專利名稱：一種篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畢赤酵母基因工程菌的篩選方法，具體內(nèi)容是關(guān)于畢赤酵母高拷貝 數(shù)轉(zhuǎn)化子的快速篩選方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子生物學技術(shù)的發(fā)展為利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白提供了許多方法和手段。到目 前為止，已發(fā)展出了大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等多種蛋白表達系統(tǒng)，畢赤酵 母(Pichia.pastoris)基因表達系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表 達系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并 適當糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟等特點。利用強效可調(diào)控啟動子A0X1，已高效表達了朋sAg、 TNF、 EGF、破傷風毒素C片段、基因工程抗體等400多種外源蛋白，證實該系統(tǒng)為高效、 實用、簡便，以提高表達量并保持產(chǎn)物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統(tǒng)，而且 非常適宜于擴大為工業(yè)規(guī)模。
利用畢赤酵母表達外源基因一般包括以下歩驟①將外源基因插入畢赤酵母表達載 體；②用內(nèi)切酶處理線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株；③將轉(zhuǎn)化物接種HIS4營養(yǎng)缺 陷平板進行陽性重組子的首輪篩選④用G418梯度平板進行陽性重組子的第2輪篩選；⑤ 進一步確定外源基因在酵母基因組中的整合情況；⑥小規(guī)模誘導培養(yǎng)鑒定外源基因的表 達；⑦大規(guī)模誘導培養(yǎng)制備重組蛋白。為了提高外源基因在畢赤酵母中的表達量，通常需 要篩選含高拷貝數(shù)外源基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，而高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的篩選是通過利用提高 G418抗性來完成的。(在畢赤酵母常用的系列表達載體PIC9K, PIC3. 5K, PIC9中，引入了G418 抗性標記基因。轉(zhuǎn)化完成后，外源基因和抗性基因以同源重組的方式同時整合到畢赤酵母 染色體上。通過提高G418的抗性，可以篩選到多拷貝數(shù)插入的外源基因)
為了篩選到高拷貝數(shù)的陽性克隆子，需要用不同濃度梯度的G418平板進行篩選,常用 的G418濃度梯度有0， 0. 25， 0. 5， 0. 75, 1. 0， 1. 5， 1. 75, 2. 0, 3. 0， 4. Omg/mL invitrogen公司 的protocol上介紹了兩種篩選方案。第一種方法是制備不同濃度梯度的G418平板，用影印 的方法將HIS4營養(yǎng)缺陷平板上的陽性克性克隆子逐一影印到G418梯度平板上進行高拷貝 數(shù)克隆子的篩選。這種方法的特點是工作量大(在影印之前還需連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次，以保 證影印時每個單克隆子的濃度相當)，篩選難度高，周期長，而且篩選的克隆子數(shù)相對較 少；第二種方法同樣需要制備不同濃度梯度的G418平板，不同的是可以用無菌水或培養(yǎng)基 將HIS4營養(yǎng)缺陷平板上的全部陽性克隆子洗下來，稀釋到合適的濃度，取一定量分別涂 到G418濃度梯度平板上，這樣的操作相對簡單，能篩選的克隆子較多，但需要預先做菌體 稀釋。這兩種篩選方案是目前國內(nèi)外科技工作者利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達外源蛋白時使 用的通用篩選方法。從上述介紹可以看出，這兩種篩選方案各有利弊，但是它們共同的缺 點就是需要配制10種不同濃度梯度的G418篩選平板，G418的用量大，操作繁瑣，工作量大， 費時費力。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上兩種篩選方案共同存在的弊端，本發(fā)明提供了一種操作簡單，結(jié)果可靠，節(jié) 約成本的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。
本發(fā)明的核心內(nèi)容用自制的G418篩選平板進行畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的篩選，可 以達到用1個平板代替10個不同濃度梯度G418平板進行篩選的目的。其優(yōu)點如下
1) 簡化工作程序，縮小工作量。利用1個平板進行篩選就可以達到用10個平板進行篩 選的效果，提高工作效率。
2) 節(jié)約成本，提高篩選工作的性價比。畢赤酵母高拷貝數(shù)基因工程菌篩選過程中用 到的G418價格在400元/克。使用新型篩選平板可以使G418的用量節(jié)約80y。以上，極大的降 低了技術(shù)成本。
3) 本篩選平板所涵蓋的濃度梯度范圍更廣。畢赤酵母轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)越高，抗G418的 能力越強。但是高抗性的轉(zhuǎn)化子數(shù)目較少，為了能夠盡量多的篩選到較高抗性的轉(zhuǎn)化子， protocol要求做10個不同濃度梯度的G418抗性平板，但不同濃度之間的空白區(qū)可能會造成 篩選過程中的遺漏。(比如3.5mg/ml的抗性的轉(zhuǎn)化子就可能會在篩選過程中被漏掉。)而 本發(fā)明中特制的平板能夠形成連續(xù)的濃度梯度，不會造成篩選過程中高抗性轉(zhuǎn)化子被遺漏 的現(xiàn)象。
G418斜面濃度梯度平板的制作流程及原理如下(以最高濃度為4. 0mg/mlG418的斜面濃 度梯度平板為例)
1) 取G418的貯存液(100mg/ml) 400ul加入到加到事先融化好的10mlYPD固體培養(yǎng)基 中(培養(yǎng)基溫度在45—55度之間)，混勻，使培養(yǎng)基中G418的終濃度達到4.0mg/ml，倒入培 養(yǎng)皿中。(本篩選平板制作時用的為90mm培養(yǎng)皿)
2) 在培養(yǎng)基凝固前，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基擺成斜面(斜面與水平面之間的角度在20 度到30度之間)，待斜面培養(yǎng)基冷卻凝固好以后做好標記，倒入10ml不含G418的上層YPD 培養(yǎng)基。(倒的時候要注意溫度的控制，以防溫度過高損壞下層的斜面培養(yǎng)基)。
3) 雙層培養(yǎng)基冷卻凝固后，可以得到最高濃度為4.0mg/ml，最低濃度為0mg/ml的G418 濃度梯度平板。(由于擴散作用，下層培養(yǎng)基中的G418會向上層培養(yǎng)基中均勻擴散，而上 層不含抗生素的培養(yǎng)基在各個縱切面上的厚度呈連續(xù)梯度分布，這就使G418在雙層平板的 表面形成了連續(xù)的濃度梯度。)
本發(fā)明所述的G418斜面濃度梯度平板的在制備過程中不限于最高濃度為4. Omg/ml的 G418，可以為任何濃度范圍的G418斜面濃度梯度梯度平板；另外，所用的底層培養(yǎng)基和上 層培養(yǎng)基的量以及所形成的斜面角度均不受上述描述所限制， 一般情況下，培養(yǎng)基用量大， 所形成的斜面角度越大；最后，本篩選平板制備過程中所使用的容器不限于90ram培養(yǎng)皿， 可以為任何類似的容器。
具體實施例方式(以在畢赤酵母GS115中表達外源基因/7oW的篩選為例)
1畢赤酵母重組表達載體的構(gòu)建
將本實驗室保存的pPUC-18-po/ 7重組質(zhì)粒進行雙酶切，并于畢赤酵母表達載體pPIC9K 進行連接構(gòu)建重組表達載體pPIC9K- ;w/77 (po"/為1068bp的外源基因)。 2重組質(zhì)粒的線性化及電轉(zhuǎn)化將重組表達載體pPIC9K-;^/77進行線性化并且電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115(組氨酸營養(yǎng)缺 陷型)中。
3組氨酸營養(yǎng)缺陷型初次篩選
用組氨酸營養(yǎng)缺陷型MD平板(1.34。/。YNB,4X10-s生物素，0.5%甲醇，1.8%瓊脂)進行 初次篩選，只有重組表達載體整合到GS115的染色體上的菌株才能在MD平板上正常生長。
4 G418斜面濃度梯度平板進行二次篩選
取G418的貯存液(100mg/ml)適量加入到加到事先融化好的YPD固體培養(yǎng)基(2%蛋白 胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物)中，混勻，使培養(yǎng)基中G418的終濃度達到4.0mg/ml，在培 養(yǎng)基凝固前，將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基擺成斜面，待斜面培養(yǎng)基冷卻凝固好做好標記，倒入等 量不含G418的上層YPD培養(yǎng)基。雙層培養(yǎng)基冷卻凝固后，可以得到最高濃度為4.0mg/ml， 最低濃度為0mg/ml的G418濃度梯度平板。
將MD平板上初篩到的轉(zhuǎn)化子用2ml無菌水沖洗下來，稀釋至的10—5， l(T6， 10—7三個濃度 梯度，每個梯度取100ul加到G418斜面濃度梯度平板中(每個梯度涂3個)，30度過夜培養(yǎng)2 天，觀察結(jié)果。
5 PCR驗證進一步確定外源基因在酵母基因組中的整合情況
挑選G418斜面濃度梯度平板上較高濃度區(qū)域的生長快速的轉(zhuǎn)化子，以pPIC9K上的aox 引物對其進行菌液PCR驗證，其中甲醇利用快型即mut+的得到的是兩條帶分別是2200bp和 1068bp的目的條帶；甲醇利用慢型即muts得到的只有一條大小為1068bp目的條帶，而假陽 性得到的只有一條500bp的條帶。
6根據(jù)實驗所需，可以分別選取甲醇利用快型即mut+或甲醇利用慢型即muts型的轉(zhuǎn)化子進 行后續(xù)的誘導試驗。
本研究采用G418斜面濃度梯度平板的制備，可以用l個平板來代替protocol中所提到 的10個濃度梯度平板，而且其所涵蓋的濃度梯度范圍更廣。實踐證明，該發(fā)明不但可以方 便快捷地篩選到高濃度抗性的克隆子，提高工作效率，而且還可以大大節(jié)約G418的用量， 降低技術(shù)成本，是一種非常有效的篩選方案。
權(quán)利要求
1.一種新型的篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法，本發(fā)明的特征在于(1)自制了一種新型的、特殊的G418斜面濃度梯度篩選平板。(2)以步驟(1)的得到的G418斜面濃度梯度篩選平板，用于篩選含有高拷貝數(shù)外源基因的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。
2. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法的應(yīng)用。其特征 在于篩選中使用了 G418的斜面濃度梯度平板。
3. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。其特征在 于G418的斜面梯度平板制作過程中，上層培養(yǎng)基中使用了不含G418的培養(yǎng)基，下層培養(yǎng) 基中使用了含有一定濃度的G418， G418的濃度范圍在0mg/ml到100mg/ml之間。
4. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。其特征在 于G418的斜面梯度平板制作過程中，下層含有一定濃度G418的培養(yǎng)基在凝固之前制成了 斜面平板，其斜面與水平面的傾斜角度在O。到90°之間。
5. 按照權(quán)利要求l中所述的新型的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。本篩選平板 制備過程中所使用的容器不限于90mm培養(yǎng)皿，可以為任何類似的容器。
6. 按照權(quán)利要求l中所述的新型的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。本篩選方案 可適用于任何類型的畢赤酵母的宿主菌(GSII5, KM71， SMD1168， SMD1163)
7. 按照權(quán)利要求l中所述的新型的快速篩選畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的方法。本篩選方案 可適用于任何類型的畢赤酵母的表達載體(PIC9K, PIC3. 5K, PIC9)
全文摘要
本發(fā)明涉及畢赤酵母基因工程菌株的篩選方法，屬于基因工程領(lǐng)域。具體內(nèi)容是關(guān)于畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的快速篩選方法。本發(fā)明利用自制G418濃度梯度平板進行重組畢赤酵母高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的篩選。該方法可以用1個篩選平板代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中10個不同濃度的篩選平板，使篩選工作效率大大提高，對篩選用的抗生素G418的用量降低了80％以上，降低了技術(shù)成本。而且，本方法可以提供連續(xù)的抗生素濃度梯度，彌補了傳統(tǒng)篩選方法中抗生素篩選梯度不連續(xù)而造成重要高抗性轉(zhuǎn)化子被遺漏的缺點。本方法可廣泛應(yīng)用于畢赤酵母表達系統(tǒng)的高拷貝數(shù)重組轉(zhuǎn)化子的篩選。
文檔編號C12Q1/04GK101649347SQ20081023087
公開日2010年2月17日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者崔樹軍, 廉有軒, 張建云, 谷立坤, 金維平 申請人:河南工程學院