-dependent途徑和不依賴于ABA的ABA-independent途徑。許多ABA-indueible基因在它們的啟動子中都含有一個十分保守的ABA應(yīng)答的順式作用元件，稱為ABRE(PyACGTGGC)(Chandler PM，Robertson M 1994.Gene expressionregulated by abscisic acid and its relation to stress tolerance.Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 45，113-141.)。但是，有些基因的誘導(dǎo)并不完全依賴于ABA，即它本身既受ABA，也受其它條件的誘導(dǎo)，例如rd29A，KIN1和KIN2(ShinozakiK，Yamaguchi-Shinozaki K(2000).Molecular responses to dehydration and lowtemperatureDifferenees and cross-talk between two stress signal ing pathways.Curr Opin Plant Biol 3，217-223.)。1994年，研究人員在對擬南芥rd29A啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)了一類新的順式元件CRT/DRE(CCGAC)(Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K(1994).A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene isinvolved in responsiveness to drought，low-temperature or high-salt stress.Plant Cell 6，251-264.)。與CRT/DRE元件結(jié)合的蛋白稱為CBF/DREBs。這一類蛋白參與低溫和/或干旱的誘導(dǎo)表達(dá)，但不依賴于ABA，屬于ABA-independent途徑。CBF/DREB類蛋白都含有一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子。
AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在高等植物中廣泛存在。近年來，在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報道(Elliott，R.C.，Betzner，A.S.，Huttner，E.，Oakes，M.P.，Tucker，W.Q.，Gerentes，D.，Perez，P.，andSmyth，D.R.(1996).AINTEGUMENTA，an APETALA2-like gene of Arabidopsis withpleiotropic roles in ovule development and floral organ growth.Plant Cell8，155-168；Kevin，M.K.，Leonore Reiser，and Robert，L.F.(1996).TheAINTEGUMENTA gene of Arabidopsis Required for ovule and female gametophytedevelopment is related to the floral homeotic gene APETALA2.Plant Cell 8，137-153)，這表明AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。
AP2轉(zhuǎn)錄因子家族成員的主要特點是含有一個高度保守的、具有三個β折疊的DNA結(jié)合區(qū)，稱作AP2域(AP2 domain)。在AP2域中，有兩個保守序列，一個是堿性的YRG區(qū)，是由19-22個氨基酸組成的高度保守的一段序列，它含有YRG這幾個保守的氨基酸序列，YRG元件已經(jīng)被證明參與與DNA的結(jié)合；第二個保守區(qū)是RAYD區(qū)，RAYD區(qū)是由42-43個氨基酸組成的一段氨基酸序列，它的核心結(jié)構(gòu)是一個由18個氨基酸組成的雙親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，這個核心結(jié)構(gòu)的氨基酸序列高度保守(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA bindingproteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)，RAYD元件可能參與蛋白與蛋白的相互作用。同時，經(jīng)研究還發(fā)現(xiàn)，在YRG和RAYD保守區(qū)中，有幾個氨基酸殘基是極度保守的，比如RAYD保守區(qū)中第40個氨基酸-甘氨酸，在所有的AP2蛋白中都是不改變的，它對于AP2蛋白發(fā)揮其生理功能很重要(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control ofArabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2.PlantCell 6，1211-1225)。
根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，可以把AP2轉(zhuǎn)錄因子家族分為兩個亞家族AP2-like家族和EREBP-like家族。AP2-like家族成員最主要的特征是在其蛋白結(jié)構(gòu)中含有兩個AP2結(jié)構(gòu)域，這兩個AP2結(jié)構(gòu)域被一個由25-26個氨基酸組成的鉸鏈區(qū)連接，鉸鏈區(qū)的氨基酸序列也是高度保守的，AP2-like家族的另一個特征是，在其YRG序列中均含有WEAR/WESH這樣一段高度保守的氨基酸序列。AP2-like家族主要在植物發(fā)育中起作用，比如擬南芥基因AP2(homeotic gene APETALA2)是這個家族中的成員之一，它不僅參與調(diào)控花分生組織的建立、花器官的分化，同時還能夠調(diào)控其它與花發(fā)育有關(guān)的同源異型基因的表達(dá)，在擬南芥花發(fā)育過程中起重要作用，而且，它還參與擬南芥子房發(fā)育和種子發(fā)育過程的調(diào)節(jié)(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seed developmentby the homeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)，該家族的另一成員ANT，在擬南芥的子房發(fā)育和雌配子體的發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。
EREBP-like家族的成員的特征是僅含有一個AP2結(jié)構(gòu)域，而且在YRG保守區(qū)中沒有WEAR/WESH，由7個氨基酸—WAAEIRD組成的一個高度保守的結(jié)構(gòu)(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteinsin Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)。據(jù)估計，在擬南芥中，EREBP-like家族有124個成員之多(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsis transcriptionfactorsgenome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，家族如此龐大，也許與EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子在植物體中所參與的廣泛的生物學(xué)作用有關(guān)。EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子參與植物對低溫、干旱、病原侵害、機(jī)械傷害等脅迫應(yīng)答反應(yīng)，并受乙烯、水楊酸和茉莉酮酸的調(diào)節(jié)(Singh，K.，F(xiàn)oley，R.C.，andOnate-Sanchez，L.(2002).Transcription factors in plant defense and stressresponses.Curr.Opin.Plant Biol 5，430-436)。
EREBP-like轉(zhuǎn)錄因子能夠與GCC盒(GCC box)和DRE/CRT(dehydrationresponsive element/C-repeat)兩種順式作用元件結(jié)合。GCC盒的序列是AGCCGCC，它存在于植物與抗性有關(guān)的基因的啟動子中，它對于乙烯誘導(dǎo)的PR基因(pathogenesis related genes)的表達(dá)是必須和足夠的(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsisethylene-responsive element binding factors act as transcriptional activatorsor repressors of GCC box-mediated gene expression.Plant Cell 12，393-404)；而DRE/CRT序列存在于植物對干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的抗性有關(guān)的基因的啟動子中，它們的過量表達(dá)能使植物抵抗干旱、高鹽和冷害的襲擊，所以，EREBP-like家族成員在植物的生物脅迫和非生物脅迫中都起重要的調(diào)節(jié)作用。
CBF/DREB(CRT-binding factor/DRE-binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2家族中EREBP-like亞家族中的一個成員。根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的同源性，擬南芥中的CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子可以將其分為DREB1和DREB2兩大類。DREB1包括CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A、CBF4/DREB1D、DREB1E和DREB1F六個成員，其中CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C和CBF3/DREB1A位于擬南芥的第四染色體上，目前研究得比較透徹(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperature regulation of the ArabidopsisCBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-inducedCOR gene expression.Plant J.16，433-442；Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10，1391-1406)，CBF4/DREB1D位于第五條染色體上(Nakamura，Y.，Sato，S.，Asamizu，E.，Kaneko，T.，Kotani，H.，Miyajima，N.，and Tabata，S.(1998).Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5VII.Sequencefeatures of the regions of 1,013,767bp covered by sixteen physically assignedP1 and TAC clones.DNA Res.5，297-308；Thomashow，M.F.，Gilmour，S.J.，Stockinger，E.J.，Jaglo-Ottosen，K.R.，and Zarka，D.G.(2001).Role ofArabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation.Plant Physiol112，171-175)，DREB1E和DREB1F位于第一條染色體上(Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)。
DREB2類轉(zhuǎn)錄因子包括DREB2A和DREB2B兩個成員(Nakashima，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000).Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encodingDRE-binding proteins involved in dehydration-and high-salinity-responsivegene expression.Plant Mol Biol.42，657-665)。DREB2A位于擬南芥的第五條染色體上，DREB2B位于第三條染色體上。
DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠與DRE/CRT順式作用元件結(jié)合，誘導(dǎo)啟動子中含有DRE/CRT順式作用元件(TACCGACAT)的基因的表達(dá)，這些基因都是與植物對干旱、高鹽或低溫等環(huán)境脅迫的抗性有關(guān)的基因。DRE/CRT的核心序列是ACCGAC，普遍存在于干旱、高鹽或低溫脅迫應(yīng)答基因的啟動子中，比如rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17和erd10等，對這些脅迫條件下的基因誘導(dǎo)表達(dá)起調(diào)控作用。所以，在植物對干旱、高鹽或低溫脅迫的分子應(yīng)答中，一個DREB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控一群啟動子中含有DRE/CRT元件的與脅迫耐性相關(guān)的基因的表達(dá)。
在植物中過量表達(dá)DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著增強(qiáng)植物對干旱、高鹽或低溫等脅迫環(huán)境的抗性。在擬南芥中過量表達(dá)CBF1，轉(zhuǎn)基因植物比沒有轉(zhuǎn)基因的植物對低溫具有更強(qiáng)的耐受性(Jaglo-Ottosen，K.R.，Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Schabenberger，O.，and Thomashow，M.F.(1998).Arabidopsis CBF1overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science 280，104-106)；過量表達(dá)CBF3，轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了對干旱、高鹽和低溫脅迫的較高的抵抗能力(Gilmour，S.J.，Sebolt，A.M.，Salazar，M.P.，Everard，J.D.，andThomashow，M.F.(2003).Overexpression of the Arabidopsis CBF3transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated withcold acclimation.Plant Physiol.124，1854-1865)，但同時也引起轉(zhuǎn)基因植物的高度矮化，而用誘導(dǎo)型啟動子比如rd29A的啟動子代替組成型啟動子就可以克服這個負(fù)面效應(yīng)，在提高植物耐旱性能的同時不會造成植物其它性狀的改變(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of asingle stress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)。
水稻中也存在能夠識別DRE/CTR順式作用元件或其核心序列并與之結(jié)合的DREB類轉(zhuǎn)錄因子。2003年，Dubouzet等從水稻中分離得到了與五個擬南芥DREB類轉(zhuǎn)錄因子同源的序列的cDNA，并命名為OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A，其中，OsDREB1A、OsDREB1B被低溫、高鹽和機(jī)械損傷誘導(dǎo)，OsDREB2A受干旱、高鹽和低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而且，在擬南芥中過量表達(dá)OsDREB1A和OsDREB2A的轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)了較高的耐干旱、高鹽和低溫的性能(Joseph G.Dubouzet，Yoh Sakuma2003.OsDREB genes in rice，Oryza sativa L.，encode transcription activatorsthat function in drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression.The plant journal 33，751-763.)。近年來已經(jīng)從大麥、黑麥、番茄和油菜里得到了與擬南芥中的DREB轉(zhuǎn)錄因子序列上同源、功能上相同或相似的基因，這些研究結(jié)果表明，DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物界是廣泛存在的，并且在不同的植物體中，它們執(zhí)行著相似或相同的功能。
大量對轉(zhuǎn)錄因子研究的結(jié)果表明，一個轉(zhuǎn)錄因子可能對一類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié)控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性，同時很多研究結(jié)果也表明，在植物體內(nèi)，包括擬南芥、煙草、大麥和玉米等，過量表達(dá)DREB類轉(zhuǎn)錄因子的植株都表現(xiàn)了較高抵抗干旱、高鹽或低溫脅迫的性能(Pradeep K.Agarwal，et al 2006.Role ofDREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants.Plant Cell Reports.25(12)1263-74.)。所以，通過轉(zhuǎn)基因的方法改善作物的抗逆性，是一條行之有效的途徑。
水稻是世界上最重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物，它為全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫，每年都會在全世界范圍內(nèi)造成水稻大面積的減產(chǎn)，全球約有40％的水稻種植區(qū)受到不同程度的環(huán)境脅迫。隨著全球人口的不斷增加和可耕種面積的逐年減少，提高水稻產(chǎn)量成為全球所共同面臨的一個緊迫的挑戰(zhàn)，而減少逆境脅迫所造成的產(chǎn)量損失，就能夠在很大程度上緩解糧食危機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供屬于AP2/EREBP家族的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子，來源于稻屬水稻(Oryzasativa L.)，是下述氨基酸殘基序列之一
1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)將序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由224個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第54-73位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第54-111位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB1G；序列表中的SEQ ID NO3由217個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第46-65位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第46-103位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB1I；序列表中的SEQ ID NO5由289個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第95-114位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第95-152位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB1H；序列表中的SEQ ID NO7由251個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第54-74位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第54-114位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB1F；序列表中的SEQ ID NO9由373個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第88-107位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第88-145位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB2B；序列表中的SEQ ID NO11由318個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第27-46位氨基酸殘基為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自氨基端第27-84位氨基酸殘基為AP2保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsDREB2C。
所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
編碼本發(fā)明來源于水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；6)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；7)編碼序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的DNA序列；
8)與序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物耐逆性功能的核苷酸序列；9)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由675個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-675位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第160-217位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第160-331位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB1G；序列表中的SEQ ID NO4由654個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-654位堿基，編碼具有序列表中SEQ IDNO3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第136-193位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第136-307位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB1I；序列表中的SEQ ID NO6由870個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-870位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第283-340位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第283-454位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB1H；序列表中的SEQ ID NO8由756個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-756位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第160-220位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第160-340位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB1F；序列表中的SEQ ID NO10由1122個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-1122位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第262-319位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第262-433位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB2B；序列表中的SEQ ID NO12由957個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-957位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO11的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第79-136位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第79-250位堿基編碼AP2保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為OsDREB2C。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼所述水稻與耐逆性功能相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，使植物耐逆性獲得提高。
在上述提高植物耐逆性的方法中，編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用。基因序列變化或縮短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如GatewayTW系列載體(如pH2GW7等)、pBin系列載體(如pBin 19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pENTER-TOPO、PUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動子；所述組成型表達(dá)啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actin1啟動子等；所述組織特異性表達(dá)啟動子可為根特異性表達(dá)啟動子(如擬南芥Pyk10啟動子(Nitz I.et al.，Pyk10，a seedling and root specific gene and promoter from Arabidopsis thaliana.Plant Sci，2001，161337))、葉特異性表達(dá)啟動子(如Rubisco小亞基RBCS1啟動子(Marraccini P.et al.，Rubisco small subunit of Coffea ArabicacDNAsequence，gene cloning and promoter analysis in transgenic tobacco plants.Plant Physiol.Biochem.2003，4117))、莖特異性表達(dá)啟動子(如馬鈴薯TDF511啟動子(Trindade LM.et al.，Isolation and functional characterization of a stolonspecific paromoter from potato(Solanumtuberosum L.)，Gene，2003，30377))、種子特異性表達(dá)啟動子(如2S1啟動子(GenBank號NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank號M64633.1，GI349405)啟動子等)、花特異性表達(dá)啟動子或花粉特異性表達(dá)啟動子(如煙草TA29啟動子(Koltanow AN.et al.，Different temporaland spatal gene expression patterns occur during anther development.PlantCell，1990，21201))；所述誘導(dǎo)型啟動子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動子；上述啟動子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點雜交等分子檢測手段對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以pH2GW7(購自inVitrogen公司)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因的植物表達(dá)載體為pH2GW7Vector-OsDREB1G、pH2GW7 Vector-OsDREB1I、pH2GW7 Vector-OsDREB1H、pH2GW7Vector-OsDREB1F、pH2GW7 Vector-OsDREB2B或pH2GW7 Vector-OsDREB2C。
攜帶有編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
此外，通過將轉(zhuǎn)化有編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B或OsDREB2C)或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無性繁殖和/或種子繁殖。
本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一組來源于水稻AP2/EREBP家族的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。實驗證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對逆境脅迫的耐受性，且對水稻的正常生長和經(jīng)濟(jì)性狀沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬婢衬褪苄詸C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的抗逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為來自水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域的同源性比對結(jié)果圖1A為來自水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子與已知的擬南芥的CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹圖2為OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因T1代植株的mRNA過表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果圖3A-圖3F為OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐旱苗比例的柱形4為經(jīng)干旱脅迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因T1代耐旱植株與野生型植株圖5A-圖5F為OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐鹽苗比例的柱形6為經(jīng)鹽脅迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因T1代耐鹽植株與野生型植株圖7A-圖7F為OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐低溫苗比例的柱形8為經(jīng)低溫脅迫的OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C轉(zhuǎn)基因T1代耐低溫植株與野生型植株圖9A-圖9C為OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H轉(zhuǎn)基因T2代水稻經(jīng)濟(jì)性狀檢測結(jié)果的柱形圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
實施例1、水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的獲得1、水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因序列的獲得以擬南芥CBF1的核苷酸序列(GenBank號NP 567721.1)在GENBANK中進(jìn)行同源基因檢索，獲得同源序列；其中的六個同源序列的核苷酸序列為序列表中的SEQ IDNO2、4、6、8、10和12，在水稻基因組中為單拷貝，沒有內(nèi)含子，分別命名為OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C。
2、OsDREB1G/OsDREB1I/OsDREB1H/OsDREB1F/OsDREB2B/OsDREB2C的PCR擴(kuò)增及序列分析以水稻(Oryza sativa L.)品種中花11的基因組DNA為模板，采用巢式PCR方法擴(kuò)增OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C，引物序列如下1)根據(jù)OsDREB1G ORF(開放閱讀框)設(shè)計的正向引物OsDREB1G-ORF-forwardprimer為5’-ATGGACGTTTCTGCTGCGCTCAG-3’，反向引物OsDREB1G-ORF-reverseprimer為5’-GTAGCTCCATAGCTGGACCTCG-3’；根據(jù)OsDREB1G 5’UTR設(shè)計的正向引物OsDREB1G-UTR-forward primer為5’-ATCAACCTCGCTCGCTTACTCGTGT-3’；根據(jù)OsDREB1G 3’UTR設(shè)計的反向引物OsDREB1G-UTR-reverse primer為5’-AGCCTTCACCGTCTTCAGAACCCAT-3’。
2)根據(jù)OsDREB1I ORF設(shè)計的正向引物OsDREB1I-ORF-forward primer為5’-ATCGACGGCCCACGACGCC-3’，反向引物OsDREB1I-ORF-reverse primer為5’-GTAATCCCACAGCATGGGCTCCTC-3’；根據(jù)OsDREB1I 5’UTR設(shè)計的正向引物OsDREB1I-UTR-forward primer為5’-AAGCCTCCAACTACTCCAGTCCACAC-3’；根據(jù)OsDREB1I 3’UTR設(shè)計的反向引物OsDREB1I-UTR-reverse primer為5’-AGAAAGAGAACAGAGCAGAAGCAGAGT-3’。
3)根據(jù)OsDREB1H ORF設(shè)計的正向引物OsDREB1H-ORF-forward primer為5’-ATGGCCATGGCGAAGGAGCTCC-3’，反向引物OsDREB1H-ORF-reverse primer為5’-AGCATCTGTTACTCCCAAGTCCC-3’；根據(jù)OsDREB1H 5’UTR設(shè)計的正向引物OsDREB1H-UTR-forward pr imer為5’-TAAAAACCCCCCTCTCTCCTCACTAC-3’；根據(jù)OsDREB1H 3’UTR設(shè)計的反向引物OsDREB1H-UTR-reverse primer為5’-CTGCTTTTCCAAAGGTAATAAACTACAG-3’。
4)根據(jù)OsDREB1F ORF設(shè)計的正向引物OsDREB1F-ORF-forward primer為5’-ATGTGTACGAGCAAACTAGAGGAGAT-3’，反向引物OsDREB1F-ORF-reverse primer為5’-GTAGCTCCACAGAGACACGTCAG-3’；根據(jù)OsDREB1F 5’UTR設(shè)計的正向引物OsDREB1F-UTR-forward primer為5’-CAACCATAACATTTTACATCCACTTTC-3’；根據(jù)OsDREB1F 3’UTR設(shè)計的反向引物OsDREB1F-UTR-reverse primer為5’-CGAAATGAGGAAACCGTACATAGGAAT-3’。
5)根據(jù)OsDREB2B ORF設(shè)計的正向引物OsDREB2B-ORF-forward primer為5’-ATGACGGTGGATCAGAGGACGACG-3’，反向引物OsDREB2B-ORF-reverse primer為5’-CAAGCCCTCAAAGAACTGAGAGTC-3’。
6)根據(jù)OsDREB2C ORF設(shè)計的正向引物OsDREB2C-ORF-forward primer為5’-ATGGAGAGCTACGGGAGGAAGC-3’，反向引物OsDREB2C-ORF-reverse primer為5’-AATGTCCCAAATAGGGATGGGCATG-3’；根據(jù)OsDREB2C 5’UTR設(shè)計的正向引物OsDREB2C-UTR-forward primer為5’-CTCCTACTCAGTCACACTCCCCTCAC-3’；根據(jù)OsDREB2C 3’UTR設(shè)計的反向引物OsDREB2C-UTR-reverse primer為5’-AACAAGCTCTGATCTCCCCTACTTCT-3’。
50μl PCR反應(yīng)體系為上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，Taq酶0.5μl，10×dNTPs 5μl，10×PCR緩沖液(Mg2+)5μl，H2O 36.5μl。PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)熱5min；然后94℃變性1min，58℃退火2min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴(kuò)增獲得了大小分別為675bp、654bp、870bp、756bp、1122bp和957bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化上述片段，將其分別連接入載體pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，再將連接產(chǎn)物分別用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，挑選陽性單菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12-16小時，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，分別命名為pENTER-TOPOVector-OsDREB1G、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1I、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1H、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1F、pENTER-TOPO Vector-OsDREB2B和pENTER-TOPOVector-OsDREB2C。
對上述質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C，其中，OsDREB1G具有序列表中SEQ IDNO2的核苷酸序列，由675個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-675位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第160-217位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第160-331位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第2條染色體上，與AtCBF1/DREB1B(GenBank號NP 567721.1)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有65％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有45.2％的一致性；OsDREB1I具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由654個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-654位堿基，編碼具有序列表中SEQ IDNO3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第136-193位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第136-307位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第4條染色體上，與AtCBF1/DREB1B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有75％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有37％的一致性；OsDREB1H具有序列表中SEQ ID NO6的核苷酸序列，由870個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-870位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第283-340位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第283-454位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第10條染色體上，與AtCBF1/DREB1B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有75％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有28.7％的一致性；OsDREB1F具有序列表中SEQ ID NO8的核苷酸序列，由756個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-756位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第160-220位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第160-340位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第8條染色體上，與AtCBF1/DREB1B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有57.2％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有36％的一致性；OsDREB2B具有序列表中SEQ ID NO10的核苷酸序列，由1122個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-1122位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第262-319位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第262-433位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第5條染色體上，與AtCBF1/DREB1B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有73.7％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有17.2％的一致性；OsDREB2C具有序列表中SEQ ID NO12的核苷酸序列，由957個堿基組成，其開放閱讀框架為自5’端第1-957位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO11的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5’端第79-136位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，自5’端第79-250位堿基編碼AP2保守區(qū)，該基因位于水稻基因組的第5條染色體上，與AtCBF1/DREB1B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有79％的一致性，與AtCBF1/DREB1B的氨基酸序列具有20.2％的一致性。
進(jìn)一步，將本發(fā)明的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C編碼蛋白(統(tǒng)稱為OsCBF/DREBs)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與已知的擬南芥和水稻的CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子(GenBank號分別為NP_176491.1、NP_172721.1、NP_001031837.1、NP_567721.1、AAC99371.1、NP_567720.1、NP_187713.1、NP_200012.1、NP_001063712.1、NP_001042107.1、NP_001047629.1、NP_001053608.1)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖1A所示(以AP2結(jié)構(gòu)域的保守性為依據(jù))，表明本發(fā)明來源于水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子與已知的擬南芥和水稻CBF/DREB類轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有較高的同源性，均歸為同一家族的轉(zhuǎn)錄因子。同時，對本發(fā)明的OsCBF/DREBs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果如圖1所示，表明上述各基因編碼蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有74.6％的一致性，歸為同一類DREB基因。
實施例2、與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因轉(zhuǎn)基因水稻的獲得用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將實施例1獲得的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C分別轉(zhuǎn)化水稻，
具體方法如下1)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌通過LR反應(yīng)將實施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pENTER-TOPO Vector-OsDREB1G、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1I、pENTER-TOPO Vector-OsDREB1H、pENTER-TOPOVector-OsDREB1F、pENTER-TOPO Vector-OsDREB2B和pENTER-TOPO Vector-OsDREB2C分別導(dǎo)入植物表達(dá)載體pH2GW7(Invitrogen公司的GatewayTWvector載體)中，LR反應(yīng)體系為0.5μl LR酶，1μl 5×緩沖液，2μl TOPO-OsDREBs，1.5μl pH2GW7，補(bǔ)水5μl，LR反應(yīng)條件為25℃水浴1-3個小時。然后，通過熱激法將上述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，挑選陽性單菌落加入到5mL含50mg/L的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm下培養(yǎng)12-16小時，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了大小分別為875bp、854bp、1070bp、956bp、1322bp和1157bp的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符，再在實施例1中引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明獲得了分別含有OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的重組植物表達(dá)載體，分別命名為pH2GW7-OsDREB1G、pH2gW7-OsDREB1I、pH2GW7-OsDREB1H、pH2GW7-OsDREB1F、pH2GW7-OsDREB2B和pH2GW7-OsDREB2C，隨后將上述重組載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0菌株。
2)侵染水稻愈傷組織挑取步驟1)獲得的陽性重組農(nóng)桿菌的單菌落接種于含壯觀霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液體培養(yǎng)基中，在28℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天，再于4℃、5000rpm離心3分鐘，去上清，將菌體沉淀重懸于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培養(yǎng)基(Co(NO3)2·6H2O0.15mg/L，CaCl2110mg/L，MgSO4122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH2PO4·H2O 150mg/L，Na2-EDTA 0.01mM，F(xiàn)eSO4·7H2O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO4·4H2O84.5mg/L，ZnSO4·7H2O 6.25mg/L，H3BO35mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO40.005mg/L，Na2MoO4·2H2O 1.25mg/L，鹽酸硫胺素VB15mg/L，煙酸5mg/L，鹽酸吡哆醇VB65mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln87.6mg/L，L-Asp26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振蕩培養(yǎng)1-2小時至OD600＝0.6-0.9。挑選按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的水稻中花11的生長狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入上述分別轉(zhuǎn)化有OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的重組農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中搖動20分鐘后，靜置30分鐘，取出，用無菌濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織接種于N6共培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2，4-D 2mg/L)上培養(yǎng)，其中N6基本培養(yǎng)基的配方為(NH4)2SO40.46g/L，KNO32.83g/L，CaCl20.2g/L，MgSO40.092g/L，KH2PO40.4g/L，Na2-EDTA 0.15g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.11g/L，MnSO4·4H2O 0.44g/L，ZnSO4·7H2O 0.17g/L，H3BO30.14g/L，CoCl2·6H2O 0.0005g/L，CuSO4·5H2O 0.0005g/L，Na2MoO4·2H2O 0.005g/L，鹽酸硫胺素VB10.01g/L，煙酸0.001g/L，鹽酸吡哆醇VB60.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，瓊脂10g/L，pH5.8。2-3天后，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，然后在含500mg/L頭孢霉素的無菌水中浸泡30-60分鐘，再用無菌水沖洗1遍，置于無菌濾紙上晾干，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+頭孢霉素250mg/L)篩選。
3)陽性轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將侵染后的水稻愈傷組織于N6共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3-5天后，轉(zhuǎn)至含30mg/L潮霉素和400mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基(N6大量元素+B5微量元素+B5有機(jī)成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH 5.8)上篩選3周，再轉(zhuǎn)入含50mg/L潮霉素和200mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基上篩選4周，隨后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-芐基氨基嘌呤+5mg/L脫落酸)，光照培養(yǎng)3周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-芐基氨基嘌呤)上進(jìn)行分化，將生長出的再生植株在壯苗培養(yǎng)基(1/2MS無機(jī)鹽+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上進(jìn)行生根培養(yǎng)后移至溫室中，在28℃、15小時/天的光照下培養(yǎng)1個月后取植株葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，在正向引物5’-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3’和反向引物5’-ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG-3’的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴(kuò)增獲得1kb DNA片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，檢測結(jié)果表明用上述方法獲得了分別轉(zhuǎn)化有OsDREE1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的轉(zhuǎn)基因水稻。
實施例3、轉(zhuǎn)基因T1代水稻植株的遺傳分析和分子鑒定取實施例2收獲的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的T1代轉(zhuǎn)基因水稻的種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用25mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對照，篩選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3∶1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因株系。
選取生長期為15天的單位點插入的轉(zhuǎn)基因株系的植株，用Trizol試劑提取各植株總RNA，使用申能博彩公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照試劑盒說明以總RNA(1μg)為模板反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，再以合成的cDNA為模板，以水稻actin基因(GenBank號P13362)為內(nèi)源參照，利用相應(yīng)的基因特異性引物，對轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源表達(dá)的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C的表達(dá)水平進(jìn)行半定量RT-PCR分析，檢測目標(biāo)基因是否過表達(dá)，以野生型水稻為對照(CK)，引物序列如下OsDREB1F-RT-F5’-TGTGTACGAGCAAACTAGAGGAGATC-3’OsDREB1F-RT-R5’-AACGTGCCGAGCCAGAGC-3’；
OsDREB1G-RT-F5’-CGCAAGCCACGACGACATAC-3’OsDREB1G-RT-R5’-CGCTACCTACGGCAGGATCAC-3’；OsDREB1H-RT-F5’-GCCGCTGCCGCCAAGAAC-3’OsDREB1H-RT-R5’-TCCCAAAGCAATGGCTCCTCAAG-3’；OsDREB1I-RT-F5’-TGCCAAGAGCCCCGACACCT-3’OsDREB1I-RT-R5’-TCCCACAGCATGGGCTCCTC-3’；OsDREB2B-RT-F5’-AATGTATGGTCCAATGGCTCG-3’OsDREB2B-RT-R5’-CGATTCAGCCTTGTCTTCATTAG-3’；OsDREB2C-RT-F5’-CTCCACCGTCACCAACAGCGT-3’OsDREB2C-RT-R5’-TCCTGCGATGTCGCTCATGTC-3’；檢測水稻actin基因的引物ACTIN180-F5’-TCCGTGACATCAAGGAAAAGC-3’；ACTIN180-R5’-CCGATGAGAGAAGGCTGGAA-3’。
25μl RT-PCR反應(yīng)體系為上、下游引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶0.3μl，dNTPs0.5μl，10×PCR緩沖液2.5μl，H2O 19.7μl。RT-PCR反應(yīng)條件為先95℃預(yù)熱5min，然后94℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 1min，共30個循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分檢測結(jié)果如圖2所示(L1、L2、L3、L4、L5為同一基因的不同轉(zhuǎn)基因植株)，表明OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C在各自的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)均獲得高水平表達(dá)。
實施例4、轉(zhuǎn)基因T1代植株耐旱性鑒定收獲OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子。用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用25mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對照，篩選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3∶1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因株系，將培養(yǎng)10天的苗進(jìn)行干旱處理，同時設(shè)未轉(zhuǎn)基因的水稻中花11植株作對照(WT)。將水稻幼苗種入裝箱的土壤中，采用蛭石∶營養(yǎng)土混合比例為3∶1的混合土，土壤的含水量限定為55-65％之間(采用烘干法測量土壤含水量，根據(jù)土壤烘干前后土壤重量的差值計算土壤的含水量)。從處理即日起不再澆水，采用反復(fù)干旱法，即當(dāng)同一培養(yǎng)箱中50％的幼苗表現(xiàn)出萎蔫時復(fù)水，使苗恢復(fù)，再干旱處理使之萎蔫，重復(fù)2-3次。此過程大約需要20-30天，直至絕大多數(shù)的未轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉片干枯、莖桿脫水彎曲、死亡，而各轉(zhuǎn)基因株系的生長狀態(tài)良好，葉片稍下垂，莖桿直立，停止篩選，復(fù)水培養(yǎng)。去除干旱協(xié)迫條件，在正常的復(fù)水培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長15天后統(tǒng)計各轉(zhuǎn)基因株系的成活苗數(shù)，計算耐旱苗比例，結(jié)果如圖3A-圖3F所示(橫坐標(biāo)為不同的轉(zhuǎn)基因株系編號，縱坐標(biāo)為耐旱苗百分比)，與野生型對照植株相比，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻T1代植株對干旱脅迫的耐受性均明顯提高，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻T1代經(jīng)耐旱處理后的植株與經(jīng)耐旱處理后的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆鐖D4所示，篩選出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田中繼續(xù)生長獲得T2代種子。
實施例5、轉(zhuǎn)基因T1代植株耐鹽性鑒定收獲OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用25mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對照，篩選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3∶1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因株系。繼續(xù)培養(yǎng)10天后，將苗轉(zhuǎn)移到大試管中，加入含有150mmol/L NaCl、pH值8.5～9.0的鹽溶液，進(jìn)行鹽脅迫處理7天(28℃，2500lux，15h光照/9h)，期間每天更換鹽溶液，以保持鹽濃度和pH值的穩(wěn)定，篩選7天后除去鹽溶液，統(tǒng)計成活苗數(shù)，計算耐鹽苗比例，結(jié)果如圖5A-圖5F所示(橫坐標(biāo)為不同的轉(zhuǎn)基因株系編號，縱坐標(biāo)為耐鹽苗百分比)，同時以未轉(zhuǎn)基因的中花11水稻苗為對照。實驗結(jié)果顯示，T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株對鹽的耐受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)鹽處理后，OsDREB1H、OsDREB1I、OsDREB1F、OsDREB1G、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因水稻T1代陽性株系的植株恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生長，未轉(zhuǎn)基因的中花11對照(WT)植株的葉片發(fā)黃、卷曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù)培養(yǎng)后很快死亡(見圖6)。
實施例6、轉(zhuǎn)基因T1代植株耐低溫性鑒定收獲OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C T1代轉(zhuǎn)基因水稻種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用25mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對照，篩選5天后，對照植株全部死亡，統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3∶1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點插入的OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H、OsDREB1F、OsDREB2B和OsDREB2C轉(zhuǎn)基因株系。繼續(xù)培養(yǎng)10天后，將培養(yǎng)苗放入在4℃、2500lux，15h光照/9h條件下進(jìn)行低溫處理7天，然后恢復(fù)室溫繼續(xù)培養(yǎng)，同時以未轉(zhuǎn)基因的中花11為對照，分別統(tǒng)計成活苗數(shù)，計算耐低溫苗比例，結(jié)果如圖7A-圖7F所示。耐低溫處理后的轉(zhuǎn)基因T1代植株和對照植株如圖8所示，4℃處理第7天后，陽性轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株僅葉尖部分稍有卷曲，室溫培養(yǎng)后能夠繼續(xù)恢復(fù)生長，而未轉(zhuǎn)基因的中花11對照(WT)植株的葉片發(fā)黃、卷曲、干枯，莖桿不能直立，室溫培養(yǎng)后不能恢復(fù)生長，并很快死亡，表明轉(zhuǎn)基因植株對低溫的耐受抵抗能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因植株。
實施例7、轉(zhuǎn)基因T1代植株的經(jīng)濟(jì)性狀檢測取實施例4收獲的OsDREB1G、OsDREB1H、OsDREB1I T2代轉(zhuǎn)基因水稻在大田中種植，進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀的檢測，并與野生型水稻進(jìn)行比對，檢測項目包括有效分蘗數(shù)、穗長、穗重、結(jié)實率、千粒重和產(chǎn)量，并通過方差分析評定轉(zhuǎn)基因水稻與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?WT)之間的差別，方法為對于轉(zhuǎn)化有同一個基因的株系，取3個不同轉(zhuǎn)基因株系的檢測值，計算平均值，將其作為該基因轉(zhuǎn)化植株的檢測值；對于同一個轉(zhuǎn)基因株系，取3個不同T2代轉(zhuǎn)基因植株的檢測值，計算平均值，將其作為該株系的檢測值。具體測量方法如下(1)有效分蘗結(jié)實大于5粒的穗的總和；(2)穗長穗節(jié)至穗頂(不連芒)的長度；(3)穗重單穗的重量；(4)結(jié)實率每穗飽滿粒數(shù)/每穗總粒數(shù)×100％；(5)千粒重1000粒飽滿種子的質(zhì)量；(6)產(chǎn)量單株收獲的種子，曬干揚(yáng)凈后稱重。
其中，OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H的轉(zhuǎn)基因株系的檢測結(jié)果如圖9A-圖9C所示(WT為野生型對照)，表1-表6的方差分析結(jié)果表明OsDREB1I轉(zhuǎn)基因水稻的穗長、穗重和結(jié)實率與同試驗區(qū)的WT的穗長、穗重和結(jié)實率差異顯著，有效分蘗、千粒重和產(chǎn)量差異不顯著；OsDREB1G轉(zhuǎn)基因水稻與同試驗區(qū)的WT在各項檢測性狀的差異均為不顯著；OsDREB1H的穗長與同試驗區(qū)的WT的穗長差異顯著，其它性狀差異不顯著。上述檢測結(jié)果表明，與野生型水稻相比，OsDREB1G、OsDREB1I和OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的經(jīng)濟(jì)性狀，尤其是產(chǎn)量，沒有明顯變化。
表1 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的有效分蘗數(shù)的方差分析結(jié)果

表2 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的穗長的方差分析結(jié)果

表3 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的穗重的方差分析結(jié)果

表4 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的結(jié)實率的方差分析結(jié)果

表5 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的結(jié)實率的方差分析結(jié)果

表6 OsDREB1G、OsDREB1I、OsDREB1H轉(zhuǎn)基因的水稻的產(chǎn)量的方差分析結(jié)果

序列表<160>12<210>1<211>224<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>1Met Asp Val Ser Ala Ala Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Ser Gly Thr Pro1 5 10 15Ser Pro Val Ala Ala Asp Ala Asp Asp Gly Ser Ser Ala Tyr Met Thr20 25 30Val Ser Ser Ala Pro Pro Lys Arg Arg Ala Gly Arg Thr Lys Phe Lys35 40 45Glu Thr Arg His Pro Val Phe Lys Gly Val Arg Arg Arg Asn Pro Gly50 55 60Arg Trp Val Cys Glu Val Arg Glu Pro His Gly Lys Gln Arg Ile Trp65 70 75 80Leu Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val85 90 95Ala Ala Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp100 105 110Ser Pro Arg Arg Leu Arg Val Pro Pro Ile Gly Ala Ser His Asp Asp115 120 125Ile Arg Arg Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe Arg Pro Pro Pro130 135 140Asp Glu Ser Asn Ala Ala Thr Glu Val Ala Ala Ala Ala Ser Gly Ala145 150 155 160Thr Asn Ser Asn Ala Glu Gln Phe Ala Ser His Pro Tyr Tyr Glu Val165 170 175Met Asp Asp Gly Leu Asp Leu Gly Met Gln Gly Tyr Leu Asp Met Ala180 185 190Gln Gly Met Leu Ile Asp Pro Pro Pro Met Ala Gly Asp Pro Ala Val195 200 205Gly Ser Gly Glu Asp Asp Asn Asp Gly Glu Val Gln Leu Trp Ser Tyr210 215 220<210>2<211>675<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>2atggacgttt ctgctgcgct cagcagcgac tactcgtcgg ggacgccgtc gccggtggcg 60gccgacgccg acgacggctc ctccgcctac atgacggtgt cgtcggcgcc gcccaagcgg120cgagcggggc ggaccaagtt caaggagacg cggcaccccg tgttcaaggg cgtgcgccgg180aggaaccccg ggaggtgggt gtgcgaggtg cgcgagccgc acggcaagca gcggatatgg240ctcgggacgt tcgagacagc agagatggcg gcgcgcgcgc acgacgtcgc cgcgctcgcg300ctccgcggcc gcgccgcctg cctcaacttc gccgactcgc cgaggcgcct ccgcgtcccg360cccatcggcg caagccacga cgacatacgg agggcggcgg ctgaggcggc cgaggcattc420cggccgccac cagatgagag caatgcggcc accgaggtgg cagccgccgc atcgggcgcc480actaattcga acgccgaaca gttcgcctcc cacccgtact acgaggtcat ggacgatggg540ctggacttgg ggatgcaggg ctatctcgac atggcgcaag ggatgctcat tgacccgcct600ccaatggccg gtgatcctgc cgtaggtagc ggcgaagacg acaacgatgg cgaggtccag660
ctatggagct actga 675<210>3<211>217<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>3Met Asp Asp Ser His Asp Leu Ala Ser Pro Thr Ser Pro Asp Thr Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Val20 25 30Ala Pro Lys Lys Arg Pro Arg Asn Asp Gly Arg His Pro Thr Tyr Arg35 40 45Gly Val Arg Met Arg Ser Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu50 55 60Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Ala Thr Ala Glu65 70 75 80Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg85 90 95Thr Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala His Leu Leu Pro Arg Pro100 105 110Ala Thr Ala Ala Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala115 120 125Ala Ala Ala Asp Phe Pro Ser Val Ser Val Asp Ala Asn Ala Lys Ser130 135 140Pro Asp Thr Cys Ser Val Ala Ser Ala Ala Ser Pro Gln Pro Pro Pro145 150 155 160Pro Asp Ala Glu Ala Asp Pro Asp Ser Thr Leu Phe Asp Leu Pro Asp165 170 175Leu Leu Leu Asp Leu Arg Tyr Glu Thr Ser Ser Ser Leu Ser Cys Gly180 185 190Ala Ser Trp Ala Val Asp Asp Asp Val Ala Gly Gly Val Val Phe Arg195 200 205Leu Glu Glu Pro Met Leu Trp Asp Tyr210 215<210>4<211>654<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>4atggacgact cccacgacct ggcctccccg acctcccctg acacggcgtc ctcgtcgtct 60tcgtctacgt cgacatcatc gtcctccgcc accgtcgccc cgaagaagcg gccgcgcaac120gacggccggc acccgacgta ccgcggcgtg cgcatgcgga gctgggggaa gtgggtgtcc180gagatcaggg agccccgcaa gaagtcgcgc atctggctgg gcacgttcgc caccgcggag240atggccgcgc gcgcgcacga cgtggccgcg ctcgccatca agggccgcac cgcgcacctc300aacttcccgg acctcgcgca cctgctcccg cgcccggcca ccgcggcgcc caaggacgtg360caggcggcgg cgctgctcgc cgccgccgca gccgacttcc cctccgtctc cgtcgacgcc420aatgccaaga gccccgacac ctgctccgtc gccagcgccg cctcgccgca gccgccaccg480ccggacgccg aagcggaccc tgacagcacg ctgttcgacc tcccggacct gctcctggac540ctgagatacg agacgtcctc gagcctctcg tgcggggcgt cgtgggccgt cgatgacgac600gtggccggcg gcgtcgtgtt ccgcctcgag gagcccatgc tgtgggatta ctga 654<210>5
<211>289<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>5Met Ala Met Ala Lys Glu Leu Gln Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser1 5 10 15Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ser Cys Ser Ser Ala Val Thr Asp Ala Trp20 25 30Ser Ser Pro Ala Arg Pro Asn Ala Val Ala Gly Gly Lys Arg Lys Lys35 40 45Glu Val Val Gly Glu Ala Asp Glu Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Lys Ser Ser Ala65 70 75 80Ala Thr Lys Lys Arg Lys Arg Ser Ser Asp Gly Lys His Pro Val Tyr85 90 95Arg Gly Val Arg Met Arg Ala Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg100 105 110Glu Pro Arg Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala115 120 125Asp Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly130 135 140Arg Ala Ala His Leu Asn Phe Pro Asp Leu Ala Gly Val Leu Pro Arg145 150 155 160Ala Ala Ser Ala Ser Pro Lys Asp Val Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ala165 170 175Ala Ala Phe Thr Thr Ser Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Leu Ser180 185 190Ala Asp Asp Val Ala Pro Cys Val Val His Ala Asp Ala Asp Glu Gln195 200 205Pro Ala Ala Ala Ala Lys Asn Asp Asp Asp Asp Gly Ser Thr Thr Ala210 215 220Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu Gln Gln Leu225 230 235 240Phe Asp Leu Pro Asp Leu Leu Phe Asp Ile Gln Asp Gly Pro Phe Gly245 250 255Phe Pro Ala Met Trp Ala Pro Leu Ala Asp Val Asp Glu Val Asn Ala260 265 270Glu Leu Arg Leu Glu Glu Pro Leu Leu Trp Asp Leu Gly Val Thr Asp275 280 285Ala<210>6<211>870<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>6atggccatgg cgaaggagct ccaagaaacc tcctcgtctt cgtcctcctc ggctgcctcc 60acgtcctcct gctcctccgc cgtcacggac gcgtggtcgt cgccggccag acccaatgct120gtggccgggg ggaagaggaa gaaggaggtg gtaggagagg ctgatgaggc tgcaggcggc180ggcgcaggag aggaggaaga ggaggaggcg gaggcggcgg cggcggggaa gtcgtcggcg240gcgacgaaga agaggaagcg gagcagcgac gggaagcacc cggtgtaccg cggcgtgcgg300atgcgggcgt gggggaagtg ggtgtcggag atccgcgagc cgcggaagaa gtcgcgcatc360tggctcggca cgttccccac cgccgacatg gccgcgcgcg cccacgacgt cgccgcgctc420
gccatcaagg gccgcgccgc gcacctcaac ttcccggacc tcgccggcgt cctcccgcgc480gccgcctccg cctcgcccaa ggacgtccag gccgccgccg cattggccgc cgcgttcacc540acgtccccgt cctcgtcgcc ctcctcctcc ttgtcggccg acgacgtcgc gccatgcgtc600gtccacgccg acgccgacga gcagcctgcc gctgccgcca agaacgacga cgacgacggc660tcaaccaccg cgccggtggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggatga gcagcagctg720ttcgacctgc cggacttgct gttcgacatc caggacgggc cgttcgggtt cccggcgatg780tgggcgccgc tcgccgacgt cgacgaggtc aatgcggagc tccggcttga ggagccattg840ctttgggact tgggagtaac agatgcttaa 870<210>7<211>251<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>7Met Cys Thr Ser Lys Leu Glu Glu Ile Thr Gly Glu Trp Pro Pro Pro1 5 10 15Ala Leu Gln Ala Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ser Glu Pro Cys Arg Arg20 25 30Leu Ser Pro Pro Ser Ser Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe His35 40 45Glu Thr Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Arg Ala50 55 60Gly Arg Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg65 70 75 80Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg Ala His85 90 95Asp Ala Ala Met Leu Ala Leu Arg Gly Arg Ala Ala Ala Cys Leu Asn100 105 110Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Pro Pro Ala Thr Leu115 120 125Arg Cys Ala Ala Asp Val Gln Arg Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Asp130 135 140Phe Glu Gln Arg Glu Ser Ser Ser Ser Val Phe Pro Leu Ala Ile Asp145 150 155 160Val Val Ala Glu Asp Ala Met Ser Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ala Ala165 170 175Ser Asp Asp Asp Ala Val Thr Ser Ser Ser Ser Thr Thr Asp Ala Asp180 185 190Glu Glu Ala Ser Pro Phe Glu Leu Asp Val Val Ser Asp Met Gly Trp195 200 205Ser Leu Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Glu Gly Leu Leu Met Glu Pro Pro210 215 220Ala Ser Gly Ala Ser Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ala Ile Val Asp Ser225 230 235 240Ser Asp Ile Ala Asp Val Ser Leu Trp Ser Tyr245 250<210>8<211>756<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>8atgtgtacga gcaaactaga ggagatcacc ggcgagtggc cgccgccggc attgcaggcc 60gcctccacga cgtcgtcgtc ggagccgtgc cgccgcctct cgccgcccag cagcaagcgc120
cccgcggggc gcaccaagtt ccacgagacc cgccacccgg tgttccgcgg cgtgcggcgc180cgcggccgcg cggggcggtg ggtgtgcgag gtccgcgtgc cgggccgccg cgggtgcagg240ctctggctcg gcacgttcga cgccgccgac gccgccgcgc gcgcccacga cgccgccatg300ctcgcgctcc gcggccgcgc cgccgcgtgc ctcaacttcg ccgactccgc ctggctgctc360gccgtgccgc ccccggccac cctccgctgc gccgccgacg tccagcgcgc cgtggcgcgg420gcgctggagg acttcgagca gcgggagtca tcatcgtccg tgttcccact cgccatcgac480gtcgtcgccg aggacgccat gtccgccacg tccgagccgt ccgccgcgag cgacgacgac540gccgtcacca gcagcagcag cacgaccgac gccgacgagg aggcatcacc gttcgagctg600gacgtggtga gcgacatggg ctggagcctg tactacgcga gcttagcgga gggcctcctc660atggagccgc cggcttccgg cgcatcgtcc gacgacgacg acgacgccat cgtcgactca720agcgacatcg ctgacgtgtc tctgtggagc tactag 756<210>9<211>373<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>9Met Thr Val Asp Gln Arg Thr Thr Ala Lys Ala Ile Met Pro Pro Val1 5 10 15Glu Met Pro Pro Val Gln Pro Gly Arg Lys Lys Arg Pro Arg Arg Ser20 25 30Arg Asp Gly Pro Thr Ser Val Ala Glu Thr Ile Lys Arg Trp Ala Glu35 40 45Leu Asn Asn Gln Gln Glu Leu Asp Pro Gln Gly Pro Lys Lys Ala Arg50 55 60Lys Ala Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly65 70 75 80Gly Pro Glu Asn Thr Arg Cys Asp Phe Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr85 90 95Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Gln Gln Ser Arg100 105 110Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Ala Ala Ala Cys Ala Tyr115 120 125Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Pro Met Ala Arg Thr Asn Phe130 135 140Gly Gln His His Ala Pro Ala Ala Ser Val Gln Val Ala Leu Ala Ala145 150 155 160Val Lys Cys Ala Leu Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Ser Lys Ser Arg165 170 175Thr Ser Thr Gln Gly Ala Ser Ala Asp Val Gln Asp Val Leu Thr Gly180 185 190Gly Leu Ser Ala Cys Glu Ser Thr Thr Thr Thr Ile Asn Asn Gln Ser195 200 205Asp Val Val Ser Thr Leu His Lys Pro Glu Glu Val Ser Glu Ile Ser210 215 220Ser Pro Leu Arg Ala Pro Pro Ala Val Leu Glu Asp Gly Ser Asn Glu225 230 235 240Asp Lys Ala Glu Ser Val Thr Tyr Asp Glu Asn Ile Val Ser Gln Gln245 250 255Arg Ala Pro Pro Glu Ala Glu Ala Ser Asn Gly Arg Gly Glu Glu Val260 265 270Phe Glu Pro Leu Glu Pro Ile Ala Ser Leu Pro Glu Asp Gln Gly Asp275 280 285Tyr Cys Phe Asp Ile Asp Glu Met Leu Arg Met Met Glu Ala Asp Pro290 295 300
Thr Asn Glu Gly Leu Trp Lys Gly Asp Lys Asp Gly Ser Asp Ala Ile305 310 315 320Leu Glu Leu Gly Gln Asp Glu Pro Phe Tyr Tyr Glu Gly Val Asp Pro325 330 335Gly Met Leu Asp Asn Leu Leu Arg Ser Asp Glu Pro Ala Trp Leu Leu340 345 350Ala Asp Pro Ala Met Phe Ile Ser Gly Gly Phe Glu Asp Asp Ser Gln355 360 365Phe Phe Glu Gly Leu370<210>10<211>1122<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>10atgacggtgg atcagaggac gacggcgaag gcgatcatgc cgccggtgga gatgccgccc 60gtccagcccg gaaggaaaaa gcgaccacgg agatcacgcg atggacctac ttcagttgca120gagaccatca agcggtgggc cgagctcaac aatcagcagg agcttgatcc acagggtcca180aagaaggcaa ggaaggcacc tgcaaagggt tcaaagaagg gctgcatgaa ggggaaagga240ggaccggaga atacacgttg tgacttccgt ggtgtgaggc aacgtacctg gggcaagtgg300gttgctgaaa ttcgggagcc gaatcagcaa agtagactct ggttggggac cttcccaact360gccgaagctg cagcttgtgc ttatgacgag gcagccagag caatgtatgg tccaatggct420cgcactaatt ttggccagca tcatgcccct gctgcttccg ttcaggttgc actagcagct480gtcaaatgtg ctttacctgg tggtggctta acagcaagca agtctagaac atccactcag540ggtgcatcag cagatgttca agatgtttta actggtggct tatcagcatg cgagtccact600acaacaacaa ttaataatca atctgatgtc gtctctacct tacataagcc agaagaggtt660tctgagatct ctagtccact gagagctcca ccagctgtcc tggaagatgg ttctaatgaa720gacaaggctg aatcggttac ctatgatgag aacattgtca gccagcagcg tgcccctcct780gaagccgagg ctagtaatgg aagaggcgag gaggtctttg agcctctgga acctattgcc840agcctaccag aggaccaagg agattattgt tttgatattg atgagatgct gagaatgatg900gaagctgacc ctacgaacga gggtttgtgg aaaggcgaca aagatggatc agacgccatc960ctggagcttg gccaggatga acctttctac tacgaagggg ttgatccagg catgctggac 1020aacttgctca ggtctgatga gccagcatgg ttattggcag atcctgcgat gttcatctcc 1080ggtggcttcg aagatgactc tcagttcttt gagggcttgt ga 1122<210>11<211>318<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>11Met Glu Ser Tyr Gly Arg Lys Arg Ala Trp Lys Lys Gly Pro Thr Arg1 5 10 15Gly Lys Gly Gly Pro Gln Asn Ala Ala Cys Glu Tyr Arg Gly Val Arg20 25 30Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Lys35 40 45Arg Thr Arg Leu Trp Leu Gly Ser Phe Ala Thr Ala Glu Glu Ala Ala50 55 60Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Phe65 70 75 80Leu Asn Leu Pro His Leu Arg Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala His Gln85 90 95Arg Leu Arg Trp Leu Pro Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Gly
100 105 110Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Tyr Gly Leu Leu Asn Leu Asn Ala Gln115 120 125His Asn Val His Val Ile His Gln Arg Leu Gln Glu Leu Lys Asn Ser130 135 140Ser Ser Ser Pro Thr Lys Pro Pro Pro Arg Thr Pro Thr Arg Ala Asn145 150 155 160Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Thr Ser Ser Pro Cys Ser Thr Val Thr165 170 175Asn Ser Val Gly Ser Ala Ala Leu Pro Pro Pro Met Ser Cys Phe Gln180 185 190Ala Leu Glu Gln Ala Met Ala Ala Thr Ala Ala Met Glu Ser Ala Pro195 200 205Cys Asp Asp Asp Ala Ala Val Val Gly Phe Gly Ala Asp Lys Pro Gln210 215 220Leu Asp Leu Lys Glu Phe Leu Gln Gln Ile Gly Val Leu Lys Ala Asp225 230 235 240Asp Asp Gly Ala Thr Gly Lys Asn Gly Ala Val His Gly Asp Asp Gly245 250 255Glu Leu Ala Asp Ala Phe Gly Phe Gly Gly Ser Gly Glu Phe Asp Trp260 265 270Asp Ala Leu Ala Ala Asp Met Ser Asp Ile Ala Gly Gly His Gly Gly275 280 285Ala Leu Gly Ala Asn Gly Gly Phe Gln Met Asp Asp Leu His Glu Val290 295 300Glu Gln Phe Gly Gly Cys Met Pro Ile Pro Ile Trp Asp Ile305 310 315<210>12<211>957<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>12atggagagct acgggaggaa gcgggcgtgg aagaaggggc cgacgagggg gaagggcggg 60ccgcagaacg cggcgtgcga gtaccgcggc gtgcggcagc ggacgtgggg gaagtgggta120gccgagatcc gcgagcccaa caagcggacg cgcctctggc tcggctcctt cgccaccgcc180gaggaggcgg cgctcgccta cgacgaggcc gcgcggaggc tctacggccc cgacgccttc240ctcaacctgc cccacctccg cgccgcctcc gccgccgccg cgcaccagcg cctcaggtgg300ctcccggcct ccgccgccgc cgccgccgca agggggggcg ccgccgccgt ccccgcctac360ggcctcctca acctcaacgc gcagcacaac gtccacgtca tacaccagag gctgcaggag420ctcaagaact cgtcgtcgtc gccgaccaag ccgccgccgc gtacgccgac gcgcgccaac480ccgcctccgc cgcctctccc cacctcgtcg ccctgctcca ccgtcaccaa cagcgtcggc540tccgcggctc tgcctccgcc catgtcgtgc ttccaggcgc tggagcaagc gatggcggcc600acggcggcga tggagagcgc gccgtgcgac gacgacgccg ccgtcgtggg cttcggcgcc660gacaagcccc agctcgacct caaggagttc ttgcagcaga taggcgtgct caaggccgac720gacgacggcg cgacaggcaa gaacggcgcc gtccacgggg acgacggcga gctggcggac780gcgtttggct tcggcggcag cggcgagttc gactgggacg cgctggctgc cgacatgagc840gacatcgcag gaggccacgg cggcgcgctg ggcgccaatg gcgggttcca gatggacgat900ctgcatgagg tcgaacagtt tggcgggtgc atgcccatcc ctatttggga catttga。 95權(quán)利要求
1.來自水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)將序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述蛋白的氨基酸殘基序列為序列表中的SEQ ID NO1、3、5、7、9或11。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)錄因子的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO4的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO6的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；6)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；7)編碼序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的DNA序列；8)與序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有調(diào)控植物耐逆性功能的核苷酸序列；9)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2、4、6、8、10或12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為序列表中的SEQ ID NO2、4、6、8、10或12。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
7.一種提高植物耐逆性的方法，是將權(quán)利要求3或4或5所述編碼水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐逆性獲得提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼水稻與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列通過含有該基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為GatewayTW系列載體、pBin系列載體、pBI系列載體、pCAMBIA系列載體、per8或pX6。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于以所述GatewayTW系列載體中的pH2GW7為出發(fā)載體構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pH2GW7 Vector-OsDREB1G、pH2GW7Vector-OsDREB1I、pH2GW7 Vector-OsDREB1H、pH2GW7 Vector-OsDREB1F、pH2GW7Vector-OsDREB2B或pH2GW7 Vector-OsDREB2C。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個來源于水稻的與耐逆性相關(guān)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)序列表中的SEQ ID NO3；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO7；5)序列表中的SEQ ID NO9；6)序列表中的SEQ ID NO11；7)將序列表中SEQ ID NO1、3、5、7、9或11的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有調(diào)控植物耐逆性功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)⒃谥参锏哪湍婊蚬こ谈牧贾邪l(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/29GK101062943SQ20071009894
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者王喜萍, 孟秀萍, 黃曉翠, 劉春霞, 辛莉, 張嘉瑤, 楊建宇, 夏勉, 鄧興旺 申請人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司 被以下專利引用 (1),