一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于選育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草性喜溫暖濕潤。我國煙區(qū)分布廣泛，南方煙區(qū)的早春低溫與北方煙區(qū)的夏季干旱對煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成很大影響。乙烯作為重要的植物激素在植物應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫過程中起到了至關(guān)重要的作用，一些乙烯突變體常表現(xiàn)出抗逆性。在水稻中表達(dá)乙烯響應(yīng)因子可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性。在煙草和番茄中分別過表達(dá)乙烯響應(yīng)因子提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐寒性。擬南芥的乙烯不敏感突變體如etrl-l, ein4-l,提高了耐凍性。但是，利用乙烯“三重反應(yīng)”篩選具有復(fù)合抗性的新種質(zhì)材料尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供了一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，具體包括:乙烯不敏感種質(zhì)的篩選、乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的篩選以及乙烯不敏感-耐寒-耐旱復(fù)合抗性種質(zhì)的篩選。
[0004]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，它包括以下步驟:
(1)煙草乙烯不敏感種質(zhì)的篩選
a、表面消毒:取待篩選的煙草種子與煙草野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗；
b、低溫處理:將已消毒的所述煙草種子點播在1/2MS+100 μΜ ACC的培養(yǎng)基上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 d;
C、光照催芽與暗培養(yǎng):于25°C光照培養(yǎng)10 h ;之后將其于25°C下避光暗培養(yǎng)5_6 d ；
d、乙烯不敏感種質(zhì)的鑒別:煙草野生型種子出現(xiàn)“三重反應(yīng)”的表型:幼苗的主根變短、下胚軸縮短變粗、子葉形成頂鉤三重反應(yīng)”呈現(xiàn)不明顯表型的為乙烯不敏感種質(zhì)；
(2)乙烯不敏感-耐寒復(fù)合種質(zhì)的篩選
以所述篩選出的乙烯不敏感種質(zhì)的煙草種子為測試材料，以煙草野生型種子為對照，按以下步驟進(jìn)行篩選:
a、表面消毒:取所述煙草乙烯不敏感種質(zhì)與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗；
b、低溫處理:將已消毒的煙草種子點播在1/2MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 d ;
c、處理前光照培養(yǎng):于25°C光照條件下培養(yǎng)3d至種子萌發(fā)；
d、低溫篩選:選取萌發(fā)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2MS的培養(yǎng)基平板上，然后用錫箔紙包起來在4 °C低溫下暗培養(yǎng)60 d； e、乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的鑒別:煙草野生型在低溫條件下根長及下胚軸生長受抑制變短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性種質(zhì)的根長及下胚軸生長不受抑制或抑制較輕，篩選出乙烯不敏感-耐寒抗性種質(zhì)。
[0005]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是:本發(fā)明建立了煙草“乙烯不敏感-耐寒”與“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法。篩選煙草乙烯不敏感種質(zhì)資源主要依據(jù)黑暗條件下萌發(fā)的幼苗呈現(xiàn)特有的“三重反應(yīng)”:在無光照的培養(yǎng)條件下，外源乙烯處理會使萌發(fā)的幼苗的主根生長受到抑制，下胚軸縮短變粗，子葉形成特別的頂鉤。基于這個特點，可快速篩選出乙烯不敏感種質(zhì)。在含有乙烯前體物ACC(l-aminocyclopropane-l-carboxylic acid)的培養(yǎng)基上無光照培養(yǎng)，野生型幼苗表現(xiàn)出典型的“三重反應(yīng)”，而乙烯不敏感種質(zhì)的“三重反應(yīng)”則表現(xiàn)不明顯。對于乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的篩選，本發(fā)明本著采用高通量、簡易、快捷的原則，采用了最簡單的條件以及簡明的評價判別方法，進(jìn)行了獨創(chuàng)性改進(jìn)。本發(fā)明所述煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的篩選方法對抗逆育種以及研宄乙烯對抗逆的影響提供了簡易的基礎(chǔ)材料篩選途徑。
【附圖說明】
[0006]圖1枚舉本發(fā)明利用“三重反應(yīng)”于100 μ M ACC培養(yǎng)基上篩選煙草乙烯不敏感種質(zhì)。
[0007]圖2枚舉本發(fā)明利用煙草乙烯不敏感種質(zhì)于4°C處理60 d進(jìn)一步篩選耐寒種質(zhì)。
[0008]圖3枚舉本發(fā)明利用煙草乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行耐旱篩選，即在200 mM甘露醇濃度下野生型與抗性種質(zhì)的生長情況。
【具體實施方式】
[0009]為使本發(fā)明實施目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，如下結(jié)合本發(fā)明實施個例中的附圖，對本發(fā)明實施中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0010]實施例1
本發(fā)明煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的篩選方法的具體步驟如下:
1、煙草乙烯不敏感種質(zhì)的高通量初步篩選
本發(fā)明以通過EMS誘變獲得的自交二代種子為篩選和鑒定材料，也可以以其它誘變或未經(jīng)誘變的煙草為待篩選的原材料，以煙草野生型種子(野生型為煙草在野生環(huán)境下正常生長形成的種子)為對照，按以下步驟進(jìn)行篩選:
(I)表面消毒:分別取大約50粒每種待篩選的煙草種子與野生型材料的種子于1.5 ml離心管中，加900 μ I的無菌水、100 μ I 10%的次氯酸鈉，37°C 200 rpm震蕩I h后用無菌水沖洗6次。
[0011](2)低溫處理:將已消毒的煙草種子點播在1/2 MS+100 μΜ ACC的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 do
[0012]ACC培養(yǎng)基的配制方法:不加蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基(PH為5.8 )經(jīng)高壓滅菌(121 °C，15-20 min)后冷卻至50-60 °C，加入過濾除菌的ACC (1-氨基環(huán)丙烷_1_羧酸，SigmaAldrich)使其終濃度達(dá)到100 μΜ。
[0013](3)光照催芽與暗培養(yǎng):結(jié)束低溫處理后，于25°C光照培養(yǎng)10 h，以促使種子整齊萌發(fā)；之后將其于此溫度下避光暗培養(yǎng)5-6 do
[0014](4)乙烯不敏感種質(zhì)的鑒別:煙草野生型出現(xiàn)典型的“三重反應(yīng)”的表型，即幼苗的主根變短，下胚軸縮短變粗，子葉形成特別的頂鉤。觀察煙草不敏感種質(zhì)，其“三重反應(yīng)”呈現(xiàn)不明顯的表型特征:頂鉤缺失，下胚軸變長，主根有所生長，如圖1所示(野生型WT，待篩選株系 #1304，1244，1594，1329)。
[0015]2、“乙烯不敏感-耐寒”復(fù)合種質(zhì)的篩選
以篩選出的乙烯不敏感種質(zhì)的煙草種子為測試材料，以煙草野生型種子為對照，按以下步驟進(jìn)行篩選:
(I)表面消毒:分別取大約50粒上述煙草乙烯不敏感種質(zhì)與野生型材料的種子于1.5ml離心管中，加900 μ I的無菌水、100 μ I 10%的次氯酸鈉，37°C 200 rpm震蕩I h后用無菌水沖洗6次。
[0016](2)低溫處理:將已消毒的煙草種子點播在1/2 MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4°C，黑暗培養(yǎng)3 do
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