一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于多肽藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法，其特征在于：以細(xì)菌為靶細(xì)胞，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，并經(jīng)陽性克隆、ssDNA測序、合成親和肽和抗菌活性測定進(jìn)行高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物；以大腸桿菌細(xì)胞為靶目標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，其中一條10肽親和肽的氨基酸序列為QKRPRVRLSA。本發(fā)明從噬菌體肽庫中，通過親和篩選的方法，可以從特定長度的隨機(jī)肽中，高通量篩選得到具有特定生物活性的多肽如抗菌肽等，通過此策略可快速篩選到抗菌肽先導(dǎo)化合物，提高了抗菌肽新藥創(chuàng)制的速度。
【專利說明】一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]病原細(xì)菌對臨床抗菌藥物耐藥性的迅速增長和傳播，已成為危害公共健康最為嚴(yán)重的問題之一。多重耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)，給臨床治療造成嚴(yán)重困難。開發(fā)安全有效又不容易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌藥物是擺在我們面前的重要課題。
[0003]傳統(tǒng)藥物的開發(fā)一般是從自然界的動物、植物和微生物中分離出具有特定藥理作用的化學(xué)物質(zhì)或蛋白質(zhì)(多肽)，作為藥物研究的先導(dǎo)化合物，再經(jīng)過進(jìn)一步的設(shè)計、改造及合成有效的功能藥物；而對于蛋白質(zhì)(多肽)，則一般通過基因工程手段進(jìn)行改造發(fā)展成基因工程藥物。目前大部分藥物是通過這些方法獲得的。
[0004]抗菌肽是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細(xì)胞等活性作用的多肽。一般由12到100個氨基酸組成。抗菌肽作為機(jī)體的有效防御分子廣泛存在。目前已經(jīng)從微生物、植物、昆蟲、節(jié)肢動物、兩棲類動物以及哺乳動物中鑒定出上千種抗菌肽。
[0005]抗菌肽的發(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展為開發(fā)新型抗菌肽類抗菌藥物提供了巨大的資源庫，也為解決臨床耐藥株的問題提供了極大可能。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，目前人們既可以從生物體內(nèi)直接分離純化得到抗菌肽，也可以利用基因工程手段重組得到抗菌肽，又可以直接利用化學(xué)合成手段來合成大量的抗菌肽。天然來源的抗菌肽會因為分子量較大存在免疫原性，對宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，或引起溶血等方面的問題，限制了抗菌肽作為抗菌藥物的推廣應(yīng)用。因此，尋找分子量更小，抗菌活性更強(qiáng)，尤其不能存在細(xì)胞毒以及溶血等不良作用的抗菌肽，是抗菌肽類藥物開發(fā)的關(guān)鍵。
[0006]卩遼菌體隨機(jī)肽庫(phagerandom peptide library),它是以感染性絲狀曬菌體為載體，將一段人工合成的隨機(jī)序列DNA片段，通過基因工程手段插入其編碼外殼蛋白的基因中，這個外源DNA片段所編碼的多肽可與噬菌體外殼蛋白一起以融合蛋白的形式展示于活的噬菌體表面衣殼上，并保持相對獨(dú)立的空間構(gòu)象和生物活性，同時不影響該重組噬菌體感染宿主菌的能力。每個噬菌體病毒粒子的表面只能展示一種外源隨機(jī)肽，所有展示不同多肽的噬菌體集合就構(gòu)成了隨機(jī)肽庫。然后通過目標(biāo)蛋白對噬菌體隨機(jī)肽庫進(jìn)行親和篩選，富集那些展示能與目標(biāo)蛋白發(fā)生結(jié)合的肽的噬菌體(即相應(yīng)的噬菌體抗原肽)，而且這種展示有抗原肽的噬菌體可以在大腸桿菌中大量增殖，因此一旦獲得了展示有特異性肽的一個重組噬菌體，那么此噬菌體就可以成為特異性肽的無限來源。
[0007]噬菌體肽庫的主要優(yōu)點(diǎn)就是成本低，能夠在體外擴(kuò)增，可以簡單而迅速地得到大量目標(biāo)噬菌體肽。從理論上來說，噬菌體隨機(jī)肽庫只要足夠大，就可以從中篩選到任何所需要的多肽序列，而且有可能篩選到自然界根本不存在的某些序列。
[0008]任何藥物都是通過受體發(fā)揮作用的，這就需要藥物與受體發(fā)生特異性結(jié)合，而受體一般都是蛋白質(zhì)或核酸，這種相互結(jié)合的位點(diǎn)就為藥物篩選與設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)，避免藥物篩選的盲目性。噬菌體肽庫展示技術(shù)是尋找抗菌肽的理想工具，其具體過程是:先將噬菌體肽庫與靶分子相互作用一段時間，接著洗滌除去非特異性結(jié)合噬菌體，將特異性結(jié)合噬菌體洗脫下來擴(kuò)增，然后再投入下一輪的淘選；繼續(xù)重復(fù)淘選、洗脫、擴(kuò)增，最終淘選出特異結(jié)合的重組噬菌體克隆。
[0009]現(xiàn)有抗菌藥物的開發(fā)技術(shù)存在以下缺點(diǎn):1)傳統(tǒng)藥物的開發(fā)一般是從自然界中分離出具有特定藥理作用的化學(xué)物質(zhì)，作為藥物研究的先導(dǎo)化合物，再經(jīng)過進(jìn)一步的設(shè)計、改造及合成有效的功能藥物；而對于蛋白質(zhì)(多肽)，則一般通過基因工程手段進(jìn)行改造發(fā)展成基因工程藥物。這種方法往往周期長、風(fēng)險高、耗資巨大，在隨機(jī)篩選過程中帶有很大的盲目性；2)基于藥物靶標(biāo)的靶向藥物設(shè)計是新藥篩選的一個重要方向。藥物靶標(biāo)是指體內(nèi)具有藥效功能并能被藥物作用的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等?；谒幬锇袠?biāo)的藥物發(fā)現(xiàn)過程是:利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及生物芯片技術(shù)等獲取病原體相關(guān)的生物分子信息，通過進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后對相關(guān)的生物分子進(jìn)行功能研究，以確定候選藥物作用靶標(biāo)，針對候選藥物作用靶標(biāo)，設(shè)計小分子化合物，在分子、細(xì)胞和整體動物水平上進(jìn)行藥理學(xué)研究，驗證靶標(biāo)的有效性。雖然分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)取得了很大進(jìn)步，但藥靶的發(fā)現(xiàn)是其中的發(fā)展瓶頸。同理，在新藥發(fā)現(xiàn)中，藥物靶標(biāo)也是基于藥靶分子的噬菌體肽庫親和篩選的發(fā)展瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種工藝簡單可行、成本低、效率高的高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物 的方法。
[0011]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法，其特征在于其步驟為:
a)對噬菌體展示隨機(jī)肽庫進(jìn)行擴(kuò)增；所述噬菌體展示隨機(jī)肽庫為噬菌體隨機(jī)10肽庫~噬菌體15肽庫；
b)以細(xì)菌為靶細(xì)胞，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，進(jìn)行親和淘選3~4輪，用ELISA法挑選陽性克隆；
c)將目的陽性克隆進(jìn)行ssDNA測序，根據(jù)推導(dǎo)出的親和肽氨基酸序列，合成親和肽；
d)對親和肽的抗菌活性測定。
[0012]優(yōu)選的，步驟b)中，以大腸桿菌細(xì)胞為靶目標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽。
[0013]更進(jìn)一步的，步驟b)和c)中，以大腸桿菌細(xì)胞為靶目標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，其中一條10肽親和肽的氨基酸序列為QKRPRVRLSAο
[0014]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以細(xì)菌作為靶細(xì)胞，從噬菌體肽庫中，通過親和篩選的方法，可以從特定長度的隨機(jī)肽中，高通量篩選得到與細(xì)菌表面特異性結(jié)合的具有抗菌活性的多肽，作為新型肽類抗菌藥物的先導(dǎo)化合物，突破了現(xiàn)代新藥篩選中的藥靶瓶頸，具有工藝簡單可行、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。通過此策略可快速篩選到抗菌肽先導(dǎo)化合物，提高了抗菌肽新藥創(chuàng)制的速度?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0016]實(shí)施例:
一、實(shí)驗材料 1、菌株
大腸桿菌(focAericAia COli) TG1，輔助噬菌體M13K07均為山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗室保存。
[0017]2、主要試劑
噬菌體展示10肽庫為山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗室構(gòu)建(庫容1.36X 108)，HRP 一 M13抗體購自華美公司，96孔酶標(biāo)板為Nunc公司產(chǎn)品，ELISA試劑均為華美公司產(chǎn)品。
[0018]主要溶液的配制:
PBS:
IXPBS:133mmol/l NaCl
3mmol/L KCl,
8mmol/L Na2HPO4
1.5mmol/L KH2PO4
I OXPBS:80.0gNaCl
2.0gKCl
11.5gNa2HP04.7H20
20.0gKH2PO4
溶于I升H2O中，調(diào)至pH 7.5，高壓滅菌。
[0019]PBS-Tween 20 (PBST):
I 升 IXPBS 中加入 Iml 吐溫(Tween) — 20。
[0020]PBSM: 100ml PBS中加入2g脫脂奶粉，離心取上清液。
[0021]50mmol/L 甘氛酸一HCl (Gly-HCl), pH 2.0: (lmol/L 忙存液)

111.6g甘氨酸
溶于IL H2O中，HCl調(diào)成ρΗ2.0，高壓滅菌。
[0022]200mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH7.5):( lmol/L 貯存液)
44.16g NaH2PO4.2H20
450.66g Na2HPO4.7H20
溶于ILH2O中，高壓滅菌。
[0023]20%PEG-8000/2.5M NaCl:

200.0g polyethylene glycol 8000
146.1g NaCl
溶于ILH2O中，0.22um濾膜過濾除菌。
[0024]鄰苯二胺(OPD)底物緩沖液:

2.84g Na2HPO4.7H20

2.1Og Citric Acid溶于 100mlH2O 中，ρΗ5.0。
[0025]Μ9培養(yǎng)基平板的配制:
瓶 1: 0.6g Na2HPO4

0.3g KH2PO4
0.1g NH4Cl
將上述試劑溶于50 ml H2O中，NaOH調(diào)至ρΗ7.4。
[0026]瓶2:1.5g瓊脂粉溶于50 ml H2O中。
[0027]將瓶1、瓶2高壓滅菌后,冷卻至50°C~60°C時加入lmol/L MgCl2 0.1 ml、lmol/LCaCl2 0.1 ml、lmol/L 葡萄糖 0.5 ml、0.5mol/L 維生素 B1 0.2 ml,立即將瓶 1、瓶 2 混勻倒平板。
[0028]3、主要儀器
DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀，華東電子集團(tuán)公司醫(yī)療電子儀器廠；
JJT-7B潔凈工作臺，北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠；
THZ-C恒溫振蕩器，江蘇太倉市實(shí)驗設(shè)備廠；
DF-C型恒壓恒流電泳儀，北京東方儀器廠； DYY-1II 23A型電泳槽，北京市六一儀器廠；
DYY-1II 31B型電泳槽，北京市六一儀器廠；
臺式冷凍離心機(jī)Sigma 1K15, Sigma公司；
二、實(shí)驗過程
1.淘選過程
1.1噬菌體展示隨機(jī)10肽庫的擴(kuò)增
1.1.1從M9平板培養(yǎng)基上挑取TGl單菌落于3ml LB培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。1:100轉(zhuǎn)接至50ml LB培養(yǎng)基中，搖至對數(shù)期。取原庫IOul (1012CFU/mL)，于37°C搖床低速(70-90rpm)感染30min。再加入M13K07，使感染系數(shù)達(dá)到10:1(M13K07:宿主菌=10:1)。37°C搖床低速感染30min.取出菌液，5000 rpm離心10分鐘。去上清，將菌體重懸至200ml2YTAK (2父￥1'，含100呢/1111氨芐青霉素，50ug/ml卡那霉素)。37°C 210rpm振蕩培養(yǎng)12~16小時。
[0029]1.1.2取菌液5000rpm離心10分鐘，取上清。加1/4體積的PEG/NaCl，振蕩混勻，冰上放置I小時。4°C 12000rpm離心20分鐘，去上清。適量PBS重懸沉淀，使沉淀盡量溶解。1000Orpm離心10分鐘。取上清，加1/4體積PEG/NaCl，振蕩混勻，冰上放置I小時。40C 12000rpm離心20分鐘，去上清。適量PBS重懸溶解，1000Orpm離心10分鐘。取上清，即得擴(kuò)增后的噬菌體庫。
[0030]1.1.3用滅菌的PBS溶液梯度稀釋噬菌體液，取9次，10次，11次的稀釋液各50ul，加入已經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)到對數(shù)期的新鮮TGl菌液50ul，混勻，37°C溫育20分鐘。全部涂含Ampl00ug/ml的LB固體平板。37°C溫箱培養(yǎng)過夜。次日計單菌落數(shù)，計算滴度。
[0031]1.2細(xì)菌親和肽的親和淘選
1.2.1包被IXPBS稀釋大腸桿菌菌懸液(2.5 xlO8 CFU/ml)，IOOul包被酶標(biāo)板。以IOOul PBS包被空白對照孔。37°C，孵育I小時4°C靜置過夜。
[0032]1.2.2.封閉吸出包被液。2%PBSM加滿各孔，37°C靜置2小時，或4°C包被過夜。[0033]1.2.3.結(jié)合吸出封閉液，如前所述以PBST和PBS各洗滌2-3次，拍盡洗滌液。各孔加入IOOul以封閉液稀釋的隨機(jī)肽庫液體(噬菌體滴度大于庫容量的1000倍)，37°C緩慢搖動或靜置2個小時。
[0034]1.2.4.洗脫吸出噬菌體液，PBST洗10次，PBS洗10次，拍盡洗滌液，以除去未結(jié)合的噬菌體粒子。各孔加入IOOul甘氨酸一 HCl (pH2.0)，37°C緩慢搖動或靜置15分鐘。吸出洗脫液，加等體積PH 7.5磷酸鈉緩沖液中和。
[0035]1.2.5.測滴度各孔取IOul中和液進(jìn)行梯度稀釋，取2，3，4次稀釋度，按照1.1.3測滴度，計算洗脫噬菌體總數(shù)。
[0036]1.2.6擴(kuò)增剩余的洗脫噬菌體液加入到3ml新鮮TGl溶液中，吸附30_60min。加M13K07,使感染系數(shù)達(dá)到10:1,吸附30~60min。5000rpml0min離心菌體，重懸至3ml2XYTAK中。37°C 210rpm振蕩培養(yǎng)12~16小時。按照1.1的步驟提取噬菌體，并測得擴(kuò)增后的滴度。(對照孔所得噬菌體液無需擴(kuò)增)
1.2.7重復(fù)淘選后面2-3輪篩庫,步驟同第一輪淘選。
[0037]2.陽性克隆的挑選
2.1隨機(jī)挑選噬菌體克隆
2.1.1.從最后一輪保存的平板上，隨機(jī)挑選20個分離良好的單菌落，于3mlLB(Ampl00ug/ml)中37°C振蕩培養(yǎng)過夜。1:100轉(zhuǎn)接于31111 LB(Amp)中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。各加入M13K07使感染系數(shù)達(dá)到10。緩慢振蕩30min。5000rpml0min,離心菌體。棄上清，將菌體重懸至3ml LBAK或2XYTAK中，37振蕩12至16小時。· 2.1.2.如1.1.2所述，提取噬菌體。
[0038]2.2用ELISA方法初步挑選陽性克隆
2.2.1.包被取PBS稀釋的目的菌懸液IOOul (2.5 xlO8 CFU/ml)，包被酶標(biāo)板，4°C靜置過夜。
[0039]2.2.2.封閉吸出包被液，加200ul 2%PBSM，37°C靜置2小時或4°C過夜。
[0040]2.2.3.結(jié)合吸出封閉液，如前所述地洗滌，每孔加入lOOulPBSM稀釋的單克隆噬菌體液，37°C靜置2小時。
[0041]2.2.4.抗體結(jié)合甩出噬菌體液，洗滌。每孔加入以封閉液1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的M13噬菌體抗體100ul，37°C靜置2小時。
[0042]2.2.5.顯色甩出抗體溶液，洗滌。各加IOOul OPD(TMB)顯色底物溶液，37°C于黑暗處顯色30min。
[0043]2.2.6.終止加入2mol/L的％504溶液50ul，終止反應(yīng)。
[0044]2.2.7.讀取各孔450nm處的吸光度值。記錄數(shù)據(jù)。從中挑出ELISA陽性克隆進(jìn)行測序。
[0045]3.合成親和肽
將目的陽性克隆提取其ssDNA，利用-96位測序引物，使用ABI PR ISM310型DNA全自動測序儀測序，序列采用DNARUNR軟件進(jìn)行分析。采用多肽合成儀合成親和肽。
[0046]4.對親和肽的抗菌活性測定。
[0047]微量肉湯稀釋法測定親和肽的抗菌活性的藥敏試驗:
參考2009年美國臨床和實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)出版的抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第十九版信息增刊M100-S19的藥敏試驗方法，采用微量液基稀釋法對大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行親和肽藥物敏感性試驗，質(zhì)控菌株為ATCC25922。親和肽最大工作濃度為1024μ g/mL，溶媒為10 mM PBS。具體方法如下:
在普通營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個菌落接種于3mlMH肉湯培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3.5~4h，使其0D600值達(dá)到0.25~0.3，取50 μ I用MH肉湯作1:600倍稀釋，備用，稀釋液在15分鐘內(nèi)加入反應(yīng)體系。在96孔酶標(biāo)板的每孔加營養(yǎng)成分含量為2倍濃度的MH肉湯50 μ I,然后在酶標(biāo)板第一排孔加親和肽稀釋液50 μ I，用八道移液器混勻，吸取50 μ I加入第二排孔，混勻后，吸取50 μ I加入第三排孔，以此類推至第十一排孔，第十一排孔混勻后吸取50 μ I棄去。將已校正濃度的待測菌液100 μ I依次加入酶標(biāo)板的第I~11排孔中，蓋蓋兒，震蕩
0.5~I分鐘，裝入封口塑料袋，37° C培養(yǎng)16~18h后觀察結(jié)果。每次試驗用質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株作對照。實(shí)驗結(jié)果:
得到56個ELISA陽性克隆，隨機(jī)挑取I個陽性克隆，使用ABI PR ISM310型DNA全自動測序儀測序，序列采用DNARUNR軟件進(jìn)行分析。通過測序結(jié)果，我們推導(dǎo)出相應(yīng)的10肽親和肽序列為谷氨酰胺-賴氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸-亮氨酸-絲氨酸-丙氨酸(QKRPRVRLSA)。
[0048]經(jīng)藥敏試驗 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該親和肽對大腸桿菌具有較好的抗菌活性(MIC=16~32 μ g/mL)。
【權(quán)利要求】
1.一種低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法，其特征在于其步驟為: a)對噬菌體展示隨機(jī)肽庫進(jìn)行擴(kuò)增；所述噬菌體展示隨機(jī)肽庫為噬菌體隨機(jī)10肽庫~噬菌體15肽庫； b)以細(xì)菌為靶細(xì)胞，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，進(jìn)行親和淘選3~4輪，用ELISA法挑選陽性克?。? c)將目的陽性克隆進(jìn)行ssDNA測序，根據(jù)推導(dǎo)出的親和肽氨基酸序列，合成親和肽； d)對親和肽的抗菌活性測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法，其特征在于:步驟b)中，以大腸桿菌細(xì)胞為靶目標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低成本、高通量篩選抗菌肽先導(dǎo)化合物的方法，其特征在于:步驟b)和c)中，以大腸桿菌細(xì)胞為靶目標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中淘選與細(xì)菌細(xì)胞表面特異結(jié)合的多肽，其中一條10肽親和肽`的氨基酸序列為QKRPRVRLSA。
【文檔編號】C40B30/06GK103590116SQ201310564121
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】刁有江 申請人:刁有江