專利名稱：植物胚乳特異性表達(dá)啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物胚乳特異性表達(dá)啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生物技術(shù)的最新發(fā)展不僅實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)農(nóng)藝形狀的改良(如提高作物產(chǎn)量，增強(qiáng)抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質(zhì)等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產(chǎn)品的生物反應(yīng)器(Daniell et al.，Trends Plant Sci 2001，6219-226；Giddingset al.，Nature Biotech 2000，181151-1156；Hood and Jilka，Curr OpinBiotechnol 1999，10382-386；Hood and Woodard，Plants as Factories forProtein Production 2002，pp.119-135.NetherlandsKluwer Academic)。對于絕大多數(shù)禾本科作物，由于其產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、耐儲藏且生產(chǎn)規(guī)模容易控制等特點(diǎn)，決定了其為第二代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的理想載體。近年來利用水稻種子生產(chǎn)具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經(jīng)取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預(yù)防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白(Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預(yù)防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達(dá)并高水平累積(Goto etal.，Nature Biotech 1999，17282-286；Katsube et al.，Plant Physiol 1999，1201063-1073；Qu et al.，Planta 2005，222225-233；Takagi et al.，ProcNatl Acad Sci 2005，10217525-17530；Ye et al.，Science 2000，287303-305；Zheng et al.，Plant Physiol 1995，109777-786)。然而缺少相應(yīng)的啟動子成為目前生物技術(shù)應(yīng)用(外源基因的理想表達(dá)部位，表達(dá)方式，表達(dá)時(shí)期和表達(dá)水平等)的限制因子。
植物基因工程的根本目標(biāo)是培育能使目的基因穩(wěn)定而且高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株?；虮磉_(dá)受控于轉(zhuǎn)錄起始處的核苷酸序列即啟動子成分，它主要包括RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄的信號，以指導(dǎo)合成相應(yīng)的信使RNA分子，進(jìn)一步指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。啟動子控制基因轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)還決定了基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)方式。
目前廣泛應(yīng)用的啟動子(包括CaMV35S、ubiquitin1、Actin1)盡管其表達(dá)效率高，然而由于其表達(dá)不受時(shí)空限制，它在幾乎所有組織中都能使外源基因表達(dá)，在進(jìn)行種子中外源基因過量表達(dá)過程中，會驅(qū)動基因在種子外的其它組織中表達(dá)，既消耗生物能源，同時(shí)會導(dǎo)致一些可能對生物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的代謝產(chǎn)物的合成。且上述啟動子的表達(dá)強(qiáng)度尚無法滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化的需要。若選擇胚乳特異性高強(qiáng)度表達(dá)啟動子，有助于定時(shí)定向調(diào)控外源有用蛋白的合成，既節(jié)約能源，保證了植物正常生理活動不受干擾，同時(shí)又能提高外源有用蛋白在種子中的儲藏水平。
水稻種子儲藏蛋白以谷蛋白和醇溶性蛋白為主，分別占種子全蛋白的80％和10％。水稻谷蛋白基因只在胚乳中表達(dá)，而在其它組織中幾乎檢測不到谷蛋白。水稻谷蛋白由大約10個(gè)基因控制，這些基因根據(jù)其DNA序列的同源性分為GluA和GluB兩個(gè)基因亞族(Subfamily)，分別由4個(gè)以上基因組成。雖然水稻谷蛋白基因在其堿基序列上具有較高的相似性(亞族內(nèi)80-96％，亞族間60-80％)，但其啟動子區(qū)域卻幾乎沒有相似性，預(yù)示著其基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制各不相同。
來自于水稻胚乳儲藏蛋白基因的啟動子對于外源基因的表達(dá)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Qu和Takaiwa(Plant Biotechn J，2004，2113-125)利用GUS作報(bào)告基因，研究了3個(gè)水稻谷蛋白(GluB-1，GluB-2，GluB-4)，3個(gè)醇溶蛋白(10kD，13kD，16kD)和1個(gè)球蛋白(26kD)基因啟動子的表達(dá)方式、組織表達(dá)特異性和表達(dá)強(qiáng)度。獲得了4個(gè)表達(dá)活性比Ubiquitin高數(shù)倍的胚乳特異性表達(dá)啟動子(GluB-4，10kD prolamin，16kD prolamine和Glb-1)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物胚乳特異性表達(dá)啟動子及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子，來源于水稻GluB-5基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70％或70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中序列1是由2269個(gè)脫氧核苷酸組成。
上述自序列表中序列1的5′端第2201-2206位核苷酸為植物胚乳特異性表達(dá)啟動子TATA盒核心區(qū)。將啟動子除TATA盒核心區(qū)外的其他序列通過堿基突變或缺失等發(fā)生變化，一般不會使啟動子活性完全喪失，因此也可根據(jù)需要將啟動子的調(diào)控元件改變。
含有上述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
在所述表達(dá)盒中，所述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子的下游連接結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA，用于驅(qū)動結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者天然或人工合成的小RNA的表達(dá)。
所述重組表達(dá)載體是上述表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體所述重組表達(dá)載體為重組植物表達(dá)載體，所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。
上述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。
上述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子可用于培育胚乳特異性表達(dá)外源基因的植物。
利用該植物胚乳特異性表達(dá)啟動子培育胚乳特異性表達(dá)外源基因的植物方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述培育胚乳特異性表達(dá)外源基因的植物方法可為將所述外源基因連接于所述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子下游，通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到在胚乳中特異性表達(dá)所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。
所述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子下游還可連接有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件。所述調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件，該調(diào)控元件包括能增強(qiáng)外源基因表達(dá)或調(diào)控基因在植物中表達(dá)部位的元件，如增強(qiáng)子、組成型表達(dá)、組織特異性表達(dá)、誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控元件。
所述方法中，所述外源基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA基因。
所述方法中，所述植物為單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。
所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥；所述胚乳型雙子葉植物是蕎麥、油桐或蓖麻。
本發(fā)明的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子是通過設(shè)計(jì)引物，以水稻基因組DNA為模板，利用PCR方法從水稻中分離得到的谷蛋白基因GluB-5啟動子。通過其在水稻中的表達(dá)特異性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報(bào)告基因只在水稻種子胚乳中特異性表達(dá)。說明本發(fā)明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚乳中特異性的表達(dá)，適用于任何種子具有胚乳的植物，即單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。
利用本發(fā)明的啟動子可提高外源基因在植物胚乳中的表達(dá)和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的啟動子及其應(yīng)用為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴(kuò)增GluB-5啟動子的電泳圖譜圖2為GluB-5啟動子融合GUS基因載體GluB-5-pGPTV-35S-HPT的結(jié)構(gòu)示意3為GluB-5-pGPTV-35S-HPT雙酶切鑒定圖譜圖4為轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻種子中的GUS染色結(jié)果圖5為轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT在開花后7天，12天，17天水稻種子中的GUS染色結(jié)果圖6為轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻種子中的GUS熒光活性測定的柱形圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、植物胚乳特異性表達(dá)啟動子(GluB-5啟動子)的獲得根據(jù)水稻谷蛋白基因GluB-5 cDNA序列(GenBank號為AB016501；Mitsukawa etal.，1998，Plant Biotechnol 15205-211)，從GenBank中查找GluB-5基因的上游序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GluB-5啟動子。為便于載體構(gòu)建，在每對引物上依次添加兩個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。
GluB-5啟動子的正向引物為F15’-AAAGGTCGACGAGAAAAGAAGATTTGCTGAC-3’(Sal I)，反向引物為R15’-AAACCCGGGCTATTTATTGAAAG GATAATGG-3’(Sma I)CTAB法從水稻(野生型水稻Kitaake)葉片中小量提取基因組DNA，以其為模板，以F1和R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增GluB-5啟動子序列。反應(yīng)體系為10μM正反向引物各1μl，10×Ex Buffer 2μl，基因組DNA 1μl(10ng)，ExTaq(TAKARA)0.5unit，加超純水至20μl；反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，然后94℃1min，55℃ 1min30sec，72℃2min30sec，30個(gè)循環(huán)，最后72℃，10min。PCR擴(kuò)增得到2.3kb的目的條帶，如圖1所示。圖1中第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2泳道為GluB-5啟動子?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，直接連接到pT7Blue載體(購自Novagen公司)上，進(jìn)行測序，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的GluB-5啟動子序列大小為2269bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有GluB-5啟動子片段的重組載體命名為pT7-GluB-5。
實(shí)施例2、植物胚乳特異性表達(dá)啟動子(GluB-5啟動子)表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化1、GluB-5啟動子融合GUS基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建用Sal I和Sma I雙酶切pT7-GluB-5質(zhì)粒，回收含有GluB-5啟動子的2269bp的酶切片段，將該片段插入到pGPTV-35S-HPT(按照文獻(xiàn)Qu and Takaiwa，PlantBiotech J 2113-125所述的方法構(gòu)建)的Sal I和Sma I酶識別位點(diǎn)之間。將得到的重組質(zhì)粒在PCR鑒定的基礎(chǔ)上利用Sal I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，得到含有4.5kbGluB-3啟動子的片段，將酶切鑒定表明含有GluB-5啟動子的重組質(zhì)粒命名為GluB-5-pGPTV-35S-HPT(其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)。其中，GluB-5-pGPTV-35S-HPT的雙酶切鑒定圖譜，如圖3所示。圖3中泳道1為DNA分子量標(biāo)記，泳道2為GluB-5啟動子的片段。
2、轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻的獲得用凍融法將GluB-5-pGPTV-35S-HPT導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，然后轉(zhuǎn)化野生型水稻Kitaake。
利用潮霉素篩選方法(按照文獻(xiàn)Hiei et al.，Plant J 1994，6271-282所述方法進(jìn)行)，獲得11株T0代轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻植株。
利用PCR方法對上述篩選得到的轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻進(jìn)行PCR分子檢測，PCR引物為上述擴(kuò)增GluB-5啟動子的引物，即GluB-5啟動子的正向引物F15’-AAAGGTCGACGAGAAAAGAAGATTTGCTGAC-3’(Sal I)，反向引物R15’-AAACCCGGGCTATTTATTGAAAG GATAATGG-3’(Sma I)PCR反應(yīng)體系為10μM正反向引物各1μl，10×Ex Buffer 2μl，基因組DNA 1μl，ExTaq(TAKARA)0.5unit，加超純水至20μl；反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，然后94℃1min，55℃ 1min30sec，72℃ 2min30sec，30個(gè)循環(huán)，最后72℃，10min。PCR擴(kuò)增得到2.3kb的目的條帶即為檢測陽性。
結(jié)果表明得到11株P(guān)CR檢測陽性的轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株。
T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉(zhuǎn)基因植株第2代和第3代。
實(shí)施例3、植物胚乳特異性表達(dá)啟動子(GluB-5啟動子)的功能驗(yàn)證對轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株進(jìn)行組織化學(xué)染色。具體步驟將轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株或野生型水稻Kitaake(對照)根、葉片、葉鞘、莖桿，切成小塊，將開花后7天、12天、17天的灌漿期種子，用解剖刀從中部縱切開，浸泡于GUS反應(yīng)液(0.1M NaPO4緩沖液，pH 7.0，10mM EDTA，pH7.0，5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，1.0mM X-Gluc，0.1％Triton X-100)，37℃反應(yīng)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻根、葉片、葉鞘、莖桿均未觀察到GUS表達(dá)；開花后7天的種子糊粉層、亞糊粉層和胚乳外部變藍(lán)，胚乳中心部位和胚未被染成藍(lán)色；開花后12天的種子與開花后7天的種子相比糊粉層、亞糊粉層、胚乳外部藍(lán)色更明顯，胚乳中心部位藍(lán)色清晰可見，胚未被染成藍(lán)色；開花后17天的種子糊粉層、亞糊粉層和整個(gè)胚乳藍(lán)色清晰可見，與開花后12天的種子相比，胚乳中心藍(lán)色更深，胚未觀察到GUS表達(dá)；而野生型水稻Kitaake(對照)根、葉片、葉鞘、莖桿、以及開花后7天、12天、17天的灌漿期種子都未觀察到GUS表達(dá)；結(jié)果表明GluB-5啟動子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報(bào)告基因只在水稻種子胚乳中特異性表達(dá)。70％乙醇中保存、觀察。解剖顯微鏡下照相。結(jié)果如圖4、圖5所示，圖4中1為野生型水稻Kitaake(對照)花后17天的灌漿期種子染色結(jié)果；2為轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株花后17天的灌漿期種子染色結(jié)果。圖5中7、12、17分別表示轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株花后7天、12天、17天的灌漿期種子染色結(jié)果。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因水稻的組織GUS熒光活性測定對轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株開花后17天的灌漿期種子進(jìn)行GUS定量分析，方法按照J(rèn)efferson等(1987)的熒光檢測方法(Jefferson，Plant Mol.Biol.Report，1987，5387-405)進(jìn)行。具體為取1粒種子，置于1.5ml eppendorf管中，用玻璃棒將種子碾碎，加入30μl抽提液(50mM NaPO4(pH7.0)，10mMβ-Mercaptoethanol，10mM Na2EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS，0.1％Triton X-100)，搖勻。4℃ 15,000rpm離心10min，取10μl上清于新管中，加入90μl保溫至37℃的反應(yīng)液(1mM MUG)，37℃反應(yīng)60分鐘，加入900μl終止液(0.2M Na2CO3)，室溫終止反應(yīng)。用F-4500(日立)型熒光分光光度計(jì)在360nm激發(fā)波長和460nm吸收波長下檢測相對4MU含量。以牛血清蛋白為對照，利用BIO-Rad Protein AssayKit測定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，GluB-5驅(qū)動的GUS在轉(zhuǎn)基因水稻種子中表達(dá)的活性為21.4±19.4pmol 4MU/min/μg蛋白。其中圖6中1-11為不同轉(zhuǎn)GluB-5-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株種子中GUS表達(dá)活性1為18.8pmol4MU/min/μg蛋白，2為16.5pmol 4MU/min/μg蛋白，3為12.4pmol 4MU/min/μg蛋白，4為75.5pmol 4MU/min/μg蛋白，5為19.5pmol 4MU/min/μg蛋白，6為34.0pmol 4MU/min/μg蛋白，7為17.8pmol 4MU/min/μg蛋白，8為10.7pmol4MU/min/μg蛋白，9為14.6pmol 4MU/min/μg蛋白，10為4.8pmol 4MU/min/μg蛋白，11為10.9pmol 4MU/min/μg蛋白。
序列表<160>1<210>1<211>2269<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>1gagaaaagaa gatttgctga ccccacattt ttccttctca cttatatgtg ggctccataa60cttttttttc tgactaggat gccacatcag cgtagccaga tatccatact gctataggac120ccaaattgca tggttttgta tagtttaggg ggtgaagatt tctagtattg gggattaggg180atgtcatgcg aacttgatgt aaagttgagg gacggctggt gaacttattc caaagaaggc240ctaggaggga gggaagagaa gaggacttcg atggcgggcc aaaagtgaaa gagagagctt300tgggcaggat tcgccccaaa aagatggaga tgattaattt tagttttatc attttaatta360accctgaaat tggttgttgt tgatttaaaa ttataggttg ctctgaaaat ttcagtaaaa420attgagggac caatttagag catggagaat ttaagaaaaa tacaccaagc cactttgaat480ttttggatgt attttagtat ttgaaattta tttgagactt ttattaattt ctattattcc540ttttagaaag tgacttttaa tttgggatgg atctatcagg tgtgacataa cgataagaga600gctccaaatt aatttcaaga cccaaattaa tctcgcgtta gatgttttct ttcaccttcg660agtagacaaa gagctctctc tgtgtgttcc atcttccttt ggttttggtt ctccctgagc720agacttgtgt ccgttcttct gtttttgcgc tgattcagtt gttcctcgat cctgaatact780tgcacgcatg agtatttggg ataagcatgc ctccggaacg ccatccacca ccagagtacc840tgcactggta gacatgcggt taagtttgta tcatttgttt caacatataa taagtaaagc900taaacatatg tacttctagc ttgttgatgt gtaacataag catggttata tacaagctag960tgatgttctc atcagtttgg atatttataa aaaacagcaa taatgcacac gctcacatat1020acacatacac ttacgtaata atataaatac acacacatac actcattaat acgaatgcac1080atgcgtatat actctaaccc atacggtcca atatatgcct tattacacat cactctctag1140
tctctacttg catggaagca cgctttatct accaaccagc ttgttcagta tgccaccata1200tatagattat ggcacacata tcctccataa atcatcattt tagtatatat ttgctttcta1260ttcttgtatg tcataatgtc attcatcaaa cttgtagctt gacaatgtac gtatatatag1320agggagagat atgagatatg atgaatcgaa tttgaagatg ctcggcatac ccggagcatg1380tctaggcaag ctgttgtccg gcctggacat ttctataatt actaaaactt gaaaaaaaaa1440tccaggaaga tattaggcat ttgtcatttt gccccctatg ttcaattttt gtgggttgtt1500agtttataaa aatatgcata gtttatcaag atgggactgt aatctccaag cttgggatga1560gcagcatata tattgtgatg gttgatagca tatggcttat ctcataattc atgacatcac1620aaactattgg gtaaaggcat tataataggt tatagcaaca aatataaaat tatgcttagc1680tgtgcaaaat tatctaattg atgactattt ctaaatacac atcatgggca aaaaggtgcg1740aaaagttagt ggcagagtac ataaatttga aaagaattat aagtagttcc gtactcgaca1800tataacaaaa ctaaaatatt cacacatttc atctccgtta ctttatgcgg tgtataacat1860gagtgtacaa gctagacaaa aatgacaaca aaaatacaac ttttttgttg taaaagaaaa1920acaaacttat cccatgcaga aactttatga cgcaggcaca aataaagcca agaaggaaaa1980acatctaaag tgtagggata gaaaatttct gaactaaaag aatatgcatt tttctacaaa2040acacaataaa agcctagtat acatatagat gtcttgttaa ccgactttgt gtatatatac2100tttttttttt gcacaactca atacacttta taggatgtct attgtttata ctccaagtaa2160ctttgtaact gccttacatt ccaagcggct ttttcttggc tataaaaggg acctcatgtc2220ttgggaaatc acatcagttg agtttccatt atcctttcaa taaatagcc2269
權(quán)利要求
1.一種植物胚乳特異性表達(dá)啟動子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70％或70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子的表達(dá)盒。
3.含有權(quán)利要求1所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
4.權(quán)利要求1所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因是在胚乳中特異性表達(dá)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述外源基因連接于所述植物胚乳特異性表達(dá)啟動子下游，通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到在胚乳中特異性表達(dá)所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述胚乳特異性表達(dá)啟動子下游還連接有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥；所述胚乳型雙子葉植物是蕎麥、油桐或蓖麻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物胚乳特異性表達(dá)啟動子及其應(yīng)用。該啟動子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70％或70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動子可以啟動外源基因在植物的胚乳中特異性的表達(dá)，適用于任何種子具有胚乳的植物，即單子葉植物或胚乳型雙子葉植物。
文檔編號C12N15/82GK101063135SQ20071009862
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月23日 公開號200710098625.發(fā)明者曲樂慶 申請人:中國科學(xué)院植物研究所 被以下專利引用 (5),