專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)與耐鹽性相關(guān)的水稻蛋白質(zhì)激酶基因的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物耐鹽相關(guān)基因，特別涉及一個(gè)來(lái)源于水稻的與耐鹽性相關(guān)的蛋白質(zhì)激 酶相關(guān)基因及其在培育耐鹽性植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白激酶催化生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化，蛋白質(zhì)的磷酸化是生物體能量代謝和信號(hào)傳 遞中的重要生化反應(yīng)。促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶(MAPKs， mitogen-activated protein kinases) 是蛋白質(zhì)激酶中的一個(gè)大家族，屬于絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶家族，有l(wèi)l個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域， 廣泛存在于各種真核生物中(Nakagami H, Pitzschke A, Hirt H., 2005. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling. Trends Plant Sci. 10: 339 346)，在細(xì)胞中對(duì)各種信號(hào)進(jìn)行 應(yīng)答，迅速在其絲氨酸、蘇氨酸殘基部位磷酸化而被激活。真核生物中的MAPKs在將外 源刺激信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)應(yīng)答受體/感應(yīng)器的下游的過(guò)程中起著樞紐的作用(Bogre L, Meskiene I, Heberle隱Bors E， Hirt H., 2000. Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation. Plant Mol Biol. 43: 705-718.)。在植物中，MAPK級(jí)聯(lián)途徑與不同的生物及非生物脅迫反應(yīng)、激 素反應(yīng)、細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程有關(guān)。MAPK被上游分子促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶(即MAP2K， MAP kinase kinase、 MAPKK)磷酸化后激活，而MAP2K又被其上游的促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即 MAP3K， MAPKK kinase、 MAPKKK)激活，這3個(gè)激酶構(gòu)成一個(gè)功能模塊，組成MAPK 級(jí)聯(lián)(MAPK cascades) (Nakagami H， Pitzschke A， Hirt H., 2005. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling. Trends Plant Sci. 10: 339 346)。 MAPK能將眾多底物蛋 白，如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、細(xì)胞骨架蛋白等磷酸化。某些低分子量的的GTP結(jié)合蛋白(如 Ras 、 Rac、 cdc42)和一些特殊的激酶能夠作為MAP4K (MAPKKKK)來(lái)調(diào)節(jié)MAP3K 的活性。植物MAPKs與動(dòng)物和酵母的蛋白激酶一樣，有一個(gè)由300多個(gè)氨基酸組成的催化區(qū) 域，包含11個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域，在vn和VEi亞結(jié)構(gòu)域之間，有一個(gè)非常保守的T-X-Y區(qū)， 由蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)和一個(gè)X氨基酸(X可以是谷氨酸、脯氨酸或甘氨酸)構(gòu)成， 也稱(chēng)為三肽模塊，在其中起關(guān)鍵作用(Boulton T G Yancopoulos G D, Gregory J S, Slaughter C, Moomaw C, Hsu J， Cobb M H. , 1990. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeastkinases involved in cel cycle control. Science, 249: 64~67)。在植物中已發(fā)現(xiàn)的MAPK可分為 兩個(gè)亞類(lèi)，其中一類(lèi)含有TEY區(qū)，具體又分為A、 B、 C 3組，另一類(lèi)則含有TDY區(qū)， 則單獨(dú)為D組(MAPK Group( Ichimura K et al.) , 2002. Mitogen-activated protein kinase cascade in plants: a new nomenclature. Trends Plant Sci, 7:301 308)。雖然MAPK級(jí)聯(lián)途45由 這3種激酶組成，但就具體的MAPK級(jí)聯(lián)途徑的組成成份、生理功能、調(diào)節(jié)因子等情況還 知之甚少，目前僅在哺乳動(dòng)物屮研究得相對(duì)清楚，在植物中目前只在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一條 相對(duì)完整的植物體MAPK級(jí)聯(lián)途徑MEKK1(MAP3K) —MKK4/MKK5 (MAP2K)— MPK3/MPK6(MAPK)。這條途徑的激活使植物體表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌性和病毒性病原體的抗性 (Nakagami H, Pitzschke A, Hirt H., 2005. Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling. Trends Plant Sci. 10: 339 346)。MAPK級(jí)聯(lián)途徑在病原反應(yīng)、機(jī)械損傷、各種生物和非生物脅迫、激素以及細(xì)胞周期 等多種信號(hào)途徑中均具有關(guān)鍵性作用，當(dāng)生物體感受到環(huán)境脅迫(如冷、干旱、高鹽、紫 外輻射或受到損傷)及其他細(xì)胞因子和生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)(如生長(zhǎng)素、乙烯、脫落酸等激素) 刺激時(shí)，MAPK被不同的上游信號(hào)分子激活，通過(guò)對(duì)下游分子如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、細(xì) 胞骨架蛋白等的磷酸化作用，最終將外界信號(hào)傳遞給細(xì)胞核，調(diào)節(jié)特異基因的表達(dá)，使細(xì) 胞、組織、器官、整個(gè)生物體作出相應(yīng)的生理反應(yīng)(BogreL,MeskieneI,Heberle-BorsE,Hirt H.,2000. Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation. Plant Mol Biol. 43: 705-718.)。己經(jīng)分離克隆的許多植物的MAPK基因，主要參與病原反應(yīng)、環(huán)境脅迫和激素反應(yīng)等。 用真菌刺激因子(elicitor)處理紫花苜蓿能激活4個(gè)MAPK,它們分別是SIMK、 MMK2、 MMK3和SAMK (Cardinale F, Jonak C, Ligterink W, Niehaus K, Boiler T, Hirt H, 2000. Differential activation of four specific MAPK pathway by distinct elicltors. J Biol Chem, 275: 36734-36740)。對(duì)芹菜細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)真菌刺激因子能引起AtMPK同源物ERMK的活化， 且該MAPK被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)核內(nèi)，這說(shuō)明它有可能將某些參與防御反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化 (Ligterink "W， Kroj T， zurNiedenU， HirtH, Scheel D， 2000. Receptor~~mediated activation of a MAP kinase in pathogen defense of plants. Science, 276: 2054-2057)。煙草的SIPK和 WIPK可被TMV病毒激活，同時(shí)SIPK在高滲環(huán)境和低滲環(huán)境下都被誘導(dǎo)激活，而WIPK僅 在低滲環(huán)境下被激活(Zhang S, Klessig DF, 1998. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogenactivated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 7433~7438)。 ！1202是生物防御反應(yīng)中一個(gè)重要的信號(hào) 物質(zhì)，也是MAPK的強(qiáng)激活劑。在大豆中發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)MAPK家族成員在氧爆發(fā)誘導(dǎo)因子的剌激下被快速激活(Taylor ATS, Kim J, Low P S, 2001. Involvement of mitogen-activated protein kinase activation in the signaltransduction pathways of the soya bean oxidative burst. Biochem,355:795 803)。 11202在擬南芥葉片細(xì)胞中激活一個(gè)特異的1^^ 1<^-ANP1 ，后者 又能激活A(yù)tMPK3和AtMPK6，組成磷酸化級(jí)聯(lián)。能表達(dá)ANP1類(lèi)似物NPK1的轉(zhuǎn)基因煙草表 現(xiàn)出對(duì)多種逆境的忍受力，被激活的MAPK級(jí)聯(lián)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著雙重作用它既能 激活逆境反應(yīng)基因，保護(hù)植物不受傷害；又能抑制生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的作用(KovtmiY, Chiu W L, Tena Q Sheen J, (2000) Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 97, 2940-2945)。各種環(huán)境脅迫，如極端溫度、干旱、滲透脅迫及紫外輻射等都能通過(guò)MAPK信號(hào)途徑 在生物體內(nèi)引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)。紫花苜蓿中的p44MMK4蛋白在干旱和冷脅迫時(shí)被激活，它 又能引起自身mRNA水平的上升(Jonak， C.， Kiegeri, S.， Ligterink, W., Barker, P丄，Huskisson, N.S., Hirt, H. 1996. Stress signaling in plants: a mitogen-activated protein kinase pathway is activated by cold and drought. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 11274 11279.)。滲透脅迫對(duì)煙 草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的作用已得到初步了解，SIPK在高滲環(huán)境和低滲環(huán)境下都被誘導(dǎo)激活，而 WIPK僅在低滲環(huán)境下被激活。番茄處于熱脅迫狀態(tài)下時(shí)，有一個(gè)50kDa的MAPK被激活 (Link V, Sinha A K, Vashista P， Hofmann M G， Proels R K， Ehness R, Roitsch T, 2002. A heat-activated MAP kinase in tomato: a possible regulator of the heat stress response. FEBS Lett, 531: 179-183)。另夕卜，UV-B輻射處理番茄也能激活MAPK(Yalamanchili RD, Stra加ann J W, 2002. Ultraviolet-B activates components of the systemin signaling pathway in Lycopersicon peruviaimm suspension-cultured cells. J Biol Chem， 277: 28424 28430)。玉米中的ZmMPK5 在冷脅迫的恢復(fù)過(guò)程中被激活(Coronado M J, Gonzalez-Melendi P, Segui J M， Ramirez C, Rarany I， Testillano P S, Risueno M C, 2002. MAPK entry into the nucleus at specific interchromatin domains in plant differentiation and proliferation processes. J Struct Biol， 140: 200-213)。在紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)對(duì)溫度變化敏感的MAPK，它們?cè)?5匸時(shí)均沒(méi)有活性， 而當(dāng)細(xì)胞所處的溫度從37。C變成25。C時(shí)，SAMK (Stress-Activated Protein Kinase)被激活， 當(dāng)溫度從4。C變成25。C時(shí)，HAMK(Heart shock-Activated Protein Kinase)被激活(Sangwan V, Dhindsa R S， 2002. In vivo and in vitro activation of temperature-responsive plant map kinases. FEBS Lett, 531:561 564.)。風(fēng)是植物體在自然界中最易遭受的機(jī)械脅迫，機(jī)械操作處理擬 南芥的葉片后能引起特殊的MAPK和MAPKK基因的轉(zhuǎn)錄(Mizoguchi, T., Irie, K.， Hirayama, T., Hayashida, N., Yamaguchi-Shinozaki, K.， Matsumota, K., Shinozaki， K. 1996. A geneencoding a mitogen-activated protein kinase kinase kinase is induced simultaneously with genes for a mitogen-activated protein kinase and an S6 ribosomal protein kinase by touch, cold, and water stress in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl Acad. Sci. USA ， 93, 765 769.)。觸碰紫花苜蓿 植株2s之后就能引起MAPK的活化。紫花苜蓿的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞受到持續(xù)的振蕩后也能持續(xù) 表達(dá)MAPK的活性，停止振蕩l h后，MAPK活性消失，再振蕩幾秒鐘后，其活性又恢復(fù) (B6gre L， Ligterink W, Heberle-Bors E, Hirt H, 1996. Mechanosensors in plants. Nature, 383:489~490) 這些都為MAPK參與機(jī)械刺激信號(hào)的傳導(dǎo)提供了直接的證據(jù)。在受到創(chuàng)傷 的煙草葉子中WIPK基因被快速轉(zhuǎn)錄(Seo S, Okamoto M, Seto H, Ishizuka K, Sano H, Ohashi Y.， 1995. Tobacco MAP kinase: a possible mediator in wound signal transduction pathways. Science. 22: 270(5244): 1988-92)。轉(zhuǎn)基因煙草中WIPK基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源 MAPK的失活，結(jié)束創(chuàng)傷反應(yīng)。紫花苜蓿的葉子受到創(chuàng)傷后，MMK4被激活(B6gre L, Ligterink W, Meskiene I, Barker P J， Heberle-Bors E， Huskisson N S, 1997. Wounding induces the rapid and transient activation of a specific MAP kinase pathway. Plant Cell, 9: 75 83 )。植物MAPK對(duì)生物和非生物的脅迫反應(yīng)并不是孤立的，往往同時(shí)對(duì)多個(gè)脅迫因子起反 應(yīng)。OsBWMKl是水稻中第一個(gè)被分離的MAPK基因，病原菌M.grisea感染4個(gè)小時(shí)后被誘 導(dǎo)，對(duì)機(jī)械損傷響應(yīng)時(shí)間為半小時(shí)，同時(shí)又受SA、 JA、 ABA、 ET等各種激素以及H202、 高鹽、蔗糖、干旱和高溫等各種壓力信號(hào)的誘導(dǎo)(He, C.， Fong， S. H. T., Yang, D. et al., 1999, BWMK1, a novel MAP kinase induced by fUngal infection and mechanical wounding in rice, Mol. Plant-Microbe Interact. 12: 1064-1073.)。水稻OsMAPK5基因及其蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)激酶 的活性受ABA，病原體感染及機(jī)械性傷害、干旱、鹽害及低溫等非生物逆境所誘導(dǎo)。有趣 的是，在抑制OsMAPK5表現(xiàn)的RNAi轉(zhuǎn)基因植株中，減弱的激酶活性導(dǎo)致抗病基因，例如， PR1和PR10的持續(xù)性表達(dá)，進(jìn)而增加對(duì)真菌(Magnaporthe grisea)和細(xì)菌(Burkholderia glumae) 的抵抗力，而RNAi轉(zhuǎn)基因植株在干旱、鹽害及低溫的耐性上卻大大降低。相對(duì)的，OsMAPK5 過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，表現(xiàn)為激酶活性提高和對(duì)干旱、鹽害及低溫的耐性。從這些結(jié)果推 領(lǐng)!， OsMAPK5正向地調(diào)控對(duì)干旱、鹽害及低溫的耐性，而負(fù)向地調(diào)控PR基因的表現(xiàn)，進(jìn) 而影響對(duì)廣泛病原物種的抗性(Xiong L, Yang Y, 2003. isease resistance and abiotic stress, tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic Acid—Inducible Mitogen-Activated Protein Kinase. The Plant Cell, Vol. 15, 745-759.)。在MAPK級(jí)聯(lián)中的3種成分里，MAP2K數(shù)量最少，研究發(fā)現(xiàn)MAP2K能與不止一個(gè) MAPK作用。因此MAP2K在植物體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著一個(gè)信號(hào)發(fā)散點(diǎn)的作用(Jin, H., Liu, Y" Yang， K., Kim, C., Baker， B丄,Zhang, S., 2003. Function of a mitogen-activated proteinkinase pathway in N-gene mediated resistance in tobacco. Plant J. 33, 719—731)。MAP3K有許多MAP2K和MAPK所沒(méi)有的調(diào)節(jié)區(qū)域，如GTP結(jié)合蛋白的結(jié)合域、亮 氨酸拉鏈二聚化序列、酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)等，MAP3K結(jié)構(gòu)上的變 化比MAP2K和MAPK都大。這樣，MAP3K就能被各種特異的上游因子調(diào)節(jié)，并能選擇 性的調(diào)節(jié)不同的MAP2K的活性，使MAPK級(jí)聯(lián)能靈活的對(duì)各種細(xì)胞刺激做出反應(yīng)。植物 體中的MAP3K主要分為含有與MEKK1/STE11/BCK1等典型MAP3K相似的激酶結(jié)構(gòu)域 的MEKKs和類(lèi)Raf( Raf-like )亞組(MAPK Group( Ichimura K et al.) , 2002. Mitogen-activated protein kinase cascade in plants: a new nomenclature. Trends Plant Sci, 7:301~308) 。 Jouannic 等在1999年時(shí)獲得14個(gè)的植物MAP3K基因，其中包括AtMAP3Ktx(AJ010090), AtMAP3K(33 (AJ010092), AtMAP3Kf(Y14316)， AtMAP3KSl (Y14199)等(Jou咖ic S, Hamal A, Leprince AS， Tregear JW, Kreis M, Henry Y. 1999 Characterisation of novel plant genes encoding MEKK/STE11 and RAF-related protein kinases. Gene. 229(1-2):171-181.)。隨后 mekk亞組又被細(xì)分為a, (3， y, and ;組等；類(lèi)Raf (Raf-like)亞組則包括S 、 e組等 (Jouannic S， Hamal A, Leprince AS, Tregear JW， Kreis M, Henry Y. 1999 Plant MAP kinase kinase kinases structure, classification and evolution. Gene. 233(1隱2):1-11.)。在J以南芥中， MEKKs亞組的AtMEKKl (—種MAP3K)能激活冷、高鹽、植物病原菌激發(fā)子、觸碰等 4個(gè)不同途徑的MAP2K。 (Ichimura, K., Mizoguchi， T.， Morris, P., Giraudat， J" Matsumoto, K. and Shinozaki, K., 1998. Isolation of ATMEKKl (a MAP kinase kinase kinase)-interacting Proteins and Analysis of a MAP Kinase Cascade inArabidopsis.; Mizoguchi T, Ichimura K, Irie K, Morris P，Giraudat J ， Matsumoto K, Shinosaki K,1998. Identification of a possible MAP kinase cascade in Arabidopsis thaliana based on pairwise yeast two-hybrid analysis and functional complementation tests of yeast mutants. FEBS Lett. 437， 56~60.)。 MEKKs亞組的其 它MAP3K如苜蓿的MsOMTKl和煙草的NtNPKl分別參與氧化應(yīng)激和環(huán)境脅迫及激素信 號(hào)途徑。類(lèi)Raf亞組的MAP3Ks的序列與MEKKI亞組的MAP3Ks不同，且差異比較大， 可分為2類(lèi) 一類(lèi)有延伸的N端，存在一些特定的結(jié)構(gòu)域；另一類(lèi)則沒(méi)有延伸的N端，但 有些成員在N端序列中含有特定的結(jié)構(gòu)域。類(lèi)Raf亞組的AtCTRl (Kieber JJ, Rothenberg M, Roman G， Feldmann KA, Ecker JR. 1993. CTRl， a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the raf family of protein kinases. CelL;72(3):427-41.)和LeCTRl (Leclercq J, Adams-Phillips LC, Zegzouti H, Jones B, Latch6 A, Giovannoni JJ, Pech JC， Bouzayen M., 2002. LeCTRl, a tomato CTRl-like gene, demonstratesethylene signaling ability in Arabidopsis and novel expression patterns in tomato. Plant Physiol. 130(3): 1132-42.)參與擬南芥和番茄的乙烯信號(hào)途徑。類(lèi)Raf亞組的AtEDRl則參與擬南芥 的真菌病原反應(yīng)(Tang D, Innes RW (2002) Overexpression of a kinase-deficient form of the EDR1 gene enhances powdery mildew resistance and ethylene-induced senescence in Arabidopsis. Plant J 32: 975-983)。水稻的OsEDRl的表達(dá)受JA、 SA、 H202、干早、鹽害、 重金屬等多種因子的誘導(dǎo)，表明其在防衛(wèi)/逆境信號(hào)途徑和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均起作用(Kim JA, Agrawal GK, Rakwal R, Han KS, Kim KN， Yun CH, Heu S, Park SY, Lee YH, Jwa NS., 2003. Molecular cloning and mRNA expression analysis of a novel rice (Oryzasativa L.) MAPK kinase kinase, OsEDRl, an ortholog of Arabidopsis AtEDRl， reveal its role in defense/stress signalling pathways and development. Biochem Biophys Res Commun. 300(4):868隱76.)?？傊?，在植物體MAPK主要參與了抗逆信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)多種植物激素的反應(yīng)以及對(duì)植物 生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，有關(guān)植物MAPK的研究還處于比較初級(jí)的階段，MAPK參與這些生 物學(xué)過(guò)程的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的深入研究。水稻中已有的研究主要集中在MAPK上，參與水稻對(duì)病原菌侵染和非生物逆境(干 旱、鹽和寒冷等)反應(yīng)以及水稻自身的生長(zhǎng)發(fā)育等，如OsBIMKl(Song F, Goodman R M, 2002. OsBIMKl， a rice MAP kinase gene involved in disease resistance responses. Planta, 215:997-1005)、 OsMAPK5(Xiong L, Yang Y, 2003. isease resistance and abiotic stress, tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic Acid—Inducible Mitogen-Activated Protein Kinase. The Plant Cell, Vol. 15, 745-759.)、 OsBWMKl(He， C., Fong, S. H. T., Yang， D. et al., 1999, BWMK1, a novel MAP kinase induced by fiingal infection and mechanical wounding in rice, Mol. Plant-Microbe Interact. 12: 1064-1073. a)、 OsWJUMKl (Agrawal GK,Agrawal SK,Shibato J,Iwahashi H,Rakwal R., 2003 .Novel rice MAP kinases OsMS固K3 and OsWJUMKl involved in encountering diverse environmental stresses and developmental regulation.Biochem Biophys Res Comm,300:775 783)。水稻MAP2K目前只克隆鑒定了受低 溫誘導(dǎo)表達(dá)的OsMEKl基因，由OsMEKl和OsMAPl介導(dǎo)的MAPK級(jí)鏈可能參與水稻 對(duì)低溫的抗逆反應(yīng)(Wen JQ, Oono K, Imai R, 2002.Two novel mitogen隱activated protein signaling components, OsMEKl and OsMAPl, are involved in a moderate low-temperature signaling pathway in rice. Plant Physiol. 129(4): 1880-91.)。水稻MAP3K克隆鑒定的第1個(gè)基 因是擬南芥EDR1的同源基因OsEDRl，其表達(dá)受JA、 SA、 H202、干旱、鹽害、重金屬 等多種因子的誘導(dǎo)，而且在營(yíng)養(yǎng)和生殖器官組織中也存在差異表達(dá)，表明OsEDRl基因在水稻防衛(wèi)/逆境信號(hào)途徑和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用(Kim JA, Agrawal GK， Rakwal R, Han KS, Kim KN, Yun CH, Heu S, Park SY, Lee YH, Jwa NS., 2003. Molecular cloning and mRNA expression analysis of a novel rice (Oryza sativa L.) MAPK kinase kinase, OsEDRl, an ortholog of Arabidopsis AtEDRl， reveal its role in defense/stress signalling pathways and development. Biochem Biophys Res Commun. 300(4):868-76.)。但OsEDRl介導(dǎo)的MAPK級(jí)聯(lián)尚不清楚。 已報(bào)道的MAPK禾3 MAPK級(jí)聯(lián)途徑屮參與抗鹽反應(yīng)的基因有水稻的OsBWMKl 、 OsMAPK5(MAPK基因)、OsEDRl (MAP3K基因，類(lèi)Raf亞組)和擬南芥的 AtMEKKl(MAP3K基因，MEKK亞組)。巳有的研究結(jié)果表明MAPK和MAPK級(jí)聯(lián)途徑在水稻的抗病反應(yīng)和抗逆反應(yīng)中具有 重要作用。水稻是世界上最重要的糧食作物，也是單子葉植物的模式植物，它為全球近一半的人 口提供食物。然而，干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫，每年都會(huì)在全世界范圍內(nèi)造成水稻大 面積的減產(chǎn)，全球約有40%的水稻種植區(qū)受到不同程度的環(huán)境脅迫。隨著全球人口的不斷 增加和可耕種面積的逐年減少，提高水稻產(chǎn)量成為全球所共同面臨的一個(gè)緊迫的挑戰(zhàn)，而 減少逆境脅迫所造成的產(chǎn)量損失，就能夠在很大程度上緩解糧食危機(jī)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個(gè)與耐鹽相關(guān)的促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即 MAP3K)及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與耐鹽性相關(guān)的促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即MAP3K) OsMAP3KP3，來(lái)源于稻屬水稻(00^a犯"raL)，是下述蛋白質(zhì)(i)或(ii):(i) 具有序列表中的SEQIDNO: l的氨基酸序列；(ii) 在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有調(diào)控 植物耐鹽性功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQIDNO: l氨基酸序列由536個(gè)氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第 275-505位氨基酸殘基為促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即MAP3K)保守區(qū)，將具有該 氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsMAP3K|33;所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘 基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基 進(jìn)行取代、缺失或添加的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常是利用基因工程的手段 對(duì)其編碼基因進(jìn)行突變，然后再表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。通過(guò)在植物中表達(dá)所述蛋白，并測(cè)試 這些植物的耐鹽性，可以判斷發(fā)生這些變化后的蛋白是否還具有調(diào)控植物耐鹽性的功能。編碼本發(fā)明來(lái)源于水稻的與耐鹽性相關(guān)的OsMAP3K(33基因，可以具有下述核苷酸序 列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；2) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有調(diào)控 植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；3) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1xSSC (或0.1xSSPE )、 0.1% SDS的溶液中，65。C條件下雜交并洗膜。其中，O.lxSSC為20xSSC的稀釋液，20xSSC的配方為3mol/LNaCl (175g/L)， 0.3mol/L檸檬酸三鈉'2H2(D (88g/L)，用lmol/L HCl調(diào)至pH 7.0; O.lxSSPE為20xSSPE 的稀釋液，20xSSPE的配方為3mol/LNaCl (175g/L)， 0.2mol/LNaH2POH20 (27.6g/L) 和0.2mol/L EDTA (7.4g/L)，用lmol/LNaOH調(diào)至pH 7.4。序列表中的SEQ ID NO: 2由1835個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5'端第1-1608 位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO:l的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第823-1515 位堿基編碼促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即MAP3K)保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的 基因命名為0 M4P3iCyW 。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 擴(kuò)增C^M4i^ATy^中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐鹽性的方法。本發(fā)明所提供的提高植物耐鹽性的方法，是將編碼所述與耐鹽性功能相關(guān)的基因(例 如6^M4i33^63或與該基因具有90%以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列)導(dǎo)入植 物組織、細(xì)胞或器官，使植物耐鹽性獲得提高。在上述提高植物耐鹽性的方法中，本發(fā)明7K稻與耐鹽性相關(guān)基因Oyil^i^A:;^既可為所 述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90%以上同源 性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn) 行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核 苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如， 反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用。基因序列變化 或縮短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的。本發(fā)明水稻與耐鹽性相關(guān)基因OsM4尸^:;53或其同源序列可通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng) 桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如GatewayTW系 列載體(如pH2GW7等)、pBin系列載體(如pBin 19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、 pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA1301等)、per8、 pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述 出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pENTER-TOPO、 pUC系列載體或 pBluescript系列載體等。使用本發(fā)明7jC稻與耐鹽性相關(guān)基因QsM4PJA^3或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在 其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ABA、干旱、 鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子；所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S 啟動(dòng)子、玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actinl啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為根特 異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、種子特異性表達(dá)啟動(dòng) 子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào) NM—118848.2， GI:30687489)和NapinA (GenBank號(hào)M64633.1, GI:349405)啟動(dòng)子等； 所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干早、ABA、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；上述啟 動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá) 載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起 始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的 正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合 成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加 工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo) 記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII) 基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可 由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆 境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern. PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手 段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。其中，以pH2GW7 (購(gòu)自inVitrogen公司)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明水稻與耐 鹽性相關(guān)的促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即MAP3K) OsMAP3Kp3基因的植物表達(dá)載體為pH2GW7 Vector-OsMAP3K(33。攜帶有編碼本發(fā)明7jC稻與耐鹽性相關(guān)的基因C^M4i^i^3或其同源序列的植物表達(dá)載體 可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca^、 PEG)、 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA 轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種 或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成 植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明7K稻與耐鹽性相關(guān)基因OyM!P3A:;^或與所述基因具有90 %以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步 篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的 抗逆性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組 織或器官既可來(lái)源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹(shù)、桉樹(shù)、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物， 也可來(lái)源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發(fā)明提供了一個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的蛋白質(zhì)激酶基因促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激 酶激酶(即MAP3K)OsMAP3Kp3。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對(duì) 鹽脅迫的耐受性，且對(duì)水稻的正常生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編 碼基因?qū)τ谥参锬婢衬褪苄詸C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重 要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類(lèi)作物)的抗逆基因工程改良中發(fā)揮重要作 用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖l為本發(fā)明分離的序列OyM4P3A^與推測(cè)序列EAY87678基因結(jié)構(gòu)的比對(duì)圖。圖2為AtMAP3Kp3、 AtMEKKl和OsMAP3Kp3保守區(qū)的同源性比對(duì)結(jié)果。圖3為OsMAP3KP3 Tl代轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐鹽苗比例的柱形圖。圖4為經(jīng)鹽脅迫處理后的OsMAP3K卩3 Tl代轉(zhuǎn)基因耐鹽植株與野生型植株照片。圖5為OsMAP3Kp3 T2代轉(zhuǎn)基因水稻不同株系耐鹽苗比例的柱形圖。圖6為經(jīng)鹽脅迫處理后的OsMAP3K卩3 T2代轉(zhuǎn)基因耐鹽植株與野生型植株照片。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook， J.， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3"1 edition, 2001, NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均 由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例1、耐鹽基因QsM4i^K"/U的獲得1、 基因序列的獲得以擬南芥MAP3K beta 3即AtMAP3Kp3基因的核苷酸序列(GenBank號(hào)AJ010092) 在GENBANK中進(jìn)行同源基因檢索，獲得水稻的同源序列(GenBank號(hào)EAY87678),該 同源序列位于水稻第二條染色體上，其CDS為1572 bp，編碼523個(gè)氨基酸，與AtMAP3K卩3 的激酶結(jié)構(gòu)域具有58%的同源性，具有蛋白激酶的11個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，推測(cè)是水稻中的一個(gè) MAP3K基因，并命名為OsM4尸3A"/ J 。2、 ayM4WA^的PCR擴(kuò)增及序列分析根據(jù)GENBANK中OyM4P3/:/W序列的編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，以水稻廣陸矮cDNA為模板， 采用PCR方法擴(kuò)增OsMAP3K(33 。弓|物序列如下正向引物5，> CACCATGGCGGCGCGCCAGCGG >3;反向引物5 ，>CCGCTGTATCATGGCAAGGGATTTGGG>3'。按Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(cat .#K1622，購(gòu)自 Fermentas公司)說(shuō)明書(shū)的步驟對(duì)水稻廣陸矮的幼苗總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后用 RT-PCR方法擴(kuò)增，50)aLPCR反應(yīng)體系為上、下游引物(1(^M)各lpl， cDNA模板lpl， Pfu酶(5U/)al)l)al， 4XdNTPs (各10mM) 1^1， lOXPfiibuffer(Mg2+) 5pl， H2O40|^l。 PCR 反應(yīng)條件為預(yù)熱95'C預(yù)變性2min，然后95°C變性30 s、 57°C退火30 s、 72°C延伸 150 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi) %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了大小為1835 bp的DNA片段?；厥詹⒓兓鲜銎危瑢⑵溥B接入載體pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，再將連接 產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli) DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性單菌 落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 200ipm下培養(yǎng)12-16小 時(shí)，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pENTER-TOPO Vector-OsMAP3Kp3。 對(duì)上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了與推測(cè)序列基本一致的OsMAP3Kp3基因，但其中的3'端序列有所不同。經(jīng)過(guò)與基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中推測(cè)的核苷酸序列 (GenBank號(hào)EAY87678)與序列表中SEQ ID NO: 2的核苷酸序列是屬于不同的剪切方 式。推測(cè)的核苷酸序列(GenBank號(hào)EAY87678)有9個(gè)外顯子。本發(fā)明所分離的序列由1835 個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架為自5'端第1-1608位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。與推測(cè)序列相比，本發(fā)明所分離的序列由8個(gè)外顯子組成， 第1至7個(gè)外顯子(l-1430bp)與推測(cè)的核苷酸序列(GenBank號(hào)EAY87678)相同，如圖 1所示，第8個(gè)外顯子(1431-1608 bp)包括推測(cè)序列的第8個(gè)外顯子部分(1431-1517bp)及其 內(nèi)含子的序列(1518-1608)，推測(cè)序列中的第9個(gè)外顯子(1518-1572 bp)在本發(fā)明分離的序列 中不屬于編碼區(qū)。由于GENBANK中的只是推測(cè)的基因剪切模型，而本發(fā)明所獲得的序列 是具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，更為真實(shí)可信。所以將本發(fā)明所分離的序列表中SEQIDNO: l序列 也命名為OsMAP3Kj33。 OsMAP3K卩3與同屬于MAP3K基因MEKK亞組的AtMAP3Kp3、 AtMEKKl氨基酸殘基序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示，比對(duì)結(jié)果表明OsMAP3K卩3 與AtMAP3K卩3的激酶結(jié)構(gòu)域具有64%的同源性，與AtMEKKl的激酶結(jié)構(gòu)域具有66%的 同源性。實(shí)施例2、水稻中耐鹽相關(guān)OsMAP3KP3基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將實(shí)施例1獲得的與耐鹽性相關(guān)的基因C^M4尸3A^3轉(zhuǎn)化水稻，具體 方法如下1)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌通過(guò)LR反應(yīng)將實(shí)施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pENTER-TOPO Vector- OsMAP3Kp3中的 OsMAP3KP 3基因重組到表達(dá)載體pH2GW7 (Invitrogen公司的Gateway vector載體) 上，LR反應(yīng)體系為2 pl緩沖液、2 |nl (150-300 ng)線(xiàn)性化的pH2GW7質(zhì)粒DNA、 2 pi (100-300 ng) pENTER-TOPO Vector- OsMAP3K卩3質(zhì)粒DNA、 2 pi H20，再加入2 pi LR Clonase， LR反應(yīng)條件為25。C水浴保溫1 h， 加入1 |xl 2 U/pl蛋白酶K， 37°C水浴 10min。然后，通過(guò)熱激法將上述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli) DH5ct感受態(tài)細(xì)胞，篩 選陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性單菌落加入到5mL含50mg/L的壯觀(guān)霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C、 200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRV進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng) 酶切獲得了大小分別為1919 bp的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符。再在實(shí)施例l中引物的引 導(dǎo)下進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明獲得了含有OsMAP3KI33的重組植物表達(dá)載體，命名為 OsMAP3Kp3-pH2GW7，隨后將上述重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL0菌株(中國(guó)科學(xué)院遺傳所 贈(zèng)送)。2) 侵染水稻愈傷組織挑取步驟1)獲得的陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌的單菌落接種于含壯觀(guān)霉素50mg/L和利福平 50mg/L的20mL YEB液體培養(yǎng)基中，在28°C 、 150rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天，再于4°C、5000rpm 離心3分鐘，去上清，將菌體沉淀重懸于含O.lmmol/L乙酰丁香酮的AA培養(yǎng)基(含 Co(N03)2'6H2O 0.15mg/L， CaCl2 110mg/L， MgS04 122mg/L, KI 3.75mg/L， NaH2P04'H20 150mg/L， Na2-EDTA0.01mM， FeS04-7H20 139mg/L， KC12.95g/L， MnS04.4H20 84.5mg/L， ZnS04.7H20 6.25mg/L， H3B03 5mg/L， Gly 37.5mg/L， CuS04 0.005mg/L， Na2Mo04'2H20 1.25mg/L，鹽酸硫胺素VB! 5mg/L，煙酸5mg/L，鹽酸吡哆醇VB6 5mg/L，肌酸0.1g/L， 酪蛋白水解物0.3g/L， L-Gln 87.6mg/L， L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28。C下避光 振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)至OD6(xr0.6-0.9。挑選按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的水稻中花11的生 長(zhǎng)狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入上述轉(zhuǎn)化有OsMAP3Kp3-pH2GW7的重組農(nóng)桿菌培養(yǎng)液 中搖動(dòng)20分鐘后，靜置30分鐘，取出，用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織接種于N6 共培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+10g/L葡萄糖+lmg/L乙酰丁香酮+2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)) 上培養(yǎng)，其中Ns基本培養(yǎng)基的配方為(NH4) 2SO40.46g/L， KN03 2.83g/L， CaCl20.2g/L， MgSO40.092g/L， KH2P04 0.4g/L， Na2-EDTA0.15g/L， FeS04.7H20 0.11g/L， MnS04'4H20 0.44g/L， ZnS04.7H20 0.17g/L， H3B03 0.14g/L， CoCl2.6H20 0細(xì)5g/L， CuS04'5H20 0.0005g/L， Na2Mo04'2H20 0.005g/L，鹽酸硫胺素VBi 0.01g/L，煙酸0.001g/L，鹽酸吡眵 醇VB6 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro0.5g/L，蔗糖30g/L,瓊脂10g/L， pH5.8。 2-3天后，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無(wú)菌水沖洗3-5次，每次搖動(dòng)數(shù)次，然后 在含500mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水中浸泡30-60分鐘，最后再用無(wú)菌水沖洗1遍，置于無(wú)菌 濾紙上晾干，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+2,4-D 2mg/L+頭孢霉素250mg/L)篩 選。3) 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將侵染后的水稻愈傷組織于N6共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3-5天后，轉(zhuǎn)至含30mg/L潮霉素和 400mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基(N6大量元素+B5微量元素+B5有機(jī)成分+300mg/L水 解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH 5.8)上篩選3周，再轉(zhuǎn)入含50mg/L 潮霉素和200mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基上篩選4周，隨后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分 化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+lmg/L奈乙酸+2mg/L 6-芐基氨基嘌呤+5mg/L脫落酸)，光照培養(yǎng)3 周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+lmg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤)上進(jìn)行分化， 將生長(zhǎng)出的再生植株在壯苗培養(yǎng)基(1/2 MS無(wú)機(jī)鹽+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上進(jìn)行生根培養(yǎng)后移至溫室中，在28'C、 15小時(shí)/天的光照下培養(yǎng)1個(gè)月后取植株葉片，按常 規(guī)方法提取總DNA，在正向引物5， - ACTCACCGCGACGTCTGT -3'和反向引物5，-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3，的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴(kuò)增獲得 1009 bp DNA片段的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，檢測(cè)結(jié)果表明用上述方法獲得了轉(zhuǎn)化有 OsMAP3Kp3-pH2GW7的轉(zhuǎn)基因水稻。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因Tl代水稻植株的遺傳分析和分子鑒定取實(shí)施例2收獲的OsMAP3KP3 Tl代轉(zhuǎn)基因水稻的種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)， 然后用50mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因水稻中花11作對(duì)照，篩選5天后， 對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比， 選擇抗性苗與無(wú)抗性苗的分離比約為3 : 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點(diǎn)插入的 OsMAP3K(33轉(zhuǎn)基因株系。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因Tl代植株耐鹽性鑒定收獲OsMAP3K卩3 Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子。用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L 潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因水稻中花ll作對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死 亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，獲得具有單位點(diǎn) 插入的OsMAP3K(33轉(zhuǎn)基因株系。繼續(xù)培養(yǎng)10天后，將苗轉(zhuǎn)移到大試管中，加入含有1% NaCl的鹽溶液，進(jìn)行鹽脅迫處理7天(溫度28'C;光強(qiáng)2500 Lux;光照時(shí)間光15h/ 暗9h)，期間每天更換鹽溶液，以保持鹽濃度和pH值的穩(wěn)定，篩選7天后除去鹽溶液， 改為正常培養(yǎng)， 一周后統(tǒng)計(jì)成活苗數(shù)，計(jì)算耐鹽苗比例，結(jié)果如圖3所示(橫坐標(biāo)為不同 的轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)，縱坐標(biāo)為耐鹽苗百分比)，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的中花ll水稻苗為對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tl代轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)鹽的耐受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)鹽處 理后，OsMAP3K卩3轉(zhuǎn)基因水稻T1代陽(yáng)性株系的植株恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)基因 的中花ll對(duì)照(WT)植株的葉片發(fā)黃、巻曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù)培養(yǎng)后很快死 亡(見(jiàn)圖4)。將篩選得到的OsMAP3Kj33轉(zhuǎn)基因Tl代耐鹽陽(yáng)性植株移栽大田，繼續(xù)生長(zhǎng)。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因T2代植株耐鹽性鑒定收獲T2代OsMAP3K|33轉(zhuǎn)基因水稻種子，對(duì)Tl代進(jìn)行耐鹽篩選后的3個(gè)不同的具有 單位點(diǎn)插入的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行T2代植株耐鹽鑒定，每個(gè)株系選取2個(gè)不同的T2代植株進(jìn) 行篩選，每個(gè)植株選取100粒飽滿(mǎn)的種子進(jìn)行浸種，發(fā)芽出苗后，用50mg/L的潮霉素進(jìn)行篩選5天，選取純合體植株進(jìn)行耐鹽篩選。繼續(xù)培養(yǎng)IO天后，將苗轉(zhuǎn)移到大試管中， 加入含有1。/。NaCl的鹽溶液，進(jìn)行鹽脅迫處理7天(溫度28。C;光強(qiáng)2500 Lux;光照 時(shí)間光15h/暗9h)，期間每天更換鹽溶液，以保持鹽濃度和pH值的穩(wěn)定，篩選7天后 除去鹽溶液，改為正常培養(yǎng)， 一周后統(tǒng)計(jì)成活苗數(shù)，計(jì)算耐鹽苗比例，結(jié)果如圖5所示(橫坐標(biāo)為不同的轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)，縱坐標(biāo)為耐鹽苗百分比)，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的中花n水稻苗為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)鹽的耐受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因水稻植 株，經(jīng)鹽處理后，OsMAP3K(33轉(zhuǎn)基因水稻T2代陽(yáng)性株系的植株恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生長(zhǎng)， 未轉(zhuǎn)基因的中花ll對(duì)照(WT)植株的葉片發(fā)黃、巻曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù)培養(yǎng) 后很快死亡(見(jiàn)圖6)。盡管為說(shuō)明目的公開(kāi)了本發(fā)明的具體實(shí)施例和附圖，其目的在于幫助理解本發(fā)明的內(nèi) 容并據(jù)以實(shí)施，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解在不脫離本發(fā)明及所附的權(quán)利要求的精 神和范圍內(nèi)，各種替換、變化和修改都是可能的。因此，本發(fā)明不應(yīng)局限于最佳實(shí)施例和 附圖所公開(kāi)的內(nèi)容。序列表(SEQUENCE LISTING) <110>北京未名凱柘農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司 <120> —個(gè)與耐鹽性相關(guān)的水稻蛋白質(zhì)激酶基因的克隆及應(yīng)用 <130> JSP070356 <160> 2< 170> Patentln version 3.1<210〉 1<211〉 536<212> PRT<213> 水稻(Oryzasativa)<400> Met Ala1AlaVal CysSer Phe50 Phe ArgAla ValArg Gin Arg Pro Arg Ala Gin Leu Ala Arg lie Asn AlaMet Arg HisG丄y 35 ArgSer 20 Glu5 TyrArg Ala SerPro AlaGlu Glu 130Leu 100 Glu Ala 115Ala GlyThr Ala AlaLeu Asp Asplie Arg GlyLys Leu GlyTyr AlaAla 85 GluLeu 70 AlaGly 55 SerGly 40 ArgGly 25 Gly10 AspMet Ser HisVal Ala SerAla Val ProPro AlsPro 135Met 120 LysPro 1〇5 AsnLeu 90 SerAsp Gly SerGly Glu TyrGly Ala AlaGly Pro GluAsp 75 SerGlu 60 PheAla 45 ValArg Glu AlaGly 30 Ser15 AspAspGin ThrThr Ala lieThr lie ProSer Ser AlaGlu Eeu LeuLeu Val GinSer 140Glu 110 Val Glu 125Glu ValArg 95 AlaPro80ArgSerLys GlyThr GluVal Ser 145工le Arg Val ValThr Arg Ala Tyr Ala Asn Ala Thr Pro Ala Pro Glu Ser155Phe Val GinTyr 150 ProAla 165Thr Arg Ser Tyrlie Glu Val Ser Thr Arg Ser Tyr Ala 180 185 Ser Val Ala Ser Lys Arg Ala Leu Leu 195Glu Lys Gly LysSer Ala Thr Lys 170Arg Pro Ala AlaAlaGlu 175 ValSer 160 AlaArgAsp Lys Glu Lys Gly Lys !Leu 210 215 lie Arg Gly Glu Val Val Val 225Ser Ala Leu Val!Leu 200 Val!LysSer 190Ala Asp GluVal 230Glu Ala Thr ArgVal 245Glu His Leu lie Ser Pro Ser Pro 260Thr Ser Trp Leu Lys Gly Glu 275Glu Ala lie SerGin Asp Ser 205Arg Leu Asp Lys Ser Arg Glu Glu 220Glu Ala Thr Arg Glu Thr Thr Gly 235Ser Thr SerVal Tyr Glu Ala lie Ser Asp 290 295 Val Ser Leu lie Asp Gin Gly 305 310 Leu Glu His Glu lie Ser !LeuHis 280 AspHis 265 LeuGlu 250Arg Arg Phe ArgGlyArgAsp 255 ThrAla 240 lielieArg 270Phe Gly Serlie 325Val Gin Tyr Phe Gly Thr Asp Lys 340!Leu Glu Leu Val Thr Gin Gly 355Gin Asp SerSer Gly Ser 285Gly Phe Phe Phe Ala Val L>ys Glu 300lie Asn Ala Lys Gin Arg lie Val 315Leu Glu HisLeu Ser Arg 330Glu Asp Gly Lys Leu 345 LeuGluAsn 335 lieGin 320 liePheAlaArg Leu 370Gin Val 375Ser 360Ser Ala TyrTyr 350Gin Lys TyrAla Leu Tyr 365Thr Arg Gin lie !Leu lie 380Gly Leu Asn 385Cys Ala AsnTyr Leu His Gin Arg Asn390lie Leu Val Asp Ser Asn 405Lys Glu Met SerPhe Gly Leu Ala 420Lys Gly Thr Val Tyr Trp Met 435His Gly Pro Pro 45CMet Leu Thr Gly 465Leu Leu !Lys lieVal Leu His Arg Asp lie395Gly Leu Val Lys Leu 410Leu Ser Ginlie 425Pro Glu Val AlaAlaAla 440Trp Ser LeuArg 430 AlaAla 415 SerLys 400 AspSerLys ProLysThr Val Leu GluSer Glu Asp Ala 500Asn Asp Arg Pro Ser Ala Ala 515Arg Ser Leu Gin 530Ala Asp lie Trp Ser Leu Gly Cys 455 460 Lys Val Pro Tyr Thr Asp Met Glu Trp Thr His470 475 Gly Arg Gly lie Pro Pro Glu lie Pro Ala Thr 485 490 495Arg Asp Phe lie Met Lys Cys Val Lys Val AsnHis Lys Gly 535lie Pro Pro 490lie Met Lys505 Gin Leu Leu 520 AlaAla ProCys Val Lys Val 510Asp His Pro Phe Val Gin 525<210> 2<211> 1835<212〉 DNA<213〉 水稻(Oryzasativa)<400> 2stggcggcgcgccagcggccgcgggcgcsgctcgcgcggstcascgccstgsggcactcc60t3C3ccgccgcgggggscgstggctccggggscgscgtgtgtggggsgctcgscgscggc120gggggcgsgtscgcgtcgc3gsccsgcttccgcstccgcggggggcgcggggccgcggag180gtcaccgcc3tcttccgcssgctggggctctccgggcccg3gg3cttc3ccstcccgccc240gcggtct3cg gaggtggctt a3tcgggs3g gsggttscsg atcsgagtag 3cscg3tc3t ctgaagcagg tcscgagsgg tcggctctggtC3CCCtCtCctcgggagtg gctgtcssgg cttgagcatgttggcagctc csg3ttttgs tgtgcaaatacctgaggttg 3C3gttttsg ttgctt3333 cgtgatttca ctgttggacc tgttgctaacctctgttgcs aggatgatccccgccgccst ccccgtcggs csgtcgsg33 3sgtttccsc tsgctcc3tc atgc3sggcc 3tsgtgcsg3tcgtggaggc ctcacsggcg gatcgttcgg aggtgtcstt sgatctctct 3gga3g3tggt3t3tC3333taggtttgaa tcctagtggs cssttttgsg ctaaggct33 3satgctgac ttggtsgsgg t3atg33gtg 3tccatttgt 3sacttgctt 33tsgggcgc tttcstagatC333tCCCttgtcccscctc gctcctsgeis gggggsgga3 acgagcttat ggccsccaas tgcsgcgsgc cgaggscasg agaggtggttgttt3ggags gtcsgtgtat gattgatcsa gttgagtcgt 3333Ctgtst 3t3ccgtttaCt3tCt3C3Cttct33tggsgcctcstgga tggcasagttt3tgactstg ttt33tttts gccstgstactccagctccg gcttctccsg gctggtccgg gcaastgcsa tttgttcsag gtcagatcaggtggaggctatCC3CttC3C3cc3tcscgt gaggct3tcs gggstcaatg ttggagcstg sttttccttg csggactC3C csgcgg33cg ttsgtt333ccctccsgcsg ccatacactg gawttccsgctgc33csts tggtcagtat stcctgt3tt cctgtggss3 sgcggcccgccgccg ccgaagccgcCCCCC333ttcgcctgcscc csgssgctat tagcttct3a sattggtcsggtg3cstcgs cctggcttsa gtgstgstggC3333C33Cg3333C3ttgt33Ct3gt33C3sgtctc3gc tgttsc3cag tggcagattt3tatgg33tg ctscsctgtc 3tcggccstc S3ggcgcct3 tccsttctttcgcgtcgctc ggttccgstg ggttcsatcs 3g3atcgagc sgsagtttcc scgsgctctgcsccggtgcc gcstttgsttttttttcttc cattgtccas tcagtatttt tcasggctcttgggcttgc3 ctgg3tggcc tcttggctgc g3cgc3tgcttgctgctcsg 3tcsctcttgCtC3t3C333stggstttct gttgstgctg300 360 420 糊 540 600 660 720 780 謹(jǐn) 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 183權(quán)利要求
1.一種與植物耐鹽性相關(guān)的蛋白質(zhì)，是下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)(i)具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有調(diào)控植物耐鹽性功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求l所述蛋白質(zhì)的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；2) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具 有調(diào)控植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；3) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列，所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在含0.1% SDS的O.lxSSC或O.lxSSPE溶液中， 65'C條件下雜交并洗膜。
4. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)及其編碼基因在提高植物耐鹽性上的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于將所述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胫参?細(xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到耐鹽 性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)編碼基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列；2) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具 有調(diào)控植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；3) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷 酸序列，所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在含0.1% SDS的0.1xSSC或0.1xSSPE溶液中， 65'C條件下雜交并洗膜。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)編碼基因通過(guò)植物表達(dá) 載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于用所述蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建植物表達(dá) 載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于用所述蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建植物表達(dá) 載體時(shí)添加翻譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于在所述植物表達(dá)載體中加入選擇性 標(biāo)記基因，所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生 顏色變化的酶的基因、發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物和抗化學(xué) 試劑標(biāo)記基因。
全文摘要
本發(fā)明克隆了一個(gè)與耐鹽性相關(guān)的水稻蛋白質(zhì)激酶基因，并公開(kāi)了其應(yīng)用。所述蛋白質(zhì)激酶基因編碼的是一種促分裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶(即MAP3K)，是下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)(i)具有序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有調(diào)控植物耐鹽性功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，將所述基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性，且對(duì)水稻的正常生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬婢衬褪苄詸C(jī)制的研究，以及提高植物的耐鹽性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101225375SQ20081005655
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者王喜萍 申請(qǐng)人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司