一種用于高通量細(xì)胞遷移研究的方法和細(xì)胞遷移研究系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于高通量細(xì)胞遷移研究的方法和細(xì)胞遷移研究系統(tǒng)，采用細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，得到貼壁生長的細(xì)胞群。將貼壁生長的細(xì)胞群放在遷移測試器件中的遷移測試腔室中培養(yǎng)，獲取細(xì)胞生長過程中的圖片，以通過圖片記錄的細(xì)胞群的生長所覆蓋的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞遷移的遷移距離。采用本發(fā)明提供的細(xì)胞遷移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞遷移研究，通過細(xì)胞群體限制腔室得到貼壁生長的細(xì)胞群，再通過對遷移測試腔室中細(xì)胞生長的圖片的獲取，這種研究方法具有極高的可重復(fù)性，并能通過圖像處理將細(xì)胞的遷移能力定量化。
【專利說明】
一種用于高通量細(xì)胞遷移研究的方法和細(xì)胞遷移研究系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微加工與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于高通量細(xì)胞迀移研究的方法和細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞迀移與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，而細(xì)胞迀移受到多種外部環(huán)境因素和內(nèi)部因素的共同影響。對于細(xì)胞迀移的相關(guān)研究，一方面能夠讓我們對細(xì)胞迀移行為有更多的認(rèn)識，另一方面，對于腫瘤等和細(xì)胞迀移關(guān)系密切疾病的治療探索，具有重要價值。
[0003]傳統(tǒng)的生物學(xué)方法中關(guān)于細(xì)胞體外迀移實(shí)驗(yàn)中主要有劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲試驗(yàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法，劃痕實(shí)驗(yàn)雖然簡單，但可重復(fù)性差，且劃痕的過程會對細(xì)胞造成損傷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也無法將細(xì)胞增殖和迀移的作用進(jìn)行區(qū)分;侵襲試驗(yàn)，一方面穩(wěn)定濃度梯度的環(huán)境難以維持，另一方面，無法將細(xì)胞增殖和迀移的作用進(jìn)行區(qū)分。然而，對于現(xiàn)有的微流控芯片，不適用于樣品的高通量篩選，也無法細(xì)胞的增殖和迀移的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何制作一種結(jié)構(gòu)簡單、適于樣品的高通量篩選的系統(tǒng)，以及一種將細(xì)胞的增殖和迀移進(jìn)行區(qū)分的細(xì)胞迀移測試方法。
[0005]針對該問題，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，包括:細(xì)胞布置器件和迀移測試器件；
[0006]所述細(xì)胞布置器件中包括至少一個第一通孔，每一所述第一通孔的一端均設(shè)置有底盤，所述底盤上設(shè)置有至少一個第二通孔；
[0007]所述第二通孔作為細(xì)胞群體限制腔室，用于劃定貼壁細(xì)胞的生長形態(tài)；
[0008]所述迀移測試器件中包括至少一個第三通孔，所述第三通孔作為迀移測試腔室，用于對在細(xì)胞群體限制腔室中完全貼壁的細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)胞迀移研究。
[0009]優(yōu)選地，所述底盤上設(shè)置有至少兩個相同的第二通孔。
[0010]優(yōu)選地，所述第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形。
[0011]優(yōu)選地，所述第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑0.20-0.30mm的圓形。
[0012]優(yōu)選地，所述第一通孔和所述第三通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形、矩形或者多邊形。
[0013]優(yōu)選地，所述第一通孔沿著軸向方向的孔深為2_3mm，所述第三通孔沿著軸向方向的孔深大于等于3mm。
[0014]優(yōu)選地，所述細(xì)胞布置器件和迀移測試器件由PDMS形成。
[0015]另外，本發(fā)明還提供了一種使用上述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞迀移研究的方法，包括:
[0016]將所述細(xì)胞布置器件的底盤與潔凈的培養(yǎng)皿粘附后，對所述細(xì)胞布置器件進(jìn)行等離子體處理，向所述第一通孔內(nèi)加入細(xì)胞懸浮液；
[0017]在所述細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞沉入所述細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室中后，吸出所述第一通孔內(nèi)剩余的細(xì)胞懸浮液，以使沉入到所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁；
[0018]所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁后，將所述細(xì)胞布置器件去掉，更換為所述迀移測試器件，在所述迀移測試器件中加入預(yù)先準(zhǔn)備的培養(yǎng)基，以使完全貼壁的細(xì)胞群體在所述培養(yǎng)基中增殖和迀移；
[0019]每隔預(yù)設(shè)時間段，對完全貼壁的細(xì)胞在所述迀移測試器件中的生長進(jìn)行拍照，以通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移距離。
[0020]優(yōu)選地，所述通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移數(shù)據(jù)，包括:
[0021]在對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片中，將每一完全貼壁的細(xì)胞中的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域劃分為生長區(qū)域和迀移區(qū)域；
[0022]獲取所述迀移區(qū)域中的每一點(diǎn)與所述生長區(qū)域的圓心之間距離的平均值，計(jì)算所述平均值與所述生長區(qū)域所在圓的半徑之間的差值，以作為所述迀移距離；
[0023]其中，所述生長區(qū)域是包含所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的最大的連通區(qū)域，且以所述最大連通區(qū)域的質(zhì)心為圓心的圓中半徑最小的圓，所述迀移區(qū)域是由所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域中不包括所述生長區(qū)域的區(qū)域。
[0024]本發(fā)明提供的用于高通量細(xì)胞迀移研究的方法和細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)中，采用細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，得到貼壁生長的細(xì)胞群。將貼壁生長的細(xì)胞群放在迀移測試器件中的迀移測試腔室中培養(yǎng)，獲取細(xì)胞生長過程中的圖片，以通過圖片記錄的細(xì)胞群的生長所覆蓋的區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞迀移的迀移距離。采用本發(fā)明提供的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞迀移研究，通過細(xì)胞群體限制腔室得到貼壁生長的細(xì)胞群，再通過對迀移測試腔室中細(xì)胞生長的圖片的獲取，這種研究方法具有極高的可重復(fù)性，并能通過圖像處理將細(xì)胞的迀移能力定量化。
【附圖說明】
[0025]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0026]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞布置器件的俯視圖的示意圖；
[0027]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的迀移測試意見的俯視圖的示意圖；
[0028]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞布置器件中的每一個第一通孔和底盤的結(jié)構(gòu)的俯視圖和側(cè)視圖；
[0029]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的迀移測試器件中的每一個第三通孔的俯視圖和側(cè)視圖；
[0030]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的MCF-7細(xì)胞在迀移測試腔室中生長的形態(tài)圖片和圖像處理方法示意圖，其中，(a)是零時刻的細(xì)胞群落的形態(tài)示意圖，(b)和(C)分別是23h時在1%的FBS條件下和在10%的FBS條件下的細(xì)胞群落的形態(tài)示意圖，(d)是迀移距離計(jì)算示意圖；
[0031]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同濃度FBS條件下MCF-7細(xì)胞增殖和迀移的示意圖，其中，(e)是不同濃度FBS條件下MCF-7細(xì)胞增殖變化示意圖，(f)是不同濃度FBS條件下MCF-7細(xì)胞迀移距離示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0033]本實(shí)施例提供了一種細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，包括:如圖1中所示的細(xì)胞布置器件010和如圖2中所示的迀移測試器件020;
[0034]細(xì)胞布置器件010中包括至少一個第一通孔011，每一第一通孔的一端均設(shè)置有底盤，底盤上設(shè)置有至少一個第二通孔012;
[0035]第二通孔012作為細(xì)胞群體限制腔室，用于劃定貼壁細(xì)胞的生長形態(tài)；
[0036]迀移測試器件020中包括至少一個第三通孔021，第三通孔021作為迀移測試腔室，用于對在細(xì)胞群體限制腔室中完全貼壁的細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)胞迀移研究。
[0037]進(jìn)一步的，底盤上設(shè)置有至少兩個相同的第二通孔012。
[0038]細(xì)胞群體限制腔室可以是一個，當(dāng)然，為了提高實(shí)驗(yàn)的精確性，可以在一個底盤上制作多個尺寸和形狀相同的第二通孔，以進(jìn)行多組平行實(shí)驗(yàn)。如圖1中所示，每一個底盤上均設(shè)置有4個第二通孔012。
[0039]進(jìn)一步地，第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形。
[0040]可理解的是，第二通孔作為細(xì)胞群體限制腔室，其沿著徑向方向的截面形狀可以是矩形、多邊形、圓形等，只要保證作為同一組平行實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞群體限制腔室沿著徑向方向的截面形狀和尺寸相同即可。當(dāng)然，沿著徑向方向的截面形狀為圓形的第二通孔更加易于制造，且由于不存在尖角，避免了細(xì)胞群體限制腔室的室壁中的尖角對細(xì)胞生長的影響。
[0041]進(jìn)一步地，第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑0.20-0.30_的圓形。
[0042]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞布置器件中的每一個第一通孔和底盤的結(jié)構(gòu)的俯視圖和側(cè)視圖。參見圖3，該細(xì)胞布置器件上的第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑為d的圓形，第二通孔的孔深為h，例如，第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑d = 0.25_的圓，第二通孔的孔深h=100ym的通孔。相鄰的細(xì)胞群體限制腔室之間的距離不小于
0.8_，以防止在迀移測試腔室中生長的細(xì)胞互相干擾。
[0043]進(jìn)一步地，所述第一通孔和所述第三通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形、矩形或者多邊形。
[0044]可理解的是，沿著徑向方向的截面形狀為圓形的第一通孔和第三通孔更加易于制造和清洗。
[0045]進(jìn)一步地，所述第一通孔沿著軸向方向的孔深為2_3mm，所述第三通孔沿著軸向方向的孔深大于等于3_。
[0046]如圖3所示，第一通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑為D的圓形，第一通孔的孔深為H，例如，第一通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑D = 4mm的圓，第一通孔的孔深H =3mm的通孔。
[0047]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的迀移測試器件中的每一個第三通孔的俯視圖和側(cè)視圖。參見圖4，該迀移測試器件上設(shè)置有第三通孔，所述第三通孔作為迀移測試腔室，用于對在細(xì)胞群體限制腔室中完全貼壁的細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)胞迀移研究。
[0048]如圖4所示，第三通孔的直徑為D’，D’=5mm，第三通孔大于第二通孔，以為在細(xì)胞群體限制腔室中貼壁生長的細(xì)胞提供足夠的迀移空間。第三通孔的孔深不小于3_。
[0049]進(jìn)一步地，所述細(xì)胞布置器件和迀移測試器件由PDMS(聚二甲基氧烷)形成。
[0050]作為一種具體的實(shí)施例，這種細(xì)胞布置器件中包含有4個獨(dú)立的細(xì)胞群體限制腔室，以通過外界的腔室限制，來劃定貼壁細(xì)胞的生長形態(tài)。細(xì)胞布置器件加工材料為PDMS(聚二甲基硅氧烷)以及細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞群體限制腔室的形狀可以有多種形式，如正方形，矩形，圓形，多邊形。細(xì)胞群體限制腔室的第一通孔的直徑4_左右，厚度3mm左右，每個細(xì)胞群體限制腔室直徑為0.25mm，厚度為0.1mm;相鄰細(xì)胞群體限制腔室之間的距離為0.8mm左右，當(dāng)然，相鄰細(xì)胞群體限制腔室之間的距離可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。
[0051 ]作為后續(xù)培養(yǎng)的迀移測試腔室的直徑5mm左右，厚度3mm以上；在同一塊形成迀移測試器件的材料上可以制作多個細(xì)胞迀移測試腔室，只要在將細(xì)胞群體限制腔室更換為細(xì)胞迀移測試腔室時，將每個迀移測試腔室的第三通孔的在培養(yǎng)皿上的圓心和第一通孔在培養(yǎng)皿上的圓心所在位置對應(yīng)即可，在同迀移測試器件上，不同的迀移測試腔室之間的距離為6_，當(dāng)然，不同的迀移測試腔室之間的距離可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。
[0052]本實(shí)施例提供了一種使用上述細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞迀移研究的方法；
[0053]將細(xì)胞布置器件的底盤與潔凈的培養(yǎng)皿粘附后，對細(xì)胞布置器件進(jìn)行等離子體處理，向所述第一通孔內(nèi)加入細(xì)胞懸浮液；
[0054]在所述細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞沉入所述細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室中后，吸出所述第一通孔內(nèi)剩余的細(xì)胞懸浮液，以使沉入到所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁；
[0055]所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁后，將所述細(xì)胞布置器件去掉，換為所述迀移測試器件，在所述迀移測試器件中加入預(yù)先準(zhǔn)備的培養(yǎng)基，以使完全貼壁的細(xì)胞群體在所述培養(yǎng)基中增殖和迀移；
[0056]每隔預(yù)設(shè)時間段，對完全貼壁的細(xì)胞在所述迀移測試器件中的生長進(jìn)行拍照，以通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移距離。
[0057]進(jìn)一步地，所述通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移數(shù)據(jù)，包括:
[0058]在對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片中，將每一完全貼壁的細(xì)胞中的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域劃分為生長區(qū)域和迀移區(qū)域；
[0059]獲取所述迀移區(qū)域中的每一點(diǎn)與所述生長區(qū)域的圓心之間距離的平均值，計(jì)算所述平均值與所述生長區(qū)域所在圓的半徑之間的差值，以作為所述迀移距離；
[0060]其中，所述生長區(qū)域是包含所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的最大的連通區(qū)域，且以所述最大連通區(qū)域的質(zhì)心為圓心的圓中半徑最小的圓，所述迀移區(qū)域是由所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域中不包括所述生長區(qū)域的區(qū)域。
[0061]作為更為具體的實(shí)施例，采用以上細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞迀移研究包括以下步驟:
[0062](I)通過軟光刻的方法制備細(xì)胞群體形態(tài)限制腔室，并與干凈的培養(yǎng)皿底自然粘附；
[0063](2)將步驟(I)中得到的細(xì)胞布置器件，置于真空栗中抽真空Imin左右并進(jìn)行2-1Omin等離子體處理；
[0064](3)將細(xì)胞懸液加入各個細(xì)胞群體形態(tài)限制腔室，30min后吸去懸液，沉入0.25mm孔中的細(xì)胞不會被吸出；細(xì)胞貼壁后，去掉限制腔室，換用迀移測試器件，并與已經(jīng)貼壁細(xì)胞--對位。
[0065](4)在每個迀移觀測腔室加入含有待測物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液，以得到待測物質(zhì)對細(xì)胞迀移的影響。
[0066](5)每隔一段時間，進(jìn)行拍照，記錄細(xì)胞擴(kuò)增過程，通過圖像處理，高通量定量得到細(xì)胞的增殖和迀移。
[0067]舉例來說，應(yīng)用細(xì)胞布置器件和迀移測試器件實(shí)現(xiàn)對MCF-7乳腺癌細(xì)胞在不同濃度胎牛血清(FBS)條件下的迀移研究具體過程如下:
[0068](I)細(xì)胞群體形態(tài)限制。
[0069]把細(xì)胞布置器件放入培養(yǎng)皿中，使其底部(底盤部分)與皿底緊密貼貼合之后，將細(xì)胞懸液加入第一通孔中，以使細(xì)胞懸液進(jìn)入各個細(xì)胞群體限制腔室中，每個細(xì)胞群體限制腔室大約能容納0.02ml的懸液。為了保證細(xì)胞貼壁后能在細(xì)胞群體限制腔室底部形成緊密排列的單層細(xì)胞，細(xì)胞懸液中細(xì)胞的濃度需控制在50-100萬/ml，也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。加入細(xì)胞30min后，細(xì)胞會沉到孔底，此時將懸液吸出，換上無細(xì)胞的培養(yǎng)基，沉到
0.25mm的第二通孔中的細(xì)胞不會被吸出來，而細(xì)胞群體限制腔室外面的細(xì)胞大多會被吸走。加入細(xì)胞2_4h后，細(xì)胞會開始貼壁。加入細(xì)胞8-12h后，0.25mm孔中的細(xì)胞會完全貼壁形成不規(guī)則的多邊形。
[0070](2)細(xì)胞培養(yǎng)及迀移測試。
[0071]待細(xì)胞完全貼壁之后，將整塊細(xì)胞布置器件(包括上下兩層，也就是第一通孔和底盤)一起揭掉，并換上迀移測試器件(5mm孔的迀移測試腔室)，小心對正(第三通孔在培養(yǎng)皿上的孔中心與第一通孔在培養(yǎng)皿上的控中心對應(yīng))并使底部與皿底貼合，之后在各個孔中加入不同條件的培養(yǎng)基。每個孔大約能容納0.06ml左右的培養(yǎng)基。
[0072]由于在將細(xì)胞布置器件換成迀移測試腔室的過程中細(xì)胞容易干死，所以操作要非常迅速，或者在揭掉細(xì)胞布置器件后盡快用排槍在各個孔的位置滴加0.003ml左右基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無血清，對之后的研究影響很小)，再換上迀移測試腔室(5mm孔的迀移測試腔室)。換好迀移測試腔室并添加不同條件的培養(yǎng)基之后，將培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱，并將此時記為零時刻，對細(xì)胞進(jìn)行長期的培養(yǎng)和觀測。在零時刻，細(xì)胞會集中在直徑0.25_的圓形區(qū)域內(nèi)，形成一個群體，隨后會由于增殖和迀移而慢慢向外擴(kuò)增。每隔幾個小時拍一張圖片，記錄細(xì)胞群體擴(kuò)增的過程。
[0073]如圖5所示，(a)是零時刻的細(xì)胞群落的形態(tài)示意圖，(b)和(C)分別是23h時在I%的FBS條件下和在10%的FBS條件下的細(xì)胞群落的形態(tài)示意圖，可以看出，零時刻細(xì)胞群落基本沒有迀移，23小時后在1%的FBS條件下的細(xì)胞群落比10%的FBS條件下的細(xì)胞群落更容易發(fā)生迀移。
[0074](3)數(shù)據(jù)處理，定量得到細(xì)胞迀移數(shù)據(jù)。
[0075]得到的實(shí)驗(yàn)圖像如圖5中的(d)所示，將有細(xì)胞區(qū)域的面積S-cell(圖5的(d)中除了黑色區(qū)域之外的區(qū)域)定義為細(xì)胞的增殖水平。在定義細(xì)胞的迀移能力時，先做一個無迀移假設(shè)，即假設(shè)細(xì)胞在整個過程中沒有迀移，而是相互緊挨著向外生長。這種情況就相當(dāng)于把所有細(xì)胞聚在一個圓內(nèi)，也就是圖5的(d)中的圓(生長區(qū)域)的區(qū)域內(nèi)，圓的半徑記為Rgrmrth,圓心是有細(xì)胞區(qū)域中最大連通域的質(zhì)心。
[0076]對于圓外的細(xì)胞(圖5的(d)的圓之外，非黑色的區(qū)域)，可以認(rèn)為它們完全是迀移出去的，這部分區(qū)域叫做迀移區(qū)域。因而迀移區(qū)域的所有像素點(diǎn)到圓心的距離Rt-1的平均值減去圓的半徑Rgr?th，得到一個長度量Dmigratlcin，那么這個量就可以作為衡量細(xì)胞迀移水平的指標(biāo)，也可以稱作迀移距離，即:
[0077]Dmigrat1n — ΜθβΠ(Rtotal ) _Rgrowth
[0078]Mean(Rtcital)是迀移區(qū)域中的每一像素點(diǎn)到圓心的距離的平均值，圖5中的(d)中的Rtcltal(i)和Rtcltal(j)表示迀移區(qū)域中的第i個像素點(diǎn)和第j個像素點(diǎn)到圓心的距離。
[0079]需要注意的是，這里的增殖水平和迀移水平表示的都是視野中整個細(xì)胞群體的平均行為。另外，考慮到不同實(shí)驗(yàn)組的初始值各不相同，所以需要對結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。
[0080](4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0081 ]圖5中展示了部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。10%FBS對照組是正常培養(yǎng)條件(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%抗生素+10%FBS)，23h后如圖5中的(c)所示，細(xì)胞相互緊挨著向外生長，幾乎沒有任何迀移(連續(xù)的觀測也可證明細(xì)胞群落完全是由于增殖而迀移的，但我們在分析時沒有使用連續(xù)觀測的數(shù)據(jù))；1%FBS實(shí)驗(yàn)組是饑餓培養(yǎng)條件，23h后如圖5中的(b)所示，細(xì)胞除了增殖之外，還有明顯的向外迀移的現(xiàn)象；另外還有一個0.1%FBS的對照組(圖5中未示出)，近似于無血清的對照，這種條件下細(xì)胞活性很差，迀移和增殖都很微弱。這些定性的結(jié)果與我們的預(yù)期是相符的。
[0082]經(jīng)過圖像處理之后可以得到定量的結(jié)果，如圖6所示中的(e)和(f)所示。0.1%FBS條件下細(xì)胞活性很差，所以無論是增殖水平還是迀移水平幾乎都沒有什么變化。對于增殖來說，F(xiàn)BS濃度越高，細(xì)胞的增殖也就越快。而對于迀移來說，細(xì)胞在饑餓的培養(yǎng)條件下會有更強(qiáng)的迀移能力。圖6中的(e)的橫坐標(biāo)為Time(時間)，單位是h(小時)，縱坐標(biāo)為Normalized Area of Cells(細(xì)胞歸一化面積)，反應(yīng)了細(xì)胞的增殖水平，圖6中的(f)的橫坐標(biāo)為Time(時間)，單位是h(小時)，縱坐標(biāo)為Normalized Migrat1n Distance(細(xì)胞歸一化迀移距離)，反應(yīng)了細(xì)胞的迀移水平。
[0083]第三方面，本發(fā)明還提供了一種制作細(xì)胞布置器件的方法，包括:
[0084]通過構(gòu)圖工藝在預(yù)設(shè)的第一硅片上形成與所述第一通孔對應(yīng)的凸臺，以作為形成所述第一通孔的第一模具；
[0085]以所述第一模具為成形工具，通過注模工藝得到具有與所述第一通孔對應(yīng)的凹痕的第一未成形器件，去除所述第一未成形器件中凹痕內(nèi)的部分，以得到所述第一通孔；
[0086]通過構(gòu)圖工藝在預(yù)設(shè)的第二硅片上形成與所述第二通孔對應(yīng)的凸臺，以作為形成所述第二通孔的第二模具；
[0087]以所述第二模具為成形工具，通過旋涂工藝，形成具有所述第二通孔的底盤；
[0088]將所述底盤固定在所述第一通孔的一端，以得到具有所述細(xì)胞群體限制腔室的細(xì)胞布置器件。
[0089]進(jìn)一步地，所述將所述底盤固定在所述第一通孔的一端，以得到具有所述細(xì)胞群體限制腔室的細(xì)胞布置器件，包括:
[0090]將所述底盤貼在所述第一通孔的一端后，放入烘箱烘烤預(yù)設(shè)時長，以使所述底盤粘接在所述第一通孔的一端。
[0091]第四方面，本實(shí)施例還提了迀移測試器件的制作方法，包括:
[0092]通過構(gòu)圖工藝在預(yù)設(shè)的第三硅片上形成與所述第三通孔對應(yīng)的凸臺，以作為形成所述第三通孔的第三模具；
[0093]以所述第三模具為成形工具，通過注模工藝得到具有與所述第三通孔對應(yīng)的凹痕的第二未成形器件，去除所述第二未成形器件中凹痕內(nèi)的部分，以得到所述第三通孔。
[0094]具體地，細(xì)胞布置器件和迀移測試器件的制作方法包括:
[0095](I)模具的制備。用L-Edit繪圖，將第一通孔、第二通孔的形狀打印在塑料膠片或光學(xué)掩膜上，作為曝光掩模，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？偣残枰龎K硅片模具，兩塊用于制作細(xì)胞群體形態(tài)限制腔室，一塊用于制作細(xì)胞培養(yǎng)及迀移測試腔室。三塊模具制備過程基本一致，只是掩膜有差異。使用SU8-3050膠，勻膠時以500rpm的轉(zhuǎn)速預(yù)甩10s，再以100rpm的轉(zhuǎn)速甩30s，光刻膠厚度0.2mm左右。在95度電熱板上烘30min后，放入曝光機(jī)進(jìn)行曝光，曝光時間需要參照曝光機(jī)的幫助文檔以及實(shí)際光強(qiáng)來確定。之后再在95度電熱板上烘30min，顯影就可以得到模具。
[0096](2)細(xì)胞布置器件和迀移測試器件的制作。細(xì)胞布置器件中的第一通孔和細(xì)胞迀移測試腔室中的第三通孔，都是通過TOMS注模得到的，前者需要A膠(基質(zhì))與B膠(固化劑)的配比為9:1-10:1，后者需要7:1-10:1，他們的厚度都在3_以上。細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室是通過I3DMS旋涂得到的，A、B膠配比為9:1-10:1，在勻膠機(jī)中以1500rpm的轉(zhuǎn)速甩30s，可以得到厚度約為0.1mm的PDMS薄膜。固化時先將三塊模具放入70度烘箱中烘30min，之后取出細(xì)胞群體形態(tài)限制腔室的兩塊模具，此時PDMS已經(jīng)固化。在從模具上取下來的具有與4mm孔對應(yīng)的凹痕的PDMS上用4mm打孔器打孔，小心地將只有第一通孔的細(xì)胞布置器件孔對孔貼在底盤上上，放入烘箱中烘過夜，PDMS會繼續(xù)固化，第一通孔和底盤會粘在一起。
[0097](3)細(xì)胞布置器件的表面改性。在向4mm孔(細(xì)胞布置器件上的第一通孔)中加入細(xì)胞之前，需要進(jìn)行Imin的抽真空和2-10min的等離子體處理，以防止細(xì)胞布置器件放入二氧化碳培養(yǎng)箱(37度)之后內(nèi)部溶解的氣體會受熱膨脹產(chǎn)生氣泡，同時可以使疏水的PDMS表面變?yōu)橛H水，從而能夠順利地將細(xì)胞注入而不會在底部產(chǎn)生氣泡。5mm的第三通孔(迀移測試器件)不需要做這樣的處理。需要注意的是等離子體處理之后PDMS會慢慢恢復(fù)為疏水，所以這一步需要在迀移實(shí)驗(yàn)開始前30min內(nèi)進(jìn)行。
[0098]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，包括:細(xì)胞布置器件和迀移測試器件； 所述細(xì)胞布置器件中包括至少一個第一通孔，每一所述第一通孔的一端均設(shè)置有底盤，所述底盤上設(shè)置有至少一個第二通孔； 所述第二通孔作為細(xì)胞群體限制腔室，用于劃定貼壁細(xì)胞的生長形態(tài)； 所述迀移測試器件中包括至少一個第三通孔，所述第三通孔作為迀移測試腔室，用于對在細(xì)胞群體限制腔室中完全貼壁的細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)胞迀移研究。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述底盤上設(shè)置有至少兩個相同的第二通孔。3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形。4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述第二通孔沿著徑向方向的截面形狀為直徑0.20-0.30mm的圓形。5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述第一通孔和所述第三通孔沿著徑向方向的截面形狀為圓形、矩形或者多邊形。6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述第一通孔沿著軸向方向的孔深為2-3_，所述第三通孔沿著軸向方向的孔深大于等于3_。7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞布置器件和迀移測試器件由PDMS形成。8.—種使用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞迀移研究系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞迀移研究的方法，其特征在于，包括: 將所述細(xì)胞布置器件的底盤與潔凈的培養(yǎng)皿粘附后，對所述細(xì)胞布置器件進(jìn)行等離子體處理，向所述第一通孔內(nèi)加入細(xì)胞懸浮液； 在所述細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞沉入所述細(xì)胞布置器件中的細(xì)胞群體限制腔室中后，吸出所述第一通孔內(nèi)剩余的細(xì)胞懸浮液，以使沉入到所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁； 所述細(xì)胞群體限制腔室中的細(xì)胞完全貼壁后，將所述細(xì)胞布置器件去掉，更換為所述迀移測試器件，在所述迀移測試器件中加入預(yù)先準(zhǔn)備的培養(yǎng)基，以使完全貼壁的細(xì)胞群體在所述培養(yǎng)基中增殖和迀移； 每隔預(yù)設(shè)時間段，對完全貼壁的細(xì)胞在所述迀移測試器件中的生長進(jìn)行拍照，以通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移距離。9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，其特征在于，所述通過對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片研究細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中的迀移數(shù)據(jù)，包括: 在對所述迀移測試器件中的細(xì)胞拍照得到的圖片中，將每一完全貼壁的細(xì)胞中的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域劃分為生長區(qū)域和迀移區(qū)域； 獲取所述迀移區(qū)域中的每一點(diǎn)與所述生長區(qū)域的圓心之間距離的平均值，計(jì)算所述平均值與所述生長區(qū)域所在圓的半徑之間的差值，以作為所述迀移距離； 其中，所述生長區(qū)域是包含所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的最大的連通區(qū)域，且以所述最大連通區(qū)域的質(zhì)心為圓心的圓中半徑最小的圓，所述迀移區(qū)域是由所述完全貼壁的細(xì)胞生長所覆蓋的區(qū)域中不包括所述生長區(qū)域的區(qū)域。
【文檔編號】C12M1/00GK106047665SQ201610617882
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】羅春雄, 張榮飛, 張書文, 楊根, 王宇鋼, 歐陽頎
【申請人】北京大學(xué)