專利名稱：固相載體化的交聯(lián)酶聚集體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定化酶，尤其涉及固定于固相載體上的交聯(lián)酶聚集體及其制備方 法，屬于酶的固定化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
從上個(gè)世紀(jì)60年代開始酶的固定化研究以來，人們從各個(gè)方面對(duì)酶的固定化 技術(shù)進(jìn)行探討和研究，已經(jīng)成功地運(yùn)用了物理和化學(xué)的方法對(duì)酶進(jìn)行了固定化，其 中許多的技術(shù)和產(chǎn)品在工業(yè)生產(chǎn)中得到了應(yīng)用。但固定的對(duì)象基本上都是游離酶， 由于游離酶是對(duì)環(huán)境要求較高，比較脆弱的可溶性蛋白質(zhì)， 一般情況下，對(duì)熱、強(qiáng) 酸、強(qiáng)石成均不穩(wěn)定。在常用的固定化方法中，由于較強(qiáng)烈的化學(xué)反應(yīng)，通常對(duì)蛋白 質(zhì)的性質(zhì)造成極大的影響，由于酶又具有一定的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)，極易受到表面活性 劑、載體表面物理性狀、化學(xué)接枝等因素的影響，對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)或活性中心造成 不可逆的破壞，使得酶活力下降、或失活，嚴(yán)重影響了固定化酶的效果和使用。
2002年荷蘭Delft大學(xué)Sheldon小組提出用蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀酶蛋白，得到具有 穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)的酶聚集體,再用戊二醛交聯(lián),制備了交聯(lián)酶聚集體(Cross Linked Enzymey Aggregates,CLEAs)。對(duì)七種商業(yè)化的脂肪酶進(jìn)行了聚集體交聯(lián)，得到了具有較好酶 活性的無載體固定化酶(P.Lopez-Serrano,L.Cao,F.van Rantwijk & R.A.Shddon et al.Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases.Biotechnology letters,2002,24:1379-1383 )。 2003年董曉毅對(duì)脲酶進(jìn)行了聚集體 交聯(lián)，獲得了具有較好穩(wěn)定性的交聯(lián)脲酶聚集體(董曉毅、夏仕文交聯(lián)脲酶聚集 體的制備和初步應(yīng)用[J ].生物工程學(xué)報(bào),2003，19(3):332 336 )。
聚集體交聯(lián)酶(CLEAs )是繼交聯(lián)溶解酶(CLEs )、晶體交聯(lián)酶(CLECs)后發(fā)展 起來的一種固定化的酶，屬于無載體固定化的范圍。由于聚集體交聯(lián)酶中酶分子處 于穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，所以形成的固定化酶具有熱穩(wěn)定性高，抗胰酶能力強(qiáng)等特點(diǎn)。但由于 聚集體交聯(lián)酶是無載體固定化，具有高度的分散性，所以丟失了固定化酶的最主要 的特點(diǎn)反應(yīng)完畢后難于回收利用；沒有一定的物理形態(tài)，在工業(yè)化生產(chǎn)中不能用 于連續(xù)性生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服聚集體交聯(lián)酶所存在的不能回收再利 用的缺點(diǎn)，提供一種固定于載體上的交聯(lián)酶聚集體，該交聯(lián)酶聚集體除具有熱穩(wěn)定 性高，抗胰酶能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)外，還具有一定的物理形態(tài)和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可以回收利用， 能夠連續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種固定于固相載體上的交聯(lián)酶聚集體，其中，所述的固相載體是多孔微球。 所述的多孔微球可以由各種材質(zhì)制成，例如，可以由有機(jī)材料(例如有機(jī)高分 子多孔材料等)、無機(jī)材料(多孔玻璃、多孔陶瓷等)等材料制成；用所述的多孔 微球作為交聯(lián)酶聚集體的固相化載體，無需對(duì)其進(jìn)行特殊處理，只要其主要孔隙大 于待固定的蛋白質(zhì)分子大小的1-2倍即可。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的多孔微球的平 均孔徑為10nm 300nm之間，更優(yōu)選為30nm。
適用于本發(fā)明的可固定化酶的范圍非常廣泛，只要是能夠被蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀 的酶(或者說采用現(xiàn)有的聚集體交聯(lián)技術(shù)可將其制備成聚集體交聯(lián)酶，這類的酶都 可適用于本發(fā)明)基本上均可作為本發(fā)明固定化酶的對(duì)象，例如，可以是有機(jī)磷降 解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶等，優(yōu)選為有機(jī)磷降解 酶、乳糖酶。
本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種制備上述固定于固相載體上的 交聯(lián)酶聚集體的方法。
本發(fā)明所要解決的另 一個(gè)技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種制備固定于固相載體上的交聯(lián)酶聚集體的方法，包括酶蛋白的沉淀、交聯(lián)， 其特征在于首先讓需要固定的游離態(tài)酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微球內(nèi) 進(jìn)行酶蛋白的沉淀、交聯(lián)，最后漂洗多孔微球，即得。
優(yōu)選的，所述的分散方法包括將游離態(tài)酶溶于緩沖液中后加入多孔微球，緩 慢攪拌，讓游離態(tài)酶分散于多孔微球中；更優(yōu)選的，將游離態(tài)酶溶于磷酸鹽緩沖液 中，配制成濃度為0.1-1.5mg/ml的酶溶液(更優(yōu)選為配制成0.4-0.5mg/ml的酶溶液)， 在4 25。C溫度條件下緩慢攪拌1 ~3小時(shí)，讓游離態(tài)酶分散于多孔微球中。
所述酶蛋白的沉淀、交聯(lián)等方法與現(xiàn)有的制備交聯(lián)酶聚集體時(shí)酶蛋白的沉淀、 交聯(lián)的方法相同；優(yōu)選的，所述的酶蛋白的沉淀按照以下方法進(jìn)行加入的蛋白質(zhì) 沉淀劑在4 ~ 25。C的溫度條件下緩慢攪拌3 ~ 5小時(shí)；所加入的蛋白質(zhì)沉淀劑包括但 不限于硫酸銨、叔丁醇或乙醇等；所加入的濃度范圍在33% ~80% (v/v )。所述的交聯(lián)優(yōu)選按照以下方法進(jìn)行加入雙功能交聯(lián)劑在4-25。C溫度條件下 緩慢攪拌15~24小時(shí)；所加入的雙功能交聯(lián)劑包括但不限于戊二醛、苯基二異 硫氰或雙重氮聯(lián)苯胺-2等；所加入的濃度范圍在0.1% ~ 2.5% (v/v )之間。
剛性的多孔微球由于自身材料的特性，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和一定的機(jī)械強(qiáng) 度。本發(fā)明合理利用多孔微球的孔隙特性，使聚集體交聯(lián)酶在形成的過程中固定于 載體的孔隙中，不規(guī)則的孔隙使形成的穩(wěn)態(tài)固體酶保留在載體中，達(dá)到了固定化酶 的目的，而小于蛋白質(zhì)分子的孔隙就成為化學(xué)反應(yīng)體系中底物、產(chǎn)物的傳質(zhì)和對(duì)流 的通道。
本發(fā)明解決了聚集體交聯(lián)酶所存在的不能回收再利用的缺點(diǎn)，賦予了聚集體交 聯(lián)酶一定的物理形態(tài)和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，又保留了聚集體交聯(lián)酶的優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)于工業(yè)化批 次和連續(xù)化生產(chǎn)，開拓了聚集體交聯(lián)酶工業(yè)化應(yīng)用的前景。
本發(fā)明固定化酶方法簡單，簡便易行，反應(yīng)條件易于最佳化，無需特殊設(shè)備。 本發(fā)明方法所制備的固定化酶穩(wěn)定性高，抗胰蛋白酶能力強(qiáng)，可反復(fù)使用，可填充 各種形狀的裝置，具有較高的液體流速，易于在工業(yè)化生產(chǎn)中使用。


圖1 對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2 鄰硝基酚(ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3 固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體和液體有機(jī)磷降解酶的熱穩(wěn)定性比
較；
圖4固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體的牢固度測(cè)試(振蕩搖床的轉(zhuǎn)速為200 轉(zhuǎn)/分)；
圖5 固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體批次法連續(xù)反應(yīng)測(cè)試； 圖6固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體的牢固度測(cè)試(振蕩搖床的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/ 分)；
圖7固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體批次法連續(xù)反應(yīng)測(cè)試。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述 而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方
5案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體的制備
稱取有機(jī)磷降解酶溶解在磷酸鹽緩沖液中，配制成蛋白濃度為0.4mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非極性吸附樹脂，型號(hào)為ADS - 5;平均孔徑為30nm，粒徑大于100nm;性能對(duì)蛋白質(zhì)、糖類、無機(jī)酸、堿、鹽、小分子親水性有機(jī)物均不吸附；在熱、酸、堿、有機(jī)溶劑等條件下均有很高的穩(wěn)定性。天津南開和成科技有限公式生產(chǎn))，在4。C下緩慢攪拌3小時(shí)；再加入硫酸銨至飽和度為67.5%，在4'C下緩慢攪拌5小時(shí)；加入戊二醛(25% )溶液至最終濃度為2.2%,在4。C下緩慢攪拌18小時(shí)；過濾取出多孔微球，反復(fù)漂洗至溶液澄清。
實(shí)施例2
稱取乳糖酶溶解在磷酸鹽緩沖液中，配制成蛋白濃度為0.5mg/ml的酶溶液，加入多孔微球(聚苯乙烯型非極性吸附樹脂，型號(hào)為ADS-5。平均孔徑為30nm,粒徑大于100pm;性能對(duì)蛋白質(zhì)、糖類、無機(jī)酸、堿、鹽、小分子親水性有機(jī)物均不吸附；在熱、酸、堿、有機(jī)溶劑等條件下均有很高的穩(wěn)定性。天津南開和成科技有限公式生產(chǎn))，在4。C下緩慢攪拌3小時(shí)。加入硫酸銨至飽和度為67.5%，在4'C下緩慢攪拌5小時(shí)。加入戊二醛(25% )溶液至最終濃度為2.2%, 4。C下緩慢攪拌18小時(shí)。過濾取出多孔微球，反復(fù)漂洗至溶液澄清。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明固定化的交聯(lián)酶聚集體的性能測(cè)試
一、 試驗(yàn)材料
受試樣品1:實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體；受試樣品2:實(shí)施例2所制備的固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體；
二、 測(cè)試項(xiàng)目
1 .有機(jī)磷降解酶酶活測(cè)定方法對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取0.08346g對(duì)硝基酚，先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至100mL (6mmol/L)。在試管中分別加入O、 2.5、 5、 7.5、 10、 15、 20、 30、 40、 50|xL的對(duì)硝基酚溶液和1000、 997.5、 995、 992.5、 990、 985、 980、 970、 960、 950|iL的50mmol/L
Tris-Cl(pH8.0)緩沖液，總體積為lmL,然后每管加入lmL10。/。三氯乙酸，再加入lmL
6100/c)Na2C03溶液，總體積為3mL, 410nm測(cè)定光吸收值。同時(shí)，繪制對(duì)硝'基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
游離酶和實(shí)施例l所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體的活力測(cè)定游離酶的測(cè)定在試管中加入5mL (10mg/mL)曱基對(duì)硫磷溶液，pH8.0、 900ML ( 50mmol/L ) Tris-HCl緩沖液和100 |jL經(jīng)適度稀釋的酶液，37。C保溫10分鐘，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 10。/。Na2C03溶液顯色，410nm測(cè)定光吸收值。按照下述公式計(jì)算酶活力
酶活力(U/mL) =(58.593 0D4,。-0.5625)X②(3XI0-3)XI。①XN
N為酶液的稀釋倍數(shù)；
一個(gè)酶活性單位(U)定義為在37。c,每分鐘釋放出liimol對(duì)硝基酚所需的酶量。
固定化酶的測(cè)定在試管中加入5fiL (10mg/mL)曱基對(duì)硫磷溶液，pH8.0、995 |jL ( 50mmoI/L ) Tris-HCl緩沖液和60mg的受試樣品1 ， 37。c保溫10分鐘，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)> 再加入1 mL 10。/。Na2C03溶液顯色，410nm測(cè)定光吸收值。按照上述公式計(jì)算酶活力。
2.乳糖酶酶活測(cè)定方法
鄰硝基酚(ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
稱取0.25gONP溶解、定容于lOOmlO.lMHAc-NaAc緩沖液中。在試管中分別加入0、 50、 100、 150、 200、 250、 300pL的ONPG溶液和1000、 950、 900、 850、800、 750、 700pL的O.lmmol/L HAc-NaAc (pH5.2)緩沖液，總體積為lmL，然后每管加入lmL10。/o三氯乙酸，再加入2mL 1MNa2C03溶液，總體積為4mL, 420nm測(cè)定光吸收值。同時(shí)，繪制鄰硝基酚(ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。
游離酶和實(shí)施例2所制備的固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體的活力測(cè)定游離酶的測(cè)定在試管中加入800pL的0.25%鄰硝基酚-B _ D半乳糖苷(ONPG),將加入以上底物的試管放入60。c水域中預(yù)熱2min，加入20(HiL的經(jīng)適度稀釋的酶液，6(TC保溫15分鐘，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入2 mL1M Na2C03溶液顯色，420nm測(cè)定光吸收值。按照下述公式計(jì)算酶活力(814.88 OD420+5.6746)X5XN酶活力(U/ml) - 15X誦-
N為酶液的稀釋倍數(shù)
一個(gè)酶活性單位(U/ml)定義為在60。C,每分鐘分解鄰硝基苯酚-(3 - D半乳糖苷(ONPG)生成lpmol鄰硝基酚ONP所需的酶量。
固定化酶的測(cè)定在試管中加入1000 mL的0.2% onpg溶液和10mg的受試樣品1 ， 60。C保溫15分鐘，加入1 mL 10 %三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入2 mL 1M Na2C03溶液顯色，420nm測(cè)定光吸收值。
3. 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別取適量的有機(jī)磷降解酶液體酶和實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體，在70度水浴中分別保溫0、 30、 60、 90、 120、 150、 180、 210分鐘后，按照酶活力測(cè)定方法測(cè)定酶活。
4. 牢固度試驗(yàn)
在三角瓶中分別加入10克實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體、實(shí)施例2所制備的固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體，以及200ml pH7.5的磷酸緩沖液，置于37。C搖床中，轉(zhuǎn)速為200r.p.m。振蕩2小時(shí)后，取出約0.5克固定化多孔微球，置4。C備用。抽干三角瓶的緩沖液，加入新的緩沖液，再次振蕩2小時(shí)，重復(fù)上述步驟取樣。固定化酶在搖床中共連續(xù)振蕩14小時(shí)。振蕩結(jié)束后，按照上述測(cè)定酶活的方法分別測(cè)定酶活。
5. 連續(xù)反應(yīng)批次試驗(yàn)
(1 )實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體的測(cè)定在7毫升西林瓶中加入60毫克實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體，995 pL (5Ommol/L， pH8.0) Tris-HCl緩沖液，5 pL (10mg/mL)曱基對(duì)硫磷溶液，37"保溫10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，小心的吸出反應(yīng)液，置于試管中，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 10 %Na2C03溶液顯色，410nm測(cè)定光吸收值。
在保留有固定化酶的西林瓶中再加入995 mL (5Ommol/L, pH8.0) Tris-HCl緩沖液，5 |iL (10mg/mL)曱基對(duì)硫磷溶液，進(jìn)行新一輪的反應(yīng)，共重復(fù)反應(yīng)50次。
8(2 )實(shí)施例2所制備的固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體的測(cè)定
在7毫升西林瓶中加入10毫克實(shí)施例2所制備的固定化的交聯(lián)乳糖酶聚集體，
加入1000 mL的0.2%onpg溶液，60。C保溫15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，小心的吸出反
應(yīng)液，置于試管中，加入1 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入2 mL 1M Na2C03
溶液顯色，420nm測(cè)定光吸收值。
在保留有固定化酶的西林瓶中再加入1000 mL的0.2%onpg溶液，進(jìn)行新一輪
的反應(yīng)，共重復(fù)反應(yīng)40次。
三、測(cè)試結(jié)果
1、 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別測(cè)定本實(shí)施例1所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體與有機(jī)磷降解酶的液體酶的熱穩(wěn)定性，測(cè)定結(jié)果表明，本實(shí)施例所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體的熱穩(wěn)定性高，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于有機(jī)磷降解酶的液體酶的熱穩(wěn)定性(圖3)。
2、 牢固度試驗(yàn)
采用振蕩搖床(振蕩搖床的轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分)分別測(cè)定了受試樣品1和受試樣品2的固定化酶的牢固度，測(cè)定結(jié)果說明，本發(fā)明所制備的固定化的交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體和交聯(lián)乳糖酶聚集體牢固度好(圖4、圖6)。
3、 連續(xù)反應(yīng)測(cè)試
通過批次法連續(xù)反應(yīng)測(cè)試，表明受試樣品1和受試樣品2可反復(fù)使用，適應(yīng)于工業(yè)化批次和連續(xù)化生產(chǎn)(圖5、圖7)。
9
權(quán)利要求
1、一種交聯(lián)酶聚集體，其特征在于所述交聯(lián)酶聚集體固定于多孔微球載體上。
2、 按照權(quán)利要求1的交聯(lián)酶聚集體，其特征在于所述的多孔微球由有機(jī)材 料或無機(jī)材料制成；其中，所述的有機(jī)材料優(yōu)選為有機(jī)高分子材料；所述的無機(jī)材 料優(yōu)選為玻璃或陶瓷。
3、 按照權(quán)利要求1或2所述的交聯(lián)酶聚集體，其特征在于所述的多孔微球 的平均孔徑為10nm~300nm。
4、 按照權(quán)利要求3所述的交聯(lián)酶聚集體，其特征在于所述的多孔微球的孔 徑為30nm。
5、 按照權(quán)利要求1或2所述的交聯(lián)酶聚集體，其特征在于所述的交聯(lián)酶聚 集體是交聯(lián)有機(jī)磷降解酶聚集體、交聯(lián)乳糖酶聚集體、交聯(lián)木聚糖酶聚集體、交聯(lián) 脂肪酶聚集體、交聯(lián)葡萄糖氧化酶聚集體或交聯(lián)植酸酶聚集體。
6、 一種制備權(quán)利要求1所述的交聯(lián)酶聚集體的方法，包括酶蛋白的沉淀、交 聯(lián)，其特征在于首先讓需要固定的游離態(tài)酶分散于多孔微球中；再依次在多孔微 球內(nèi)進(jìn)行酶蛋白的沉淀、交聯(lián)，最后漂洗多孔微球，即得。
7、 按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的游離態(tài)酶選自有機(jī)磷降 解酶、乳糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶。
8、 按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的多孔微球由有機(jī)材料、 無機(jī)材料制成；其中，所述的有機(jī)材料優(yōu)選為有機(jī)高分子材料；所述的無機(jī)材料 優(yōu) 選為玻璃或陶瓷。
9、 按照權(quán)利要求6-8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述的多孔微球的 平均孔徑為10nm~300nm。
10、 按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于將游離態(tài)酶溶于磷酸鹽緩沖液 中，配制成濃度為0.1 ~ 1.5mg/ml的酶溶液，在4 ~ 25。C溫度條件下緩慢攪拌1 ~ 3 小時(shí)，讓游離態(tài)酶分散于多孔微球中。
全文摘要
本發(fā)明公開了固定化的交聯(lián)酶聚集體及其制備方法。該交聯(lián)酶聚集體固定于多孔微球上，其制備方法包括將需要固定的游離態(tài)酶分散于多孔微球中；在多孔微球內(nèi)依次進(jìn)行酶蛋白的沉淀、交聯(lián)，最后漂洗多孔微球，即得。本發(fā)明固定化酶的方法可用于固定各種類型或來源的酶，固定化方法簡便易行，容易操作，無需特殊設(shè)備，生產(chǎn)成本低，所制備的交聯(lián)酶聚集體穩(wěn)定性高，抗胰蛋白酶能力強(qiáng)，具有一定的物理形態(tài)和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可回收并反復(fù)使用，在工業(yè)化生產(chǎn)中能用于連續(xù)性生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N11/04GK101492665SQ20081005659
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者伍寧豐, 偉 張, 健 田, 范云六, 軍 郭 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所