專利名稱：調(diào)控大豆抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于大豆的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
大豆作為一種重要的油料和糧食作物，弄清其抗病抗逆機(jī)理，進(jìn)而改善其抗病性及抗逆性，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明所提供的抗逆轉(zhuǎn)錄因子名稱為GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由174個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。所述序列2中自氮端到碳端第44-101個(gè)氨基酸殘基保守結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的AP2/EREBP功能保守域。
抗逆轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由910個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第155到第676位堿基，其表達(dá)主要受低溫，高鹽以及脫落酸誘導(dǎo)。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，如pBIN19以及由其衍生而來的pBI101，pBI121和pBI221系列載體(Bevan，1984核酸研究，128711-8721)，將本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對低溫和高鹽脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。表達(dá)載體pBI121-GmDREB是利用常規(guī)分子生物學(xué)手段構(gòu)建的帶有本發(fā)明GmDREB cDNA的表達(dá)載體，它的基因圖譜如

圖1所示，該表達(dá)載體可用于轉(zhuǎn)化大豆等雙子葉植物。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)以及Ubiquitin啟動(dòng)子等。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明GmDREB基因的表達(dá)載體可通過使用Ti(Tumor-induced-癌誘導(dǎo))質(zhì)粒、Ri(Root-induced-根誘導(dǎo))質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞，被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
圖2為GmDREB基因在大腸桿菌中的體外表達(dá)。
圖3為Southern雜交分析結(jié)果。
圖4為不同脅迫條件下Northern雜交檢測的GmDREB基因表達(dá)特征。
取1μg總RNA通過12對(三條正向引物與四條反向引物組合)特異簡并性引物進(jìn)行各自獨(dú)立的一步逆轉(zhuǎn)錄鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)，3條對應(yīng)于AP2/EREBP保守域N-端5’-GIRMRK-3’的正向引物(Forwardprimers)為GDF15’-GGIAT(A/C/T)CGIATGCGIAA(A/G)-3’；
GDF25’-GGIAT(A/C/T)CGIATGAG(A/G)AA(A/G)-3’；GDF35’-GGIAT(A/C/T)AG(A/G)ATGCGIAA(A/G)-3’。
4條對應(yīng)于AP2/EREBP保守域C-端5’-ARLNFP-3’的反向引物(Reverse primers)為GDR15’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAGICGIGC-3’；GDR25’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAG(C/T)CTIGC-3’；GDR35’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AA(T/C)CTIGC-3’；GDR45’-IGG(A/G)AA(A/G)TT(T/C)AAICGIGC-3’。
上述引物中I為次黃苷(inosine)，PCR條件為4℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃1.5分-30循環(huán)；72℃10分；4℃保存。
PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上用于測序，再以陽性克隆為模板利用一對特異性引物GmDF1R5’-CTTCCGCATCCTTATTCC-3’和GmDR1F5’-GCGCGCCTTAACTTCCCC-3’，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因的5’端(PCR程序見kit D6122，Takara Biotech.(Dalian)Co.Ltd)以及3’端(PCR程序見kit D6121，TakaraBiotech.(Dalian)Co.Ltd)。然后體外包裝In vitro-GmDREB基因序列。再設(shè)計(jì)一對特異性引物GmDREBFd165，5’-AAAAGAATTCATGGAAGACAGGGATCACTG-3’，172；GmDREBRe676，5’-AAAACTCGAGATCTTGAAGCTCTTCGAGTT-3’657，94℃，3分；94℃1分，58℃1分，72℃1.5分-30循環(huán)；72℃10分；4℃保存，擴(kuò)增mDREB-cDNA，PCR產(chǎn)物接于pMD18-T載體進(jìn)行測序，得到了一個(gè)與體外包裝序列完全一致的cDNA克隆，即序列1GmDREB的cDNA片段。該基因插入片段為910bp，含有522bp的開放閱讀框架，編碼174個(gè)氨基酸組成的多肽，其5’端為156bp，3’端為192bp。
實(shí)施例2、用于轉(zhuǎn)化的融合表達(dá)載體的構(gòu)建。
GmDREB cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建按常規(guī)分子生物學(xué)手段進(jìn)行。將GmDREB編碼區(qū)域利用GmDREB cDNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過正向引物端的BamHI和反向引物端的SacI位點(diǎn)將其插入到pBI121雙元表達(dá)載體中的一個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子后面，得到一個(gè)融合表達(dá)載體pBI121-GmDREB，其圖譜如圖1所示，經(jīng)酶切鑒定插入片段無誤后，轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌，再提取質(zhì)粒經(jīng)酶切確認(rèn)成功轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌中，該表達(dá)載體可直接用于植物，特別是大豆的轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3、大豆GmDREB基因在大場桿菌中的體外表達(dá)鑒定將GmDREB cDNA編碼區(qū)域連接于一個(gè)表達(dá)載體pGEX-4T-1上，經(jīng)IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進(jìn)行體外翻譯表達(dá)。而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株卻沒有蛋白表達(dá)帶出現(xiàn)。聚丙烯凝膠電泳譜帶如圖2所示，圖中，M是Marker；1、3是經(jīng)誘導(dǎo)的菌株；2是未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株。從圖中可以看出，經(jīng)誘導(dǎo)的菌株有蛋白條帶出現(xiàn)，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株沒有蛋白條帶出現(xiàn)。
實(shí)施例4、GmDREB基因在大豆基因組中的分析。
以地高辛(DIG)標(biāo)記的GmDREB cDNA為探針，與經(jīng)不同限制性內(nèi)切酶(EcoRI，EcoRV，P-PstI以及XhoI)消化后的棉花基因組DNA在65℃條件下進(jìn)行Southern雜交分析，并在高嚴(yán)謹(jǐn)度下洗膜(高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，結(jié)果如圖3所示，有多條雜交帶出現(xiàn)，表明大豆基因組中存在著多拷貝的GmDREB基因，或者存在著低拷貝的GmDREB同源體。
實(shí)施例5、大豆GmDREB基因在逆境脅迫條件下的表達(dá)特征。
生長2個(gè)星期的大豆幼苗分別置于4℃水、250mM NaCl的水溶液，以及100μM脫落酸(ABA)溶液中進(jìn)行光照培養(yǎng)，干旱處理是將生長2個(gè)星期的大豆幼苗經(jīng)水洗凈后置于足以吸干水分的濾紙上在室溫下脫水，并分別在1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí)、12小時(shí)以及24小時(shí)取樣，提取總RNA與GmDREB cDNA探針雜交分析。結(jié)果如圖4所示，其中A是干旱處理的結(jié)果，B是4℃低溫處理的結(jié)果，C是250mM NaCl處理的結(jié)果，D是脫落酸處理的結(jié)果，從圖中可以看出，GmDREB的轉(zhuǎn)錄主要受低溫與鹽誘導(dǎo)，并不同程度受干旱以及ABA誘導(dǎo)。
序列表<160>2<210>1<211>910<212>DNA<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>1gcacctctat atatacatag acacatgtaa atggttgcaa agaaagataa gataggtacc 60agctttcaca tagtttattt aatccgttat atgccacctg atatataggc atattagcta 120gttaggtagg tatagtagtt aagttaattc aaccatggaa gacagggatc actgttgttc 180caacaattca acgatgatca caacaacaaa gaaaagaacg ggtagaagaa gtccaacatc 240ggataagctc aagaatcaac accgcgagaa gcagtcgatg aaaccttacc gtggaataag 300gatgcggaag tgggggaagt gggtggcgga gatcagagaa cccaacaaaa ggtcgaggat 360atggttgggt tcttacacga cacccgtggc cgccgcacgt gcctacgaca ccgctgtctt 420ttacctccgg ggtcccaccg cgcgccttaa cttccccgaa ctcttgttcc aggacgacga 480ccaggagggc agtgattcgg tgcagcacgg cgcagcaggg aacatgtccg ctgattccat 540tcgccgaaaa gccacgcaag tcggcgccag agtcgacgct ctccaaaccg cgcttcacca 600ccacgcgcca agtaccaact ctctcaatct caagcccgac ttgaacgagt ttccaaaact 660cgaagagctt caagattgat ataaatcaaa tatcaatatc aatcaatata tttaatttcc 720taagttcttt attaatatat agttttatgt gtgtatatat agatgatgat gcctcggagt 780tggggcttga aactaattaa ccccttccct tccccttaat ttagatatat cccttttctt 840gtttttccgt atcttcaatc ataatatcaa atcaaagaag tattattatt ttctaaaaaa 900aaaaaaaaaa 910<210>2<211>174<212>PRT<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>2Met Glu Asp Arg Asp His Cys Cys Ser Asn Asn Ser Thr Met Ile5 10 15Thr Thr Thr Lys Lys Arg Thr Gly Arg Arg Ser Pro Thr Ser Asp20 25 30ys Leu Lys Asn Gln His Arg Glu Lys Gln Ser Met Lys Pro Tyr35 40 45Arg Gly Ile Arg Met Arg Lys Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile50 55 60Arg Glu Pro Asn Lys Arg Ser Arg Ile Trp Leu Gly Ser Tyr Thr65 70 75Thr Pro Val Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Val Phe Tyr80 85 90Leu Arg Gly Pro Thr Ala Arg Leu Asn Phe Pro Glu Leu Leu Phe95 100 105Gln Asp Asp Asp Gln Glu Gly Ser Asp Ser Val Gln His Gly Ala110 115 120Ala Gly Asn Met Ser Ala Asp Ser Ile Arg Arg Lys Ala Thr Gln125 130 135Val Gly Ala Arg Val Asp Ala Leu Gln Thr Ala Leu His His His140 145 150Ala Pro Ser Thr Asn Ser Leu Asn Leu Lys Pro Asp Leu Asn Glu155 160 165Phe Pro Lys Leu Glu Glu Leu Gln Asp170 17權(quán)利要求
1.抗逆轉(zhuǎn)錄因子GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第44-101個(gè)氨基酸殘基保守結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的AP2/EREBP功能保守域。
4.抗逆轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述抗逆轉(zhuǎn)錄因子GmDREB的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第155到第676位堿基。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pBI121-GmDREB。
9.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求4所述基因在培育抗寒、抗鹽植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了調(diào)控大豆抗逆性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，本發(fā)明所提供的抗逆轉(zhuǎn)錄因子名稱為GmDREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)?？鼓孓D(zhuǎn)錄因子GmDREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1477109SQ0212888
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月19日
發(fā)明者程憲國, 侯玉霞, 劉強(qiáng), 陳受宜 申請人:清華大學(xué), 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所