專利名稱：用于轉(zhuǎn)化酵母的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母轉(zhuǎn)化以及由此轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞和酵母細(xì)胞文庫(kù)領(lǐng)域，和由其產(chǎn)生 重組產(chǎn)物。更具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化酵母。
背景技術(shù)：
在體內(nèi)使用動(dòng)物免疫接種或在體外通過(guò)重組抗體展示技術(shù)產(chǎn)生的治療抗體已在 臨床中成功，并且同樣已驗(yàn)證這些技術(shù)為有效的藥物開發(fā)技術(shù)。盡管一般預(yù)期衍生自動(dòng)物 免疫接種的單克隆抗體具有足夠高的親和力以達(dá)到治療效果，但開發(fā)來(lái)自動(dòng)物免疫接種的 治療抗體需要非人抗體的人源化或利用表達(dá)人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)體外展示技術(shù)(噬 菌體、細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和核糖體展示)來(lái)自預(yù)先確立的抗體文庫(kù)的全人抗體的直 接選擇(Chao, G.等人(2006)Nat. Protoc. 1 :755-68 ；Gai, S. A.和 Wittrup，K. D. (2007) Curr. Opin. Struct. Biol. 17 :467-73 ；Griffiths, A. D.等人(1994)EMBO J. 13 :3245-60 ； He, Μ.禾口 Khan，F(xiàn). (2005)Expert Rev. Proteomics 2 :421-30 ；Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178 :1-37 ；Hoogenboom, H. R. (2005)Nat. Biotechnol. 23 :1105-16)提 供有價(jià)值的平行方法，并且可以在其中靶抗原無(wú)法在體內(nèi)引發(fā)生產(chǎn)性免疫應(yīng)答的情況下給 出最佳備選方案。人抗體文庫(kù)已經(jīng)工程改造以展示全長(zhǎng)抗體或各種抗體片段，例如Fab、scFv和 dAb。一般通過(guò)捕獲來(lái)自B細(xì)胞譜(repertoire)的抗體多樣性且將其轉(zhuǎn)移到文庫(kù)內(nèi)來(lái)構(gòu)建 文庫(kù)，伴隨或不伴隨合成多樣性的另外引入(Hoet, R.M.等人(2005)Nat. Biotechnol. 23 344- ，或通過(guò)使有限人抗體構(gòu)架中的⑶R殘基合成隨機(jī)化(Rothe，C.等人QO(^)J. Mol. Biol. 376 =1182-200)來(lái)構(gòu)建文庫(kù)。因?yàn)榭贵w重和輕鏈分開擴(kuò)增且重新組成文庫(kù)展示形 式，所以在這個(gè)過(guò)程期間形成VH和VL之間的新配對(duì)。盡管這種VH-VL改組允許生成新抗 原結(jié)合部位，但它還非常顯著地增加理論文庫(kù)多樣性。已開發(fā)幾種策略以工程改造更佳和 更生產(chǎn)性的抗體文庫(kù)，其通過(guò)減少理論文庫(kù)多樣性和有效取樣文庫(kù)所需的實(shí)際文庫(kù)大小來(lái) 實(shí)現(xiàn)。這些策略包括巧妙地設(shè)計(jì)由較少多樣性但潛在更多反應(yīng)性的B細(xì)胞譜產(chǎn)生的合成 或半合成文庫(kù)(Rothe, C.等人(2008) J. Mol. Biol. 376 :1182-200)和免疫(Hoet, R. M.等 人(2005)Nat. Biotechnol. 23，344-8)或假免疫(pseudoimmune) (Lee, H W.等人(2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 346 :896-903)文庫(kù)。盡管這些方法可能在使理論文庫(kù)多樣 性顯著減少幾個(gè)或甚至更多對(duì)數(shù)(log)方面有效，但關(guān)于大文庫(kù)尺寸和產(chǎn)生其的方法的需 要將一直補(bǔ)助文庫(kù)設(shè)計(jì)，以增加鑒定抗體命中的機(jī)會(huì)，而不管其缺乏。在真核系統(tǒng)例如酵母中用于產(chǎn)生核酸文庫(kù)和由此產(chǎn)生的重組產(chǎn)物例如藥物蛋白 質(zhì)的方法的可用性，提供了相對(duì)于原核系統(tǒng)例如大腸桿菌(E. coli)使用的顯著優(yōu)點(diǎn)。酵母 一般可以生長(zhǎng)至比細(xì)菌更高的細(xì)胞密度且容易適應(yīng)連續(xù)發(fā)酵過(guò)程。然而，由于關(guān)于將外來(lái)核酸穩(wěn)定引入酵母宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化條件和合適方法的知識(shí)的缺乏，酵母物種作為用于產(chǎn) 生重組產(chǎn)物和文庫(kù)的宿主/載體系統(tǒng)的開發(fā)被嚴(yán)重阻礙。在促進(jìn)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化的各種電和生物學(xué)參數(shù)中有DNA與細(xì)胞表面的吸附。低強(qiáng)度的 交變電場(chǎng)也促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)移到大腸桿菌細(xì)菌內(nèi)，大概是通過(guò)DNA通透酶的電刺激。已積累了 關(guān)于對(duì)聚電解質(zhì)DNA的電穿孔基因轉(zhuǎn)移的占優(yōu)勢(shì)電擴(kuò)散或電泳作用的證據(jù)。通過(guò)電穿孔促 進(jìn)的電滲作用和膜內(nèi)陷也已得到報(bào)告。電場(chǎng)經(jīng)過(guò)酵母細(xì)胞膜的應(yīng)用導(dǎo)致對(duì)電穿孔過(guò)程關(guān)鍵的瞬時(shí)孔的生成。電穿孔儀 (electroporator)信號(hào)發(fā)生器提供移動(dòng)經(jīng)過(guò)電極之間的間隙(以cm表示)的電壓(以kV 表示)。這種電勢(shì)差定義其中E等于kV/cm的所謂電場(chǎng)強(qiáng)度。每種細(xì)胞具有用于最佳電穿 孔的其自身臨界場(chǎng)強(qiáng)。這是由于細(xì)胞大小、膜構(gòu)成和細(xì)胞壁自身的個(gè)別特征。例如，哺乳動(dòng) 物細(xì)胞在細(xì)胞死亡和/或電穿孔發(fā)生前一般需要0. 5-5. OkV/cm。一般地，所需場(chǎng)強(qiáng)隨著細(xì) 胞的大小而相反改變。轉(zhuǎn)化方法1.通過(guò)電穿孔的轉(zhuǎn)化Becker 等人(Methods in Enzymology 194 182-187 (1991))公開了酵母啤酒糖 酵母(Saccharomyces cerevisiae) (S. cerevisiae)轉(zhuǎn)化的方法。Becker 還公開了原生質(zhì) 球轉(zhuǎn)化。Faber等人(Curr. Genet. 25 :305-310(1994))公開了用于轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)酵母多形 漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)的方法。Faber還將該方法應(yīng)用于甲醇畢赤氏酵母 (Pichia methanolica)。Helmuth 等人(Analytical Biochem. 293 :149-152(2001))公開了通過(guò)使 LiAc 和 DTT預(yù)處理相組合增加的酵母轉(zhuǎn)化效率。Kasutske 等人(Yeast 8:691-697(1992))公開了完整麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)細(xì)胞通過(guò)不同同源載體質(zhì)粒的電脈沖轉(zhuǎn)化。Meilhoc 等人(Bio/Technology 8:223-227(1990))公開了使用完整啤酒糖酵母 細(xì)胞和電場(chǎng)脈沖的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Neumann 等人(1996)Biophys. J. (1996)71 :868-877 公開了通過(guò)電穿孔和鈣介導(dǎo) 的DNA吸附的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)。Piredda 等人(Yeast 10 :1601-1612(1994))公開了用于酵母 Yamadazyma (Pichia)ohmeri的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Scorer 等人(Bio/Technology 12 :181-184(1994))公開了使用電穿孔和原生質(zhì) 球轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，允許用于在巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)的罕見高拷貝數(shù)轉(zhuǎn) 化體的快速G418選擇的巴斯德畢赤氏酵母載體。Sherman 等人(Laboratory Course Manual for Methods in YeastGenetics,第 91102 頁(yè)，Cold Spring Harbor Laboratory (1986))公開了酵母突變體 LEU2 和 HIS3 的轉(zhuǎn) 化。Suga 和 Hatakeyama (Curr. Genet. 43 :206-211(2003))公開了在電穿孔前伴隨鈣 的添加產(chǎn)生感受態(tài)細(xì)胞的冷凍法。Thompson等人(Yeast 14 :565-571(1998))公開了用于通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞例如啤酒糖酵母和白色假絲酵母(Candida albicans)的制備。Yang 等 人(Applied and Environmental Microbiology 60(12) 4245-4254(1994))公開了基于其URA3基因和同源自主復(fù)制序列ARS2的具柄畢赤氏酵母 (Pichia stipitis)的電穿孔。授予Raymond的美國(guó)專利號(hào)5，716，808公開了使用電穿孔用于制備包含外來(lái)DNA 構(gòu)建體的甲醇畢赤氏酵母細(xì)胞的方法，和用于在甲醇畢赤氏酵母細(xì)胞中產(chǎn)生外來(lái)肽的方法。授予Abbas的美國(guó)專利號(hào)7，009, 045公開了通過(guò)電穿孔和通過(guò)原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化的產(chǎn) 黃素(flavinogenic)酵母——季也蒙畢赤氏酵母(Pichiaguilliermondii)和無(wú)名假絲酵 母(Candida famata)2.通過(guò)原生質(zhì)球形成的轉(zhuǎn)化Becker 等人(Methods in Enzymology 194 182-187 (1991))公開了酵母啤酒糖 酵母轉(zhuǎn)化以及原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化的方法。Scorer 等人(Bio/Technology 12 :181-184(1994))公開了使用電穿孔和原生質(zhì) 球轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，允許用于在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)的罕見高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化體的G418選擇的 巴斯德畢赤氏酵母載體。授予Mroman等人的美國(guó)專利號(hào)4，808，537公開了使用原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化，用于分離 且克隆來(lái)自巴斯德畢赤氏酵母的甲醇誘導(dǎo)型基因和對(duì)于異源基因的甲醇調(diào)節(jié)表達(dá)有用的 調(diào)節(jié)區(qū)的方法。授予Cregg等人的美國(guó)專利號(hào)4，837，148公開了能夠在畢赤氏酵母屬的宿主菌株 中維持質(zhì)粒為染色體外元件的自主復(fù)制序列。該專利進(jìn)一步公開了包括DNA序列的構(gòu)建體 以及通過(guò)原生質(zhì)球形成產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物，并且提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的DNA序列和構(gòu)建體 的方法，以及用于分離來(lái)自任何來(lái)源的序列的方法。授予Mroman等人的美國(guó)專利號(hào)4，855，231公開了響應(yīng)甲醇、分解代謝物非阻遏 碳源和碳源饑餓的存在的DNA序列?！?231專利證實(shí)巴斯德畢赤氏酵母的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化。授予Mroman等人的美國(guó)專利號(hào)4，879，231公開了用于酵母例如巴斯德畢赤氏酵 母的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化方法。授予Cregg等人的美國(guó)專利號(hào)4，882，279公開了用于畢赤氏酵母屬酵母例如巴斯 德畢赤氏酵母的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化技術(shù)。授予Cregg的美國(guó)專利號(hào)5，135，868涉及用于畢赤氏酵母屬酵母的位點(diǎn)特異性基 因組修飾的方法。‘868專利使用原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化方法。授予Bucldiolz的美國(guó)專利號(hào)5，268, 273涉及巴斯德畢赤氏酵母的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化 的方法。授予Raymond的美國(guó)專利號(hào)5，736，383涉及畢赤氏酵母屬的酵母菌株特別是甲醇 畢氏赤酵母的轉(zhuǎn)化方法。‘383專利進(jìn)一步涉及畢赤氏酵母屬酵母的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化方法以 及通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化的方法。3.其他轉(zhuǎn)化系統(tǒng)Kunze 等人(Current Genetics 9(3) :205-209(1985))公開了 用質(zhì)粒 pYe(ARG4)411轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母、麥芽糖假絲酵母和季也蒙畢赤氏酵母G266的方法，所述質(zhì)粒ph(ARG4)411包含插入pBR322內(nèi)的啤酒糖酵母ARG4基因。Kunze在轉(zhuǎn)化方法中使用 CaCl2 οKunze 等人(J.Basic Microbiol. 25(2) :141-144(1985))公開了使用 CaCl2 轉(zhuǎn)化 工業(yè)上重要的酵母麥芽糖假絲酵母和季也蒙畢赤氏酵母G266的方法。Kunze等人(Acta Biotechnol. 6 (1) :28(1986))公開了工業(yè)上重要的酵母麥芽糖 假絲酵母和季也蒙畢赤氏酵母的轉(zhuǎn)化。Neistat 等人(Mol. Ge. Mikrobiol. Virusol. 12 19-23 (1986))(僅摘要)公開了 多形漢遜氏酵母、季也蒙畢赤氏酵母、土星形擬威爾氏酵母(Williopsis saturnus)通過(guò)攜 帶啤酒糖酵母ADE2基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。未公開轉(zhuǎn)化方法。授予Cregg等人的美國(guó)專利號(hào)4，929，555公開了用于制備對(duì)于通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化為感 受態(tài)的畢赤氏酵母屬的甲基營(yíng)養(yǎng)物種的全細(xì)胞的方法，和關(guān)于用DNA轉(zhuǎn)化此類物種特別是 巴斯德畢赤氏酵母的全細(xì)胞的方法。授予Heefner等人的美國(guó)專利號(hào)5，231，007公開了產(chǎn)生且分離無(wú)名假絲酵母的高 產(chǎn)黃素(flavinogenic)菌株的方法，所述菌株產(chǎn)生約7. 0-7. 5克/升/6天的核黃素得率。 該方法包括對(duì)于親本株和后代株執(zhí)行的反復(fù)誘變處理步驟和原生質(zhì)體融合步驟的組合，所 述后代株在每個(gè)步驟后根據(jù)篩選規(guī)程進(jìn)行選擇。4.載體、ARS元件和基因文庫(kù)Clyne, R. K.等人(ΕΜΒ0 J. 14(24) :6348-6357(1995))涉及 ARSl-裂殖酵母粟
酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的ARS元件的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析。一系列嵌套缺 失突變的表征指出包括ARSl的DNA的最低限度片段是大的，這是因?yàn)樵?50bp下的片段不 保留顯著ARS活性。Liauta-Teglivets, 0.等人(Yeast 11(10) :945-952(1995))公開了來(lái)自季也蒙 畢赤氏酵母基因組文庫(kù)的與核黃素生物合成有關(guān)的GTP-環(huán)化水解酶的結(jié)構(gòu)基因的克隆。Cannon, R. D.等人(Mol. Gen. Genet. 221 O) :210-218(1990))公開了在白色假絲 酵母和啤酒糖酵母中起作用的自主復(fù)制序列(ARS)元件的分離和核苷酸序列。Takagi，M.等人(J. Bacteriol. 167(2) :551-555(1986))公開了通過(guò)使用從其基 因組中分離的ARS位點(diǎn)在麥芽糖假絲酵母中構(gòu)建宿主-載體系統(tǒng)。Pla, J.等人(Gene 165(1) :115-120(1995))涉及具有自主復(fù)制活性的ARS2和 ARS3白色假絲酵母DNA片段，其顯示促進(jìn)白色假絲酵母和啤酒糖酵母的非整合性遺傳轉(zhuǎn) 化。授予Rmrnier等人的美國(guó)專利號(hào)5，212，087公開了在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中有效的ARS序列以及攜帶這些序列的質(zhì)粒。授予Hagenson等人的美國(guó)專利號(hào)5，665，600公開了包含ARS序列的巴斯德畢赤 氏酵母線性質(zhì)粒及其DNA片段?！?00專利使用如Cregg等人在美國(guó)專利號(hào)4，929，555中 描述的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。授予Cregg等人的美國(guó)專利號(hào)4，837，148公開了能夠在畢赤氏酵母屬的宿主菌株 中維持質(zhì)粒為染色體外元件的自主復(fù)制序列?！?148專利進(jìn)一步涉及包括DNA序列的構(gòu)建體 以及由其轉(zhuǎn)化的生物。該專利另外提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的DNA序列和構(gòu)建體的方法，以 及用于分離來(lái)自任何來(lái)源的序列的方法。
Chao 等人(Nature Protocols, 1 (2) :755-768(2006))公開了通過(guò)電穿孔用于轉(zhuǎn) 化酵母細(xì)胞并且用5 μ g插入片段和1 μ g載體DNA達(dá)到最大限度5X IO7文庫(kù)大小的規(guī)程。上述方法和公開內(nèi)容雖然達(dá)到逐漸更高的轉(zhuǎn)化效率，但仍是費(fèi)力的且花費(fèi)大量時(shí) 間和重復(fù)努力，以使在IO6-IO7大小范圍內(nèi)的多重小文庫(kù)積累至在IO8-IO9大小范圍內(nèi)的更 大和組合的文庫(kù)大小。酵母文庫(kù)仍未達(dá)到已通過(guò)噬菌體文庫(kù)達(dá)到的大小或效率。如由Hoogenboom 在2005年(Nature Biotech. ,23(9) :1105-1116)綜述的，一般最大限度的噬菌體文庫(kù) 大小是IOici-IO11,而一般酵母文庫(kù)大小是107(顯著小于通過(guò)其他展示技術(shù)達(dá)到的那些 (Hoogenboom, H. R. (2002)Methods Mol. Biol. 178 1-37 ；Hoogenboom, H. R. (2005)Nat. Biotechnol. 23 :1105-16),盡管先前已報(bào)告了在IO9范圍內(nèi)的文庫(kù)大小(Hoet, R. M.等人 (2005)Nat. Biotechnol. 23 :344-8 ；Lipovsek, D.等人(2007)J. Mol. Biol. 368 :1024-41 ； Segal,L.等人 Q007)Bioinformatics 23 :i440_9。Feldhaus 等人(Nature Biotech. ,21 163-170 (2003))已顯示通過(guò)辛苦地重復(fù)轉(zhuǎn)化且隨后使轉(zhuǎn)化文庫(kù)組合可以構(gòu)建1. 5 X IO9文 庫(kù)。盡管電穿孔規(guī)程中的近期進(jìn)展(參見Chao,Nature Protocols 1 (2) :755-768(2006)) 已使得能夠在單次轉(zhuǎn)化中達(dá)到最大限度5 X IO7酵母文庫(kù)大小，但我們已發(fā)現(xiàn)Chao規(guī)程一 般以明顯更低的轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化酵母。迄今為止達(dá)到的酵母文庫(kù)大小仍顯著低于IOici-IO11大 小的通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)常規(guī)可達(dá)到的那種，仍是正確的陳述。使用磁珠和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)的酵母展示文庫(kù)選擇提供使針對(duì)靶抗原的特異 性粘合劑富集的有效和靈敏方法，特別是通過(guò)其與熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)的相容性。 然而，由于酵母細(xì)胞的低轉(zhuǎn)化效率，這種選擇能力的優(yōu)點(diǎn)被一般酵母展示文庫(kù)的有限大小 阻礙。如果酵母展示選擇技術(shù)可以與類似于對(duì)于噬菌體展示制備的那些的大型抗體文庫(kù) (大小約101°)偶聯(lián)，那么酵母展示技術(shù)將提供非常有效的抗體發(fā)現(xiàn)工具。因此，存在關(guān)于使用酵母產(chǎn)生蛋白質(zhì)文庫(kù)例如抗體文庫(kù)的有效方法的需要。發(fā)明_既述本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的高度有效和快速的方法，例如用于產(chǎn)生大小最高達(dá) 2X 101°的酵母細(xì)胞文庫(kù)。本發(fā)明的方法使得可能達(dá)到在噬菌體文庫(kù)規(guī)模上的得率。本發(fā) 明的方法消除了在應(yīng)用酵母展示技術(shù)作為實(shí)際工具中的顯著瓶頸，以接近先前未研究的大 得多的抗體多樣性空間，并且文庫(kù)大小目前僅受可以在實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)的酵母培養(yǎng)物大小限 制。測(cè)試或滴定包括使用CaCl2、MgCl2、蔗糖、山梨糖醇、乙酸鋰、二硫蘇糖醇、電穿孔電 壓、DNA輸入和細(xì)胞體積的多重組分和條件，以鑒定最佳組合。通過(guò)應(yīng)用這種新開發(fā)的規(guī)程， 基本上在1天內(nèi)由人脾RNA構(gòu)建2 X 101°抗體文庫(kù)，伴隨1-1. 5 X IO8轉(zhuǎn)化體/微克載體DNA 的一般轉(zhuǎn)化效率。序列分析證實(shí)在這種非免疫人脾抗體文庫(kù)內(nèi)的抗體種系序列的多樣性表 示。通過(guò)執(zhí)行試驗(yàn)性文庫(kù)選擇，我們已鑒定了針對(duì)TNF-a和IL-18具有低納摩爾親和力的 人抗體，從而證實(shí)了這種文庫(kù)的生產(chǎn)力。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)酵母細(xì)胞的電穿孔制備酵母文庫(kù)的方法，該方法 包括步驟(a)提供包括核酸載體、酵母細(xì)胞、山梨糖醇和CaCl2的懸浮液；和(b)在0. 5kV/ cm-超過(guò)12. 5kV/cm下，用約10-約50 μ F的電容使懸浮液電穿孔。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了關(guān)于用DNA轉(zhuǎn)化酵母以制備文庫(kù)的方法，該方法包括步驟(a)使酵母細(xì)胞培養(yǎng)至約1. 0-約2的0D_ ； (b)在一定體積冷水中洗滌酵母細(xì)胞；(c)在一定體積冷IM山梨糖 醇/ImM CaCl2中洗滌酵母細(xì)胞；(d)在一定體積30°C 0. IM LiAc/lOmM DTT中溫育酵母細(xì) 胞；(e)在第二個(gè)體積的冷IM山梨糖醇/ImM CaCl2中洗滌酵母細(xì)胞；(f)使酵母細(xì)胞重懸 浮于第三個(gè)體積的冷IM山梨糖醇/ImM CaCl2中，以形成酵母細(xì)胞電穿孔懸浮液；(g)將一 定體積的電穿孔細(xì)胞懸浮液加入載體DNA和插入片段DNA中，以形成酵母細(xì)胞-DNA電穿孔 懸浮液；和(h)在約2. 5kV/cm-約12. 5kV/cm的電壓下在0. 2cm間隙杯中，使酵母細(xì)胞-DNA 電穿孔懸浮液電穿孔。載體DNA與插入片段DNA的比在約1 0. 5_約1 10的范圍內(nèi)，例如1 0.5、 1 1、1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9 或 1 10。在一個(gè)實(shí)施方 案中，在反應(yīng)中使用約Iyg載體DNA和約Iyg插入片段DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使約 1 μ g載體DNA和約2 μ g插入片段DNA沉淀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使約1 μ g載體DNA和 約3 μ g插入片段DNA沉淀。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使約1 μ g載體DNA和約4 μ g插入片 段DNA沉淀。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使約1 μ g載體DNA和約5 μ g插入片段DNA沉淀。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液包括約50-約400 μ 1酵母細(xì)胞，例如約50、100、 150、200、250、300、350、400μ 1 酵母細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞懸浮液是約1-約10 X IO9酵母細(xì)胞/mL，例如，約1、 約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約IOX IO9酵母細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于使酵母細(xì)胞電穿孔的場(chǎng)強(qiáng)是約0. 5kV/cm-約12. 5kV/cm, 例如，約 0. 5、約 1. 0、約 2. 0、約 2. 5、約 3. 0、約 3. 5、約 4. 0、約 4. 5、約 5. 0、約 5. 5、約 6. 0、 約 6. 5、約 7. 0、約 7. 5、約 8. 0、約 8. 5、約 9. 0、約 9. 5、約 10. 0、約 10. 5、約 11. 0、約 11. 5、約 12. 0、約 12. 5、約 13. 0、約 13. 5、約 14. 0、約 14. 5 或約 15. OkV/cm。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞在約10-約50 μ F的電容下進(jìn)行電穿孔，例如約10、 約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50。在一個(gè)實(shí)施方案中，使酵母細(xì)胞懸浮于約0. 1-約IOM山梨糖醇和約0. 1-約IOmM CaCl2 或1%(12 中，例如約 0. 1、約 0. 25、約 0. 5、約 0. 75、約 1. 0、約 2. 0、約 3. 0、約 4. 0、約 5. 0、約6. 0、約7. 0、約8. 0、約9. 0或約10. OM山梨糖醇，或例如約0. 1、約0. 25、約0. 5、約
0.75、約 1. 0、約 2. 0、約 3. 0、約 4. 0、約 5. 0、約 6. 0、約 7. 0、約 8. 0、約 9. 0 或約 10. OmM CaCl2 或 MgCl2。在一個(gè)實(shí)施方案中，使酵母細(xì)胞在約0.01-約1.0Μ LiAc和/或約1_約IOOmM DTT 中溫育，例如約 0. 01、約 0. 02、約 0. 03、約 0. 04、約 0. 05、約 0. 06、約 0. 07、約 0. 08、約 0. 09、 約 0. 1、約 0. 2、約 0. 3、約 0. 4、約 0. 5、約 0. 6、約 0. 7、約 0. 8、約 0. 9 或約 1. OM LiAc，例如約
1、約10、約 20、約 30、約 40、約 50、約 60、約 70、約 80、約 90 或約 IOOmM DTT。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了關(guān)于用DNA轉(zhuǎn)化酵母以制備文庫(kù)的方法，該方 法包括2個(gè)或更多個(gè)步驟(a)使酵母細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜至約1. 0-約2. 0的OD6tltl ； (b)在水中 洗滌酵母細(xì)胞；(c)在包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中洗滌酵母細(xì)胞；(d)使酵母細(xì)胞在包 括LiAc和DTT的溶液中溫育；(e)在包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中洗滌酵母細(xì)胞；(f)使 酵母細(xì)胞重懸浮于一定體積的包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中，以形成酵母細(xì)胞電穿孔懸 浮液；(g)將一定體積的電穿孔細(xì)胞懸浮液加入載體DNA和插入片段DNA中，以形成酵母細(xì) 胞-DNA電穿孔懸浮液；和(h)在約2. 5kV/cm-約12. 5kV/cm的電壓下在0. 2cm間隙杯中，使酵母細(xì)胞-DNA電穿孔懸浮液電穿孔。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了關(guān)于用DNA轉(zhuǎn)化酵母的方法，該方法包 括2個(gè)或更多個(gè)步驟(a)通過(guò)使DNA沉淀為粒狀沉淀隨后重懸浮于最低限度體積中，使 約1 0.5-約1 10比的載體和插入片段DNA體積降到最低；(b)通過(guò)下述使酵母細(xì)胞 從菌落培養(yǎng)至合適生長(zhǎng)狀態(tài)(i)用來(lái)自生長(zhǎng)板的酵母菌落或生長(zhǎng)中的酵母培養(yǎng)物的部分 接種第一個(gè)體積的培養(yǎng)基；(ii)使酵母細(xì)胞在30°C下過(guò)夜生長(zhǎng)；(iii)用來(lái)自步驟(ii)的 細(xì)胞接種第二個(gè)體積的培養(yǎng)基，并且使細(xì)胞在30°C下生長(zhǎng)直至它們達(dá)到約1. 3-約1. 6的 OD600 ； (c)通過(guò)離心使細(xì)胞形成粒狀沉淀；(d)用冷水洗滌酵母細(xì)胞；(e)用冷IM山梨糖醇 /ImMCaCl2洗滌酵母細(xì)胞；(f)使酵母細(xì)胞重懸浮于0. IM LiAc/lOmM DTT中；(g)使酵母細(xì) 胞在30°C下在250rpm下溫育30分鐘；(h)用IM山梨糖醇/ImM CaCl2洗滌酵母細(xì)胞；⑴ 使酵母細(xì)胞重懸浮于IM山梨糖醇/ImM CaCl2中，以形成酵母細(xì)胞電穿孔懸浮液；(j)將酵 母細(xì)胞電穿孔懸浮液的部分加入DNA粒狀沉淀中，以形成酵母細(xì)胞-DNA電穿孔懸浮液；(k) 在約0. 5kV-約2. 5kV和25uF電容的范圍內(nèi)，使酵母細(xì)胞-DNA電穿孔懸浮液電穿孔；(1)將 IM山梨糖醇/YPD(終濃度0. 5M山梨糖醇，0. 5x YPD)的1 1混合物加入電穿孔的酵母 細(xì)胞-DNA電穿孔懸浮液中，并且在30°C下溫育1小時(shí)；和(m)使酵母細(xì)胞形成粒狀沉淀， 并且重懸浮于IOml IM山梨糖醇中。附圖簡(jiǎn)述當(dāng)連同附圖一起閱讀時(shí)，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的下述描述，將更充分地理解本發(fā)明 的前述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，以及本發(fā)明自身，其中

圖1顯示表1中的數(shù)據(jù)的圖解表示，其代表隨載體插入片段和2.5kV/ cm-12. 5kV/cm電壓而變的菌落計(jì)數(shù)。圖2顯示表3中的數(shù)據(jù)的圖解表示，其代表隨載體插入片段和2.5kV/ cm-12. 5kV/cm電壓而變的菌落計(jì)數(shù)。圖3證實(shí)電穿孔效率通過(guò)增加體積/杯得到顯著改善。圖4證實(shí)增加的DNA輸入和高電壓而不是載體與插入片段比對(duì)于最大限度轉(zhuǎn)化效 率是關(guān)鍵的。發(fā)明詳述通過(guò)測(cè)試且組合幾種先前鑒定的條件確立了用于啤酒糖酵母的高度有效的電穿 孔規(guī)程(Chao，G.等人 Q006) Nat. Protoc. 1 :755-68 ；Becker, D. Μ.和 Guarente，L. (1991) Methods Enzymo1. 194 :182-7 ；Helmuth, M.等人(2001)Anal. Biochem. 293 :149-52 ； Neumann, E.等)κ (1996) Biophys. J. 71 :868-77 ；Simon, J. R. (1993)Methods Enzymo 1. 217 478-83 ；Suga, Μ.禾口 Hatakeyama，Τ. (2003)Curr. Genet. 43 :206-11 ；Thompson，J. R.等 人(1998Heast 14:565-71。這些包括乙酸鋰(LiAc)和二硫蘇糖醇(DTT)作為細(xì) 胞調(diào)節(jié)劑的組合，這兩者都已用于增強(qiáng)酵母轉(zhuǎn)化頻率(Helmuth，Μ.等人O001)Anal. Biochem. 293 :149-52 ；Thompson，J. R.等人(1998) Yeast 14 :565-71 ；Gietz, R. D.等人 (1995) Yeast 11 :355-60)，以及山梨糖醇和氯化鈣(Becker, D. Μ.和 Guarente，L. (1991) MethodsEnzymol. 194 182-7 ；Helmuth, Μ·等人(2001)Anal. Biochem. 293 :149-52 ； Neumann, Ε.等人(1996)Biophys. J. 71 :868-77)在電穿孔緩沖液中的包括。定義
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指包括自主復(fù)制位點(diǎn)(ARS)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼待在宿主生 物中表達(dá)的蛋白質(zhì)的至少一種結(jié)構(gòu)基因的DNA構(gòu)建體。復(fù)制位點(diǎn)或復(fù)制起點(diǎn)是控制克隆和 表達(dá)載體的復(fù)制的任何DNA序列。表達(dá)載體通常還包含合適的控制區(qū)，例如一種或多種增 強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子、阻抑基因和/或沉默基因、和控制蛋白質(zhì)在宿主酵母中的表達(dá)的終止 子。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含包括如本文描述的必需基因的選擇標(biāo)記。表達(dá)載體 還任選包含對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員可廣泛獲得和眾所周知的其他選擇標(biāo)記。表達(dá)載體是一種 類型的載體。載體可以任選包括來(lái)自一種或多種酵母菌株的一種或多種ARS序列(元件)。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指DNA區(qū)段這樣安排，從而使得它們對(duì)于其預(yù)期目的協(xié)同 作用，例如轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中起始且進(jìn)行通過(guò)編碼區(qū)段到終止子。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”意指改變基因型的DNA或其他核酸引入接受者酵母宿主細(xì)胞內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”意指已經(jīng)歷轉(zhuǎn)化的接受者酵母宿主細(xì)胞及其后代。在本發(fā)明的電穿孔方法中有用的載體包括PYD載體任何其他載體及其衍生構(gòu)建 體，其可以通過(guò)酵母細(xì)胞繁殖，或一般而言的核酸。本發(fā)明的表達(dá)載體可以基于任何類型的 載體，只要載體可以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主酵母細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體基于酵 母質(zhì)粒，尤其是來(lái)自啤酒糖酵母的一種。在酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，編碼文庫(kù)序列的外源DNA由細(xì) 胞吸收且隨后由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)。更優(yōu)選地，表達(dá)載體可以是酵母-細(xì)菌穿梭載體，其可以在大腸桿菌或酵母中繁 殖(Struhl，等人(1979)Proc. Natl. Acad. ki. 76 :1035-1039)。大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 序列例 如pBR322的包括促進(jìn)載體DNA在大腸桿菌中的定量制備，并且因此促進(jìn)酵母的有效轉(zhuǎn)化?？梢猿洚?dāng)穿梭體(shuttle)的酵母質(zhì)粒載體類型可以是復(fù)制型載體或整合型載 體。復(fù)制型載體是不依賴于酵母的染色體DNA，依靠DNA復(fù)制的功能起點(diǎn)的存在能夠介導(dǎo)其 自身維持的酵母載體。整合型載體依賴于與染色體DNA的重組，以促進(jìn)復(fù)制且因此促進(jìn)重 組DNA在宿主細(xì)胞中的連續(xù)維持。復(fù)制型載體可以是基于2ym(micron)的質(zhì)粒載體，其中 DNA復(fù)制起點(diǎn)衍生自內(nèi)源2 μ m質(zhì)粒酵母?？商娲?，復(fù)制型載體可以是自主復(fù)制(ARS)載 體，其中“表觀”復(fù)制起點(diǎn)衍生自酵母染色體DNA。任選地，復(fù)制型載體可以是著絲粒(CEN) 質(zhì)粒，除上述DNA復(fù)制起點(diǎn)之一外，所述著絲粒(CEN)質(zhì)粒還攜帶已知具有著絲粒的酵母染 色體DNA序列。載體可以以閉環(huán)形式或線性形式轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)整合型載體的酵母轉(zhuǎn) 化，盡管具有可遺傳的穩(wěn)定性，但當(dāng)載體為閉環(huán)形式時(shí)可能不是有效的(例如，僅得到約 1-10個(gè)轉(zhuǎn)化體/yg DNA) 0游離端位于與酵母染色體DNA同源的DNA序列中的線性化載體 以更高效率(100-1000倍)轉(zhuǎn)化酵母，并且一般發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化DNA整合到與切割位點(diǎn)同源的序 列內(nèi)。因此，通過(guò)用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割載體DNA，可能增加轉(zhuǎn)化效率且靶向染色 體整合位點(diǎn)。整合性轉(zhuǎn)化可以應(yīng)用于釀造酵母的遺傳修飾，前提是轉(zhuǎn)化效率足夠高，并且用 于整合的靶DNA序列在不破壞對(duì)于宿主細(xì)胞代謝必需的基因的區(qū)域內(nèi)。具有高拷貝數(shù)(約20-50個(gè)拷貝/細(xì)胞)的ARS質(zhì)粒趨于是最不穩(wěn)定的，并且以 超過(guò)10% /代的頻率喪失。然而，ARS質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過(guò)著絲粒的附著得到增強(qiáng)；著絲 粒質(zhì)粒以1或2個(gè)拷貝/細(xì)胞存在，并且以僅大約1 % /代喪失。關(guān)于使用本發(fā)明的電穿孔 方法通過(guò)酵母宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的非限制性例子包括任何目的基因，包括抗體和抗體 片段、激素、細(xì)胞因子和淋巴因子、受體、粘附分子和酶。
可以通過(guò)本發(fā)明的電穿孔方法轉(zhuǎn)化的酵母菌株包括糖酵母屬中的酵母物種例如 啤酒糖酵母，和裂殖糖酵母屬中的酵母物種例如粟酒裂殖糖酵母。在一個(gè)實(shí)施方案中，酵母 細(xì)胞是二倍體酵母細(xì)胞?？商娲?，酵母細(xì)胞是單倍體細(xì)胞例如酵母單倍體細(xì)胞的“a”和 “ α ”菌株。本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的方法，其包括使包含酵母連同一種或多種核酸 構(gòu)建體的細(xì)胞懸浮液電穿孔。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致從酵母細(xì)胞單個(gè)克隆到群體(即， 一種或多種酵母文庫(kù))的任何地方，其可以用于篩選(a)借助于與酵母表面蛋白質(zhì)栓系或 經(jīng)由與酵母細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或其他組分的特異性共價(jià)鍵或非共價(jià)相互作用結(jié)合，在酵母細(xì) 胞表面上展示的一種或多種肽或一種或多種蛋白質(zhì)；(b)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種或多種肽或一 種或多種蛋白質(zhì)；或(c)分泌到細(xì)胞外間隙例如培養(yǎng)基內(nèi)或沉積到固體表面上的一種或多 種肽或一種或多種蛋白質(zhì)。此種酵母文庫(kù)可以方便地順應(yīng)多重應(yīng)用，以篩選或表征一種或 多種肽或一種或多種蛋白質(zhì)與可以引入酵母細(xì)胞內(nèi)或外源添加的另一種蛋白質(zhì)、肽、DNA、 RNA或其他化學(xué)物質(zhì)之間的相互作用。具體例子是在酵母展示、酵母雙雜交、酵母三雜交等 中發(fā)現(xiàn)的那些。本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的方法，其包括使包含酵母連同一種或多種核酸 構(gòu)建體的細(xì)胞懸浮液電穿孔，所述核酸構(gòu)建體包括一種或多種調(diào)節(jié)序列和一種或多種基因 或基因區(qū)段，使用足以轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的一種或多種電阻、場(chǎng)強(qiáng)和脈沖持續(xù)時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，場(chǎng)強(qiáng)是約2. 5kV/cm-約12. 5kV/cm。在特定實(shí)施方案中，場(chǎng)強(qiáng) 是約0. 5kV/cm、約1. OkV/cm、約1. 5kV/cm、約2. OkV/cm或約2. 5kV/cm。這些值考慮電穿孔 杯具有0. 2cm的間隙。更高場(chǎng)強(qiáng)是可能的，但它們的實(shí)用性在很大程度上依賴于可以遞送 更強(qiáng)脈沖的裝置的開發(fā)。在一個(gè)實(shí)施方案中，脈沖持續(xù)時(shí)間是約3毫秒-約10毫秒。在具體實(shí)施方案中， 脈沖持續(xù)時(shí)間是約4. 8毫秒。通過(guò)本發(fā)明的電穿孔方法的細(xì)胞處理通過(guò)將電場(chǎng)應(yīng)用于在一對(duì)電極之間的酵母 細(xì)胞懸浮液來(lái)執(zhí)行。場(chǎng)強(qiáng)必須適當(dāng)?shù)鼐_調(diào)整，從而使得細(xì)胞的電穿孔對(duì)細(xì)胞無(wú)損害或以 最低限度損害而發(fā)生。隨后可以測(cè)量電極之間的距離，并且隨后可以根據(jù)式E = V/d將合 適電壓應(yīng)用于電極(E =以V/cm表示的電場(chǎng)強(qiáng)度；V =以伏特表示的電壓；和d =以cm表 示的距離)。用于執(zhí)行本文描述的程序的脈沖發(fā)生器是且已可在市場(chǎng)上多年可獲得。一種合適 的信號(hào)發(fā)生器是 Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA) 一般的設(shè) 置由與電容expender plus和脈沖控制器plus模塊連接的Gene Pulser II組成。商購(gòu)可得的另外電穿孔型號(hào)包括Gene Pulser MXcell系統(tǒng)或GenePulser X細(xì)胞 真核系統(tǒng)(Bio-Rad) > CelljecT Pro Electroporator (ThermoScientific) > Multiporator
Electroporation Systems 禾口其他Eppendorf Electroporation Systems (Eppendorf, North America)、ECM 電穿孔發(fā)生器和BTX HT 96 Well Electroporation System(BTX, Harvard裝置)，所有這些都是使用本文公開的條件用于使酵母細(xì)胞電穿孔的合適裝置。電穿孔在本發(fā)明內(nèi)用于促進(jìn)DNA引入酵母細(xì)胞內(nèi)。電穿孔是使用脈沖電場(chǎng)以使細(xì)
胞膜瞬時(shí)透化的過(guò)程，從而允許大分子例如DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。然而，通過(guò)其使DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)
胞內(nèi)的實(shí)際機(jī)制未充分了解。對(duì)于無(wú)名假絲酵母的轉(zhuǎn)化，例如，當(dāng)使細(xì)胞暴露于在實(shí)驗(yàn)上衰減脈沖的電場(chǎng)時(shí)，電穿孔令人驚訝地有效，所述電場(chǎng)具有約10-約13kV/cm的場(chǎng)強(qiáng)和約 R5(U9歐姆)的電阻值、和約45ms的時(shí)間常數(shù)。一般地，電阻和電容存在或可以由用戶選 擇，這依賴于所選擇的電穿孔設(shè)備。在任何情況下，依照制造商的說(shuō)明書配置設(shè)備，以提供 合適的場(chǎng)強(qiáng)和衰減參數(shù)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及高度有效的酵母轉(zhuǎn)化方法，其允許任何一種或多種所需內(nèi)源 (即在那種酵母細(xì)胞內(nèi)天然存在的)或異源基因的高水平表達(dá)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步涉及 用于制備例如表達(dá)抗體或其嵌合體或片段的文庫(kù)的方法。在一種情況下，攜帶目的基因的表達(dá)載體可以通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到酵母宿主細(xì)胞 內(nèi)，以產(chǎn)生包括許多轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的單個(gè)克隆或文庫(kù)，所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) (例如，核或細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì))、膜蛋白質(zhì)(例如，跨膜蛋白質(zhì)或膜附著蛋白質(zhì))或分泌的蛋白 質(zhì)。人們將能夠使用轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或文庫(kù)純化蛋白質(zhì)、研究蛋白質(zhì)功能、鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用、或鑒定新蛋白質(zhì)粘合劑或相互作用配偶體。必須指出的是產(chǎn)生展示或表達(dá)抗體 和抗體片段的非常大型酵母文庫(kù)的能力?？梢詫?duì)文庫(kù)實(shí)施通過(guò)靶抗原的選擇，以鑒定與選 擇抗原結(jié)合的抗體。因?yàn)檗D(zhuǎn)化的酵母具有喪失人工構(gòu)建的質(zhì)粒的趨勢(shì)，所以使用培養(yǎng)基以便對(duì)其施加 正選擇壓力是有利的。當(dāng)菌株是關(guān)于必需代謝物的營(yíng)養(yǎng)突變體時(shí)，并且當(dāng)所使用的載體質(zhì) 粒包括能夠恢復(fù)菌株原養(yǎng)型的標(biāo)記基因，例如上文提及的LEU2基因時(shí)，可以通過(guò)從培養(yǎng)基 中省略代謝物施加這種選擇壓力。存在獲得相同結(jié)果的其他方法并且其也可以用于實(shí)踐本 發(fā)明。依賴于目的結(jié)構(gòu)基因的性質(zhì)，產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物可以保留在酵母宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 中或被分泌。已發(fā)現(xiàn)不僅保留在細(xì)胞中的蛋白質(zhì)而且分泌的蛋白質(zhì)都是可溶的。當(dāng)產(chǎn)物或 表達(dá)產(chǎn)物保留在酵母宿主細(xì)胞中時(shí)，一般可能希望具有誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，從而使得直到 轉(zhuǎn)化體已達(dá)到高密度，存在所需產(chǎn)物的很少表達(dá)或產(chǎn)生或無(wú)表達(dá)或產(chǎn)生。在關(guān)于產(chǎn)物或表 達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的足夠時(shí)間后，細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行分離，例如離心、裂解并且分離目的 產(chǎn)物。依賴于產(chǎn)物的性質(zhì)和用途，可以對(duì)裂解物實(shí)施各種純化方法，例如層析、電泳、溶劑 萃取、結(jié)晶、透析、超濾等。層析法包括但不限于氣相層析、HPLC、柱層析、離子交換層析和 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他層析法。純度可以從約50 %到90 %或更高不等，優(yōu)選最高達(dá)約 100%?？商娲兀康谋磉_(dá)產(chǎn)物或產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)基內(nèi)，并且在連續(xù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生，其 中部分取出培養(yǎng)基，例如通過(guò)柱或親和層析、超濾、沉淀等萃取所需產(chǎn)物，并且棄去用過(guò)的 培養(yǎng)基或通過(guò)恢復(fù)必需組分再循環(huán)。可以對(duì)來(lái)自超濾的包含產(chǎn)物的滲透物(permeate)進(jìn) 一步實(shí)施進(jìn)一步通過(guò)蒸發(fā)的濃縮，隨后為使用醇和/或PH調(diào)整的結(jié)晶或沉淀。本領(lǐng)域技術(shù) 人員知道許多過(guò)程選項(xiàng)。當(dāng)待分泌產(chǎn)物時(shí)，正常將采用組成型轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，盡管也可以使用 非組成型區(qū)。除非另有說(shuō)明，否則本文新描述的所有核苷酸序列都使用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(例如， 來(lái)自PE Applied Biosystems Jnc.的Model 377)進(jìn)行測(cè)定。因此，如本領(lǐng)域已知的，對(duì)于 通過(guò)這種自動(dòng)方法測(cè)定的任何DNA序列，本文測(cè)定的任何核苷酸序列可能包含一些誤差。 通過(guò)自動(dòng)操作測(cè)定的核苷酸序列一般與所測(cè)序DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90%等 同，更一般地至少約95 至少約99. 9 %等同。實(shí)際序列可以通過(guò)其他方法更精確地測(cè)定，包括本領(lǐng)域眾所周知的手工DNA測(cè)序法。范例實(shí)施例1 載體DNA的制備ρYDsTev載體用限制酶SfiI和NotI進(jìn)行消化，用于在與scFv+300bp DNA片段重 組中使用。為了改善效率且預(yù)防未切的載體被轉(zhuǎn)化，Sfil/NotI消化的載體用BglII和HpaI 進(jìn)行進(jìn)一步消化(兩次切割都在填充片段內(nèi))。消化的DNA使用來(lái)自Bioline (Randolph,MA)的Sureclean進(jìn)行純化。簡(jiǎn)言之，使 限制酶切消化與等體積Sureclean混合。使樣品在室溫下溫育10分鐘。樣品隨后在13. 2k rpm下離心15分鐘。棄去上清液，并且用2.切樣品體積的70 %乙醇洗滌粒狀沉淀。樣品 隨后在13. 2k rpm下離心15分鐘。取出上清液，并且使粒狀沉淀風(fēng)干。使粒狀沉淀重懸浮 于 5-10 μ L TE ρΗ 8 中。實(shí)施例2 插入片段DNA的制備使用PCR制備插入片段DNA以擴(kuò)增目的插入片段，其將足夠的載體序列5’和 3’(例如，約300個(gè)堿基對(duì))加入插入片段中，以有效執(zhí)行同源重組。設(shè)計(jì)與免疫球蛋白IgM和IgG(對(duì)于IgM/G cDNA)或IgK(IgKcDNA)雜交的免疫球 蛋白恒定區(qū)引物，用于第一鏈cDNA合成。具體地，對(duì)于IgM/G cDNA引物，利用FcgRevl、2 和3以及FcmRevl、2和3。對(duì)于IgK第一鏈cDNA合成，利用Ckrevl、2和3。使用上述引物使用Invitrogen 1st Strand Synthesis試劑盒執(zhí)行cDNA合成反 應(yīng)。表1 示例性PCR反應(yīng)(步驟1)
IgM/G cDNA
IgK cDNA
20μ1 50 ng/μ CloneTech 聚腺苷酸 脾RNA
3μ1 300ng/pl FcgRevl 3μ1 300ng_ FcgRev2 3μ1 300ng l FcgRev3 3μ1 300ng l FcmRevl 3μ1 SOOng/μΙ FcmRev2 3μ1 300ng/jU FcmRev3 20^dNTPs ( IOmM) 142ul重蒸餾水 ^00μ1總體積
IgM/G cDNA_
10μ1 50 ng/μ CloneTech 聚腺苷 酸脾RNA
1.5μ1 300 ng/μ CkRevl 1.5μ1 300 ng/μ CkRev2 1.5μ1 300 ng/μ CkRev3 10μ1 dNTPs ( IOmM) 75.5ul 重蒸餾水(dd water) 100μ1總體積
IgK cDNA
50μ Ι/rxn，在65°C下反應(yīng)5，，隨后至4°C 1分鐘表2 在這個(gè)研究中利用的寡核苷酸
權(quán)利要求
1.通過(guò)酵母細(xì)胞的電穿孔制備酵母文庫(kù)的方法，所述方法包括步驟 提供包括核酸載體、酵母細(xì)胞、山梨糖醇和CaCl2或MgCl2的懸浮液，和在0. 5kV/cm-超過(guò)12. 5kV/cm下，用約10-約50 μ F的電容使所述懸浮液電穿孔；從而 獲得至少IXlO9的文庫(kù)大小。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述懸浮液包括IM山梨糖醇和lmMCaCl2。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述懸浮液包括IM山梨糖醇和ImMMgCl215
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母細(xì)胞在包括冷0.IM LiAc和IOmM DTT的體積中溫育。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述懸浮液在2.5kV/cm下用約25yF的電容進(jìn)行電穿孔。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述電穿孔步驟在0.2cm間隙杯中執(zhí)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中使用Iyg-Syg載體DNA。
8.權(quán)利要求1的方法，其中使用4μ g載體DNA。
9.權(quán)利要求1的方法，其中載體是線性的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述懸浮液包括400μ 1 1. 6 X IO9酵母細(xì)胞/mL。
11.權(quán)利要求1的方法，其中載體DNA與插入片段DNA的比在1 0.5-1 10范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中載體DNA與插入片段DNA的比是1 3。
13.關(guān)于用DNA轉(zhuǎn)化酵母以制備文庫(kù)的方法，所述方法包括步驟 培養(yǎng)過(guò)夜酵母細(xì)胞至約1. 0-約2的0D_ ；在水中洗滌所述酵母細(xì)胞；在包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中洗滌所述酵母細(xì)胞； 使所述酵母細(xì)胞在包括LiAc和DTT的溶液中溫育； 在包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中洗滌所述酵母細(xì)胞；使所述酵母細(xì)胞重懸浮于包括山梨糖醇和CaCl2的溶液中，以形成酵母細(xì)胞電穿孔懸 浮液；將一定體積的所述電穿孔細(xì)胞懸浮液加入載體DNA和插入片段DNA中，以形成酵母細(xì) 胞-DNA電穿孔懸浮液；和在約2. 5kV/cm-約12. 5kV/cm的電壓下在0. 2cm間隙杯中，使所述酵母細(xì)胞-DNA電穿 孔懸浮液電穿孔。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)電穿孔的酵母轉(zhuǎn)化及其突變體，其導(dǎo)致表達(dá)重組產(chǎn)物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞和文庫(kù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102084002SQ200980115953
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者C·謝, J·M·佩雷斯, J·P·貝爾克, L·貝納特伊爾 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司