專利名稱：一種高通量的真菌病原菌抑制菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種高通量的真菌病原菌抑帶TO篩選方法。
背景技術(shù)：
植物病原真菌引起的植物病害位居植物3類病害(真菌病害、細(xì)菌病害和病毒病害)之 首，如在水稻的240多種病害中，真菌病害占了 90%。長期以來，在防治植物真菌病害
中，人們大量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致了三大難題①環(huán)境污染，殘毒積累，最終危害人類的 健康；②病原真菌抗藥性上升；③殺死有益微生物，破壞了植物體內(nèi)微生物種群的平衡， 致使病原真菌成為優(yōu)勢種群，加劇病害的爆發(fā)流行。
生物防治以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)來控制有害生物，是綜合防治體系中一個必不可缺少的組成 部分，它避免了化學(xué)農(nóng)藥使用帶來的一系列植保、環(huán)境和能源方面的問題，避免了農(nóng)藥殘 留對人畜的危害，更重要的是促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。如中國專利(公丌號CN 101177671A)公布了一株可以防治植物真菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌并提供了發(fā)酵生產(chǎn)方法，中 國專利(授權(quán)公告號CN 1221659C)公布了一種以蠟狀芽孢桿菌98-1制備微生物殺菌 劑的方法，該菌株對黃瓜霜霉病，番茄枯萎病等具有好的防治效果。
篩選一株好的病原真菌抑制菌是推廣應(yīng)用的關(guān)鍵之一。目前，篩選病原真菌抑制菌通 常要選擇病原微生物多發(fā)區(qū)環(huán)境樣品，從中分離單菌落純化后通過平板對峙實(shí)驗(yàn)，從而確 定最優(yōu)病原微生物拮抗菌。但該方法需要消耗大量人力，物力，效率低。
本專利采用篩選純化同歩的方法， 一歩法高通量篩選最優(yōu)病原微生物拮抗菌，極大提 高工作效率，本專利尚未見文獻(xiàn)報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高通量的真菌病原菌抑制菌的篩選方法。
本發(fā)明所述的篩選方法如下
1、 培養(yǎng)基配制PDA固態(tài)培養(yǎng)基(200 g土豆(加水煮沸30分鐘后取上清)，葡萄糖 5g/1,瓊脂20g/1)，同蒸餾水共同高壓滅菌15分鐘；
2、 病原菌株活化挑取真菌病原菌孢子接種到PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，28t:培養(yǎng)活化兩
3次，收集孢子，加入無菌水，使孢子重懸均勻；
3、病原微生物拮抗菌平板篩選稱取一定土壤或含有微生物樣品，加入無菌水(含 0.05%吐溫20)，等比例無菌水稀釋，加入病原菌孢子懸液，混勻后吸取一定量后在PDA 培養(yǎng)基上涂布，篩選抑菌斑大的細(xì)菌單菌落，即為病害真菌抑制菌。
本發(fā)明闡述的篩選方法具有高通量的特點(diǎn)，同時可以大量的節(jié)省人力，物力。
實(shí)施例l:綠色木霉拮抗菌制備
1) 培養(yǎng)基制備稱取200 g土豆，切碎，于1 L自來水中煮沸30分鐘，過濾除去殘 渣，加入20g葡萄糖，定容至l L，即得土豆培養(yǎng)基。分裝入5個1 L的三角瓶中，121 °0滅菌20min。
2) 病原菌活化挑取綠色木霉孢子接種到PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)活化兩次， 收集孢子，加入無菌水，使孢子重懸均勻；
3) 病原微生物拮抗菌平板篩選稱取2g土壤，加入無菌水(含0.05%吐溫20)，等 比例無菌水稀釋，加入病原菌孢子懸液，混勻后吸取100nL在PDA培養(yǎng)基上涂布，篩選 抑菌斑大的細(xì)菌，鑒定為多粘類芽孢桿菌。
4) 大棚試驗(yàn):對大棚內(nèi)栽培雞腿菇噴灑上述菌液(10^ell/ml)，對照為噴灑清水對照， 噴灑菌液的綠色木霉發(fā)病率較對照減少70%
實(shí)施例2:對黑星病的拮抗作用
1) 培養(yǎng)基制備稱取200g土豆，切碎，于1L自來水中煮沸30分鐘，過濾除去殘 渣，加入20g葡萄糖，定容至1L，即得土豆培養(yǎng)基。分裝入5個1 L的三角瓶中，121 'C滅菌20min。
2) 病原菌活化挑取黑星病孢子接種到PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)活化兩次，收 集孢子，加入無菌水，使孢子重懸均勻；
3) 病原微生物拮抗菌平板篩選稱取2g土壤，加入無菌水(含0.05%吐溫20)，等 比例無菌水稀釋，加入病原菌孢子懸液，混勻后吸取100pL在PDA培養(yǎng)基上涂布，篩選 對黑星病抑制效果好的的細(xì)菌，鑒定為芽孢桿菌。
4) 田間試驗(yàn)取田間黑星病發(fā)病率嚴(yán)重的土壤，將上述芽孢桿菌發(fā)酵液(10、ell/ml)與
4土壤按l: 10 (W/W)混合，對照為噴灑清水對照，噴灑菌液的黃瓜幼苗發(fā)芽率較對照增 加40%。
權(quán)利要求
1.一種高通量的真菌病原菌抑制菌的篩選方法，其特征在于1、培養(yǎng)基配制，2、病原菌株活化，3、平板篩選共三個方面。
2. 權(quán)利要求1所述的平板篩選，其特征在于稱取土壤或含有微生物樣品，加入無菌水(含0.05%吐溫20)，無菌水梯度稀釋至103-104CFU/ml，加入病原菌孢子懸液，使病 原菌孢子與微生物比例為100: 1-1: 100，混勻后吸取10-300W在PDA培養(yǎng)基上涂布， 篩選抑菌斑大的細(xì)菌，放線菌，真菌，即為病害真菌抑制菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌病原菌抑制菌的高通量方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用病原真菌與待測樣品共培養(yǎng)，通過對病原真菌抑菌圈的大小來篩選真菌病原菌的抑制菌。該方法簡便，快捷，可用于病原菌抑制菌的高通量篩選。
文檔編號C12Q1/04GK101649346SQ20081023087
公開日2010年2月17日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者崔樹軍, 廉有軒, 張建云, 武秀琴, 谷立坤 申請人:河南工程學(xué)院