專利名稱：生產(chǎn)重組人的甲狀旁腺激素的酵母轉(zhuǎn)化株及其用于生產(chǎn)該激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人的甲狀旁腺激素(以下簡(jiǎn)稱為hPTH)的生產(chǎn)。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及運(yùn)用啤酒酵母的突變菌株生產(chǎn)人的甲狀旁腺激素，其中該突變菌株中能編碼天冬氨酸蛋白酶yapsin家系YPS1，YPS2及YPS3的至少一個(gè)基因被阻斷，并且被載有一個(gè)hPTH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
例如，由于原核生物有相對(duì)高的表達(dá)效率，因此曾經(jīng)有許多的研究人員嘗試運(yùn)用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)重組hPTH。然而運(yùn)用大腸桿菌生產(chǎn)重組蛋白過(guò)程中，很難進(jìn)行蛋白質(zhì)分子的再折疊及純化。相反，酶母是一種單細(xì)胞的真核生物，它與高級(jí)物種在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)分泌的體系方面很相似，所以用酵母做為宿主細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是可以正確地表達(dá)和分泌折疊后的蛋白及活性蛋白。而且，酵母幾乎不分泌細(xì)胞外蛋白，這個(gè)特點(diǎn)使得人們很容易回收和純化外源性蛋白，因此酵母是適宜做生產(chǎn)重組蛋白的宿主細(xì)胞。況且，啤酒酵母是一種美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)確定的一般認(rèn)為安全的微生物，它對(duì)人體無(wú)害且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素。由于上述原因，啤酒酵母一直以來(lái)被當(dāng)做hPTH的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行研究。然而，盡管作為生產(chǎn)重組hPTH的表達(dá)宿主細(xì)胞，啤酒酵母具有很多的優(yōu)點(diǎn)，但是該酵母無(wú)法在工業(yè)上應(yīng)用，原因是酵母本身所具有的蛋白水解酶會(huì)降解它所分泌的細(xì)胞外重組hPTH，因此只能回收到少量的完整的hPTH分子(Gabrielsen et al.，Gene 90,255(1990))。
在過(guò)去的十年中，人們已經(jīng)對(duì)如何解決重組hPTH的蛋白水解酶問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究。例如，人們發(fā)現(xiàn)hPTH在Arg-25和Lys-26之間被剪切，該剪切的位點(diǎn)與酵母高爾基體中的一種蛋白酶KEX2的識(shí)別位點(diǎn)是一致的，在這些認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，人們構(gòu)建了一個(gè)hPTH替代的突變株，在該突變株氨基酸序列的第26位點(diǎn)處由谷氨酸取代了賴氨酸，目的是防止KEX2降解蛋白質(zhì)，而KEX2是一個(gè)假設(shè)的剪切hPTH的蛋白酶(Reppe et al.，J.Biol.Chem.266，14198(1991))。運(yùn)用基因重組技術(shù)，把一個(gè)hPTH相關(guān)蛋白直接連接到酵母泛素基因的3’端來(lái)生產(chǎn)一個(gè)不可切斷的hPTH相關(guān)蛋白(Rian et al.，Eur.J.Biochem.，213，641(1993))。然而，如果作為醫(yī)藥使用的話，這種生產(chǎn)蛋白的突變株通常被認(rèn)為是新藥，因此，需要進(jìn)行一些應(yīng)急性的試驗(yàn)以獲得藥物使用的許可權(quán)。使用基因融合技術(shù)時(shí)，需要去除基因上的融合位點(diǎn)，因?yàn)樵撐稽c(diǎn)的存在使得hPTH的產(chǎn)量相對(duì)地低。
在不使用hPTH蛋白突變株或是融合技術(shù)來(lái)防止hPTH降解的基礎(chǔ)上，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的方法，即在培養(yǎng)基上加入L-精氨酸達(dá)到高濃度，這樣就可以顯著地抑制hPTH的分解(Chung and Park，Biotechnol.Bioeng.57，245(1998))。上述事實(shí)表明，hPTH的分解主要是由于細(xì)胞外蛋白酶的作用而不是細(xì)胞內(nèi)蛋白酶Kex2p的作用。通過(guò)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，研究人員推斷Yap3p(酵母天冬氨酸蛋白酶3)與KEX2一樣可以切斷單個(gè)或兩個(gè)氨基酸的C端或中間位點(diǎn)，然后連接到酵母細(xì)胞質(zhì)的膜上，使得hPTH分解后分泌到酵母的培養(yǎng)基上。在這個(gè)推論的基礎(chǔ)上，研究人員又構(gòu)建了YAP3基因阻斷酵母株(yap3Δ)，運(yùn)用該株系構(gòu)建了一個(gè)hPTH生產(chǎn)系統(tǒng)。通過(guò)在燒瓶里培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)生產(chǎn)系統(tǒng)有效性最高可達(dá)80％地防止hPTH的分解，因此可以大量地生產(chǎn)完整的hPTH分子(Kang et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，187(1998)；Korean Pat.No.0246932，yielded Dec.8，1999)。但是，盡管生產(chǎn)hPTH的效率要遠(yuǎn)比野生株系高出許多，人們又發(fā)現(xiàn)在高濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)的后期，YAP3Δ突變株卻使得hPTH被大量分解(Song and Chung，Process Biochem 35，503(2000))，這表明在培養(yǎng)后期，hPTH不是被Yap3p所分解，而是被其他的蛋白酶所分解。有人報(bào)道在啤酒酵母中發(fā)現(xiàn)了天冬氨酸蛋白酶MKc7p，該酶的結(jié)構(gòu)和功能類似于Yap3p(Komano and Fuller，Proc Natl AcadSci，USA，92，10752(1995))。研究人員創(chuàng)造了一個(gè)兩個(gè)基因都被阻斷的酵母株系(yap3Δ/mkc7Δ)用于觀察在培養(yǎng)階段末期中蛋白酶對(duì)hPTH分解的影響。但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)yap3Δ株與yap3Δ/mkc7A株有什么顯著的區(qū)別(Choi，et al.，J.Microbiol Biotechnol 9，679(1999))。這些發(fā)現(xiàn)表明MKc7p蛋白酶盡管與Yap3p有很高的同源性(53％同源性)，而且參與了在沒(méi)有Kex2p作用的情況下對(duì)pro-a-mating因子的處理，但實(shí)際上并未對(duì)hPTH的分解起很大的作用。
通過(guò)最近揭示的有關(guān)啤酒酵母的基因組的分析，有人對(duì)YAP3(最近被稱為YPS1)的同源基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)除了PEP4和BAR1外還有三種新的基因編碼未知的天冬氨酸蛋白酶(Olsen et al.，Biochem.J.339，407(1999))。假定象編碼天冬氨酸蛋白酶的yapsin家系的新成員的YPS1和YPS2一樣，這三個(gè)基因可以相應(yīng)地命名為YPS3、YPS6、YPS7。YPS3與YPS1和YPS2有50％的同源性，YPS6與BAR1有35％的同源性，而YPS7與PEP4有25％的同源性。從YPS3與YPS1的同源性中，本發(fā)明的研究人員推斷出在yps1Δ株系(前yap3Δ)培養(yǎng)過(guò)程末期，可能是yapsin3的作用，使得hPTH分解。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高效生產(chǎn)hPTH的方法。
有了對(duì)hPTH后翻譯(posttranslational)修飾的了解，使得我們能夠進(jìn)行修飾和改進(jìn)，最后導(dǎo)致了本發(fā)明的產(chǎn)生。
通過(guò)對(duì)hPTH生物學(xué)方法生產(chǎn)的深入而詳盡的研究，本發(fā)明的研究人員發(fā)現(xiàn)，yapsin基因的阻斷會(huì)導(dǎo)致hPTH啤酒酵母重組體的內(nèi)源性降解的顯著下降。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種啤酒酵母突變株，其中YPS1基因和YPS3基因或者所有的YPS1、YPS2及YPS3基因都被阻斷了。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種用啤酒酵母突變株作為生產(chǎn)母體來(lái)生產(chǎn)hPTH的方法。


圖1.是構(gòu)建一個(gè)用pop-out URA3選擇性標(biāo)記物阻斷YPS3基因的DNA序列組件過(guò)程示意圖。
圖2.是阻斷啤酒酵母YPS3基因及回收URA3選擇性標(biāo)記物過(guò)程示意圖。
圖3.是在培養(yǎng)24小時(shí)(a圖所示)和48小時(shí)(b圖所示)后，來(lái)自下列物質(zhì)的培養(yǎng)物的hPTH分子的變性凝膠電泳SDS-PAGE圖啤酒酵母2805(第1條電泳泳道)，啤酒酵母2805/pG10-hPTH1(第2條電泳泳道和第3條電泳泳道)，啤酒酵母SY28Y3/pG10-hPTH1(第4條電泳泳道和第5條電泳泳道)，啤酒酵母SY28Y4/pG10-hPTH1(第6條電泳泳道和第7條電泳泳道)，(C)表示的是1μg的純hPTH，(M)表示預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物，其中帶i表示完整的hPTH(1-84a.a.)，帶d1表示被截?cái)嗟膆PTH(27-84a.a.)，帶d2代表hPTH(1-80a.a.)。
圖4.在培養(yǎng)了24小時(shí)(a圖所示)和48小時(shí)后(b圖所示)，得自下列物質(zhì)的培養(yǎng)物的hPTH分子變性凝膠電泳SDS-PAGE圖啤酒酵母L3262(第1條電泳泳道)，啤酒酵母L3262/pG10-hPTH1(第2條電泳泳道和第3條電泳泳道)，啤酒酵母SLH15/pG10-hPTH1(第4條電泳泳道和第5條電泳泳道)，啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH1(第6條電泳泳道和第7條電泳泳道)，啤酒酵母SLH17/pG10-hPTH1(第9條電泳泳道和第9條電泳泳道)，啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH1(第10條電泳泳道和第11條電泳泳道)，(C)表示的是1μg的純hPTH的，(M)表示預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物，其中帶i表示完整的hPTH(1-84a.a.)，帶d1表示被截?cái)嗟膆PTH(27-84a.a.)，帶d2代表hPTH(1-80a.a.)。
圖5.是得自下列物質(zhì)的培養(yǎng)物的hPTH分子的SDS-PAGE變性凝膠電泳圖，它們已生長(zhǎng)72小時(shí)，其間向培養(yǎng)基中不停地加半乳糖啤酒酵母L3262(第1條電泳泳道)，YPS1/YPS3雙基因缺陷型啤酒酵母L3262(a圖所示)啤酒酵母L3262/pG10-hPTH1(第2條電泳泳道到第7條電泳泳道)，啤酒酵母SLH11/pG10-hPTH1(第8條電泳泳道到第13條電泳泳道)，啤酒酵母L3262的YPS1/YPS2/YPS3三基因缺陷型啤酒酵母(b圖所示)啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH1(第2條電泳泳道到第7條電泳泳道)，啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH1(第8條電泳泳道到第13條電泳泳道)，(C)表示的是1μg的純hPTH，(M)表示的是預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物，帶i表示完整的hPTH(1-84a.a.)帶d1表示被截?cái)嗟膆PTH(27-84a.a.)，帶d2代表hPTH(1-80a.a.)。
蛋白酶Yapsin1(以下簡(jiǎn)稱為YPS1)，Yapsin2(以下簡(jiǎn)稱為YPS2)或Yapsin3(以下簡(jiǎn)稱為YPS3)具有外蛋白酶活性，可以將hPTH的C端或N端殘基切除，因而使得從酵母細(xì)胞中很難生產(chǎn)完整的hPTH分子。從而，本發(fā)明包括了一種用酶母突變株作為宿主細(xì)胞高產(chǎn)量地生產(chǎn)完整的hPTH分子的方法，該突變株的特點(diǎn)是不能表達(dá)三種蛋白酶YPS1、YPS2及YPS3中的至少一種。
人們認(rèn)為在生產(chǎn)hPTH過(guò)程中，YPS1和YPS2主要是在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株的早期階段起作用，而YPS3則主要在晚期培養(yǎng)階段有分解hPTH的作用。在YPS1基因阻斷的yps1Δ菌株中，由于沒(méi)有YPS1的作用，在培養(yǎng)的早期階段可以大量回收hPTH。但由于YPS3的蛋白水解酶作用，使得在培養(yǎng)后期收獲的hPTH量就很少了。
因此，為了在整個(gè)培養(yǎng)酵母宿主的過(guò)程中提高h(yuǎn)PTH的產(chǎn)量，優(yōu)選地，我們使用了YPS1和YPS3缺陷型突變株(yps1Δ/yps3Δ)，更優(yōu)選地是用YPS1、YPS2和YPS3三基因缺陷型突變株(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)同時(shí)作為宿主細(xì)胞。
通過(guò)使用一種選擇性酶標(biāo)記物，可以從含有YPS1、YPS2及YPS3基因的組中阻斷至少一個(gè)基因就可以使相應(yīng)的酶缺失。
該酵母選擇性標(biāo)記物無(wú)需特別的限制，但是優(yōu)選的是能夠進(jìn)行pop-out的標(biāo)記。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，我們使用一個(gè)盒式的URA3的選擇性標(biāo)記物，這個(gè)pop-out試劑盒包括一種酵母選擇性標(biāo)記物，該標(biāo)記物含有編碼YPS1、YPS2及YPS3的N端和C端的基因片段，這樣酶母基因組中靶基因如yps1、yps2及yps3就可以用同源重組的方法被阻斷。任何可以篩選這種酵母的選擇性標(biāo)記物都可以應(yīng)用。在這里，運(yùn)用URA3選擇性標(biāo)記物阻斷yps3基因得到的突變株yps3Δ標(biāo)記為yps3∷URA3。
按照本發(fā)明，一個(gè)hPTH基因是由一個(gè)表達(dá)載體運(yùn)載到酵母中的。因此，本發(fā)明涉及一個(gè)有hPTH基因鑲嵌的重組表達(dá)載體。這個(gè)適用于本發(fā)明的表達(dá)載體具有在酵母中表達(dá)基因以及控制表達(dá)過(guò)程的手段。載體的選擇及重組載體的構(gòu)建對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，因此將在下面的實(shí)施例中具體地描述。
另一方面，本發(fā)明涉及一個(gè)轉(zhuǎn)化株，該轉(zhuǎn)化株是由yps1Δ/yps3Δ或yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ酵母突變株和重組表達(dá)載體制備的。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，重組載體pG10-hPTH1被轉(zhuǎn)化到啤酒酵母突變株系(yps1Δ/yps3Δ及yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)中，以制備成轉(zhuǎn)化株SLH16/pG10-hPTH及SLH18/pG10-hPTH，該轉(zhuǎn)化株保存在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院(KRIBB)韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)分別為KCTC0815BP和KCTC0816BP，保藏日均為2000年7月6日。
下面將要闡明的實(shí)施例將會(huì)使人們對(duì)本發(fā)明有一個(gè)更加深入的理解，但是下面的實(shí)施例絕非是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒為了在啤酒酵母中表達(dá)hPTH，我們選擇了質(zhì)粒pG10-hPTH1，該質(zhì)粒含有一個(gè)由GAL10啟動(dòng)子∷ppL∷hPTHdb？∷GAL7終止子組成的hPTH表達(dá)DNA序列組件，(Chung and Park，Biotechnol.Bioeng.57,245(1998))。一個(gè)由來(lái)源于pTcUR3的1.8kb的BamHI片斷制成一個(gè)pop-outURA3選擇性標(biāo)記物(URA3∷tc5)盒(kang et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，575-582(2000))。制備YPS3-缺陷型啤酒酵母使用的親本細(xì)胞是啤酒酵母2805和啤酒酵母L3262a(Kang et al.，J.Microbiol.Biotechnol.，8，42-48(1998))。還有，本發(fā)明使用的細(xì)胞是酵母菌株SLH11(Kang et al.，Appl.Micribiol.Biotechnol.，59，187(1998))，SLH12及SLH14(Choi et al.，J.Biosci.Bioengin.，89，77(2000))，上述三個(gè)菌株都是YPS1基因(以前稱為YAP3)缺陷或是YPS2基因(以前稱為MKC7)缺陷，或是兩個(gè)基因都缺陷。上述酵母菌株的生物學(xué)特征總結(jié)在下面的表1中。
表1本發(fā)明使用的啤酒酵母菌株

培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件當(dāng)用URA3盒轉(zhuǎn)化酵母株來(lái)阻斷YPS3基因、或是用表達(dá)載體pG10-hPTH1轉(zhuǎn)化酵母株的時(shí)候，我們使用的是僅在尿嘧啶呈缺陷型的合成培養(yǎng)基SC-URA。為了從獲得的yps3∷URA3突變株回收URA選擇性標(biāo)記物，使用的是一種5-FOA(5-fluorotate)培養(yǎng)基(Adams et al.，Methods in yeast genetics.Cold Spring Harbor Laboratory Press， .)。為了用于在啟動(dòng)子GAL10控制下誘導(dǎo)hPTH表達(dá)過(guò)程，使用的培養(yǎng)基是YPDG(酵母提取物1％，Bacto蛋白胨2％，葡萄糖1％，半乳糖1％)，培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48小時(shí)。實(shí)施例1 構(gòu)建YPS3-缺陷型酵母突變株圖1所示，構(gòu)建一個(gè)包含URA3盒的重組載體，該為了是用于阻斷YPS3基因的。
導(dǎo)致YPS3基因阻斷的同源性重組所需要YPS3基因的N端和C端片段是由PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))通過(guò)使用兩對(duì)引物來(lái)合成的，這兩對(duì)引物是根據(jù)GenBank中注冊(cè)的啤酒酵母的序列合成的。為了便于以后的基因操作，用于擴(kuò)增N端片段的一組引物(5’-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3’及5’-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3’)被設(shè)計(jì)成分別在其5′-端具有EcoRI和BamHI限制性識(shí)別性位點(diǎn)(下劃線位置)，而擴(kuò)增C端片段的一組引物5’-CGCGGATCCCTATGCAGACCAGTGTGG-3’及5’-CGCTCTAGACTGCATGCAAGGTCTGAC-3’)則在其5′-端具有BamHI和XbaI的限制性位點(diǎn)(下劃線位置)。PCR反應(yīng)是在熱循環(huán)的環(huán)境下進(jìn)行的，比如Perkin Elmer公司制造的PCR儀＂GeneAmp PCR 2400＂，具有25個(gè)熱循環(huán)周期，每一個(gè)熱循環(huán)周期都包括95℃/30秒的變性過(guò)程，55℃/30秒的溫?zé)徇^(guò)程，以及72℃/30秒的延伸過(guò)程，這樣就可以從啤酒酵母基因組中分別制備編碼YPS3基因的N端和C端區(qū)域的一個(gè)800個(gè)堿基和一個(gè)700個(gè)堿基的DNA片段。該P(yáng)CR產(chǎn)物、即YPS3基因的N端和C端片段分別被限制性酶EcoRI/BamHI和BamHI/Xba兩次切割，然后把切割完的產(chǎn)物連接到之前已經(jīng)被EcoRI/XbaI處理過(guò)的載體pBluescriptII KS(+)(Stratagen公司生產(chǎn))上。在位于上述重組載體pB-YPS3NC的兩端片段的BamHI識(shí)別位點(diǎn)上，使用URA3 pop-out選擇性標(biāo)志，就構(gòu)建出了用于阻斷YPS3基因的pB-yps3∷URA3tc5載體。
下一步，如圖2所示，使用URA3彈夾來(lái)阻斷啤酒酵母的YPS3基因，然后回收URA3選擇性標(biāo)記物。
詳細(xì)地，把經(jīng)過(guò)限制性酶EcoRI/XbaI處理載體pB-yps3∷URA3tc5后得到的DNA片段轉(zhuǎn)染到啤酒酵母株系2805，L3262a，SLH11(yps1Δ)，SLH12(yps2Δ)及SLH14(ypsΔ/yps2Δ)中，然后在SC-URA篩選培養(yǎng)基上初步篩選Ura+轉(zhuǎn)化株。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)該Ura+轉(zhuǎn)化株中是否阻斷了YPS3基因，然后把篩選出的yps3∷URA3tc5轉(zhuǎn)化株涂到5-FOA板上，篩選通過(guò)同源性重組技術(shù)得到的URA3基因pop-out的yps3∷tc克隆。
然后再用PCR來(lái)標(biāo)識(shí)在最后得到的yps3Δ突變株中的YPS3基因阻斷，以得到y(tǒng)ps3缺陷株S28Y4，SLH15，SLH16，SLH17以及SLH18，上述菌株的其他yapsin蛋白酶基因也有可能是有缺陷的。這些突變株的特征總結(jié)在下面的表2中。
表2Yps3缺陷型酵母株系

實(shí)施例2構(gòu)建表達(dá)hPTH的重組酵母菌株及對(duì)表達(dá)hPTH的分析用表達(dá)載體PG10-hPTH1轉(zhuǎn)化野生型啤酒酵母2805、L3262以及啤酒酵母突變株S28Y4，SLH15(yps3Δ)，SLH16(yps1Δ/yps3Δ)，SLH17(yps2Δ/yps3Δ)及SLH18(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)，然后篩選Ura+轉(zhuǎn)化株。對(duì)這些能夠表達(dá)hPTH的重組酵母菌株進(jìn)行分析。
將這些酵母突變株在選擇性最低的培養(yǎng)液(氨基酸缺陷型酵母氮基0.67％，葡萄糖2％，酪蛋白氨基酸0.5％)中，在30℃的環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。取每種培養(yǎng)物的2％，接種到Y(jié)PDG培養(yǎng)基(酵母提取物1％，bacto蛋白胨2％，葡萄糖1％，半乳糖1％)中，然后在30℃的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)過(guò)程中，分別在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)提取樣品。每個(gè)樣品取500μl，在5000rpm的條件下離心5分鐘，以便獲取上清液。在上清液中分別加入占上清液1/10體積的DOC(脫氧膽酸)和TCA(三氯乙酸)，在0℃下保存30分鐘，沉淀蛋白質(zhì)。在12000rpm條件下離心10分鐘，產(chǎn)生一個(gè)球狀物，用丙酮沖洗，去掉殘存在沉淀蛋白質(zhì)中的TCA溶液，然后溶于25μl的裂解緩沖液中，在100℃加熱5分鐘，獲得胞外蛋白片段。取10μl的胞外蛋白片段置于15％聚丙烯酰胺凝膠上(pH8.8，10厘米寬，8cm長(zhǎng)，0.7mm厚)電泳1.5小時(shí)(125V和25毫安)。凝膠上跑的蛋白可以通過(guò)染上考馬斯藍(lán)來(lái)觀察。樣品的24小時(shí)電泳結(jié)果如圖3a所示，樣品的48小時(shí)電泳結(jié)果如圖3b所示。
從電泳照片可以看到，這些啤酒酵母株分泌的重組hPTH在變性凝膠電泳SDS-PAGE上分離出來(lái)，顯現(xiàn)出三條帶i代表完整的蛋白質(zhì)分子(1-84)；d1代表N端被截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)分子(27-84)；d2代表C端被截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)分子(1-80)。把位于i帶和d1帶的蛋白質(zhì)放到一個(gè)聚二氟乙烯(PVDF)膜上。通過(guò)借助Milligen/Biosearch M600蛋白測(cè)序儀可以測(cè)定i和d1帶上該蛋白質(zhì)N端區(qū)域的N端氨基酸序列分別為Ser-Val-Ser-Glu-Ile和Lys-Leu-Gln-Asp-Val，這就表明，i帶的hPTH是完整的蛋白質(zhì)分子，而d1帶的hPTH是被截?cái)嗟姆肿?27-84)，該hPTH分子缺少N端的26個(gè)氨基酸殘基。至于d2帶上的蛋白質(zhì)，盡管其電泳帶顯示為14kDa，分子量大于完整的hPTH分子，但是通過(guò)高性能液體色譜(HPLC)、MALDI質(zhì)譜及C端氨基酸測(cè)序，卻發(fā)現(xiàn)該hPTH分子在C端被截?cái)?1-79，80)，缺少4到5個(gè)氨基酸殘基。據(jù)報(bào)道，導(dǎo)致該電泳結(jié)果的原因是hPTH分子的C端被剪切，從使得了該蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化(Vad et[AL.，]Protein Expr.Purif.13396-402(1998))。實(shí)施例3hPTH在Yapsin蛋白酶缺陷型突變株中的表達(dá)形式為了檢測(cè)阻斷YPS1基因和YPS3基因?qū)τ趆PTH表達(dá)的影響，我們對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的野生型啤酒酵母2805、轉(zhuǎn)化過(guò)的啤酒酵母突變株2805/pG10-hPTH1、轉(zhuǎn)化過(guò)的yps1Δ突變株S28Y3/pG10-hPTH1、及轉(zhuǎn)化過(guò)的yps3Δ突變株S28Y4/pG10-hPTH1所分泌的hPTH分子進(jìn)行變性電泳SDS-PAGE。電泳結(jié)果如圖3所示。
從電泳圖像中可以看出來(lái)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的野生型菌株中沒(méi)有表達(dá)hPTH分子(如電泳泳道1所示)。在轉(zhuǎn)化過(guò)的野生型2805株中表達(dá)了大約50％或更多的hPTH分子，該hPTH分子是以被截?cái)嗟膁1帶的形式存在的(如電泳泳道3和帶4所示)。就yps1Δ的突變株S28Y3而言，在培養(yǎng)24小時(shí)后，分泌到介質(zhì)中的hPTH分子僅占hPTH總量的5％或者更少。相反，在培養(yǎng)了48小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)大約有總量的30-40％的hPTH以d1帶的形式存在。僅僅阻斷了YPS3基因的突變株S28Y4與轉(zhuǎn)化的野生型菌株在hPTH表達(dá)形式上卻沒(méi)有什么差別在培養(yǎng)了24小時(shí)之內(nèi)有大約50％或更多的hPTH以被截?cái)嗟男问椒置诔鰜?lái)。
結(jié)合這些和在圖3所示的試驗(yàn)結(jié)果，表明在培養(yǎng)早期，可以引起hPTH剪切的主要的蛋白酶是Yapsin1，而在培養(yǎng)過(guò)程后期起作用的則是除了Yapsin1以外的其他的蛋白酶。然而，在僅僅阻斷了YPS3基因的菌株中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)很顯著的變化，其原因是在培養(yǎng)過(guò)程早期，Yapsin1酶已經(jīng)大量地剪切了hPTH。
相應(yīng)地，我們把YPS3基因和其余Yapsin家系的基因YPS1和YPS2一起進(jìn)行了阻斷，對(duì)hPTH的表達(dá)形式進(jìn)行了試驗(yàn)。在本試驗(yàn)中，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化過(guò)的野生型的啤酒酵母L3262為對(duì)照，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的酵母L3262/pG10-hPTH1，轉(zhuǎn)化的yps3Δ突變株SLH15/pG10-hPTH1，轉(zhuǎn)化的yps1Δ/yps3Δ突變株SLH16/pG10-hPTH1，轉(zhuǎn)化的yps2Δ/yps3Δ突變株SLH17/pG10-hPTH1及轉(zhuǎn)化的yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ突變株SLH18/pG10-hPTH1中都表達(dá)了hPTH。與上述試驗(yàn)一樣，對(duì)這些分泌的蛋白也進(jìn)行了電泳，溫育24小時(shí)后樣品的電泳結(jié)果如圖4a所示，溫育48小時(shí)后樣品電泳結(jié)果如圖4b所示。
從圖4可以看出，在培養(yǎng)了24小時(shí)后，在非經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株中沒(méi)有產(chǎn)生hPTH(如電泳泳道1所示)。而在轉(zhuǎn)化的野生型菌株(如電泳泳道2和3所示)、YPS3缺陷型菌株(如電泳泳道4和5所示)、YPS2和YPS3雙基因缺陷型菌株(如電泳泳道6和7所示)中有約產(chǎn)生50％的hPTH產(chǎn)生，以N端截?cái)郿1帶的形式存在。48小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)hPTH的剪切現(xiàn)象愈加嚴(yán)重，截?cái)嗟膆PTH的比例在上升。另一方面，有趣的是，在培養(yǎng)48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)YPS1和YPS1雙基因缺陷型突變株中沒(méi)有hPTH產(chǎn)生(如電泳泳道6和7所示)，而YPS1，PYS2，YPS3三基因缺陷型菌株中則有N端截?cái)嗟膁1帶形式的hPTH產(chǎn)生(如電泳泳道10和11所示)。而且，試驗(yàn)顯示，YPS1和YPS3雙基因缺陷菌株分泌的截?cái)嗟牡鞍?d2帶)約占總蛋白量的20％，而在培養(yǎng)YPS1/YPS2/YPS3三基因缺陷型菌株48小時(shí)之后，仍可以看到i帶的完整的hPTH分子。這些結(jié)果結(jié)合起來(lái)表明，野生型酵母菌的hPTH降解問(wèn)題可以通過(guò)阻斷YPS1/YPS2/YPS3三個(gè)基因得到的突變株來(lái)解決。實(shí)施例4在高濃度的培養(yǎng)基中hPTH的表達(dá)形式我們進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn)，以檢測(cè)我們上面試驗(yàn)所得到y(tǒng)apsin蛋白酶缺陷型突變株所產(chǎn)生的hPTH是否可以承受蛋白質(zhì)水解作用。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)跓胁粩嗟丶尤氚肴樘且阅７掳l(fā)酵罐中高濃度培養(yǎng)基的環(huán)境。在YPDG肉湯中保溫培養(yǎng)了24小時(shí)后，這些菌株又培養(yǎng)了72小時(shí)，在72小時(shí)這段時(shí)間中，要每24小時(shí)加入半乳糖以保持肉湯中半乳糖的濃度為2％。
在這種情況下，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的野生型啤酒酵母L3262作為對(duì)照，轉(zhuǎn)化的L3262/pG10-hPTH1，轉(zhuǎn)化的yps1Δ突變株SLH11/pG10-hPTH1，轉(zhuǎn)化的yps1Δ/yps3Δ突變株SLH16/pG10-hPTH1，以及轉(zhuǎn)化的yps1Δ/yps2Δ/yps2Δ突變株SLH18/pG10-hPTH1中都有hPTH的產(chǎn)生。把分泌的蛋白以上面同樣的方式進(jìn)行電泳，L3262/pG10-hPTH1菌株和SLH11/pG10-hPTH1菌株的電泳結(jié)果如圖5a所示，SLH16/pG10-hPTH1株和SLH18/pG10-hPTH1株的電泳結(jié)果如圖5b所示。
如圖5所示，野生型酵母在培養(yǎng)了24小時(shí)后收獲的hPTH(圖5a中電泳泳道2-7所示)差不多約有50％已經(jīng)以N端截?cái)郿1的形式存在。另一方面，在不斷添加半乳糖的高濃度培養(yǎng)基中，培養(yǎng)YPS1Δ缺陷型突變株(如圖5a中電泳泳道8-13所示)和YPS1Δ/YPS3Δ雙基因缺陷型突變株(如圖5b電泳泳道2-7所示)，24小時(shí)hPTH并沒(méi)有發(fā)生降解，而在培養(yǎng)了48小時(shí)后卻發(fā)生了顯著的降解反應(yīng)。相反，當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到72小時(shí)的時(shí)候，所收集到的YPS1ΔYPS2ΔYPS3Δ突變株培養(yǎng)物中(如圖5b中電泳泳道8-13所示)沒(méi)有N端被截?cái)嗟膁1形式的hPTH分子，相反卻發(fā)現(xiàn)完整的hPTH分子(i帶)的數(shù)量在明顯地增長(zhǎng)。在培養(yǎng)了144小時(shí)后，該三基因缺陷型突變菌的培養(yǎng)物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)截?cái)嘈问降膆PTH分子產(chǎn)生。這個(gè)試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明在高濃度培養(yǎng)的后期，hPTH的降解問(wèn)題可以通過(guò)運(yùn)用阻斷YPS1，YPS2和YPS3基因的突變體來(lái)得以解決。
如以上所述，所制備的Yapsin1(以前稱YPA3)基因和Yapsin3基因的缺陷型酵母突變株(YPS1Δ/YPS3Δ)，或者三個(gè)基因Yapsin1，Yapsin2(以前稱MKC7)以及Yapsin3的基因缺陷型酵母突變株(YPS1Δ/YPS2Δ/YPS3Δ)可以高產(chǎn)量地分泌完整的用于治療多種不適癥的hPTH分子，這是由于它們不能降解激素的肽鏈所致。
上面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了直觀描述。文中使用的術(shù)語(yǔ)是為了切合對(duì)本發(fā)明的描述，而不是為了進(jìn)行限制。根據(jù)上面的教導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)和變化。因此，在后附的權(quán)利要求定義的范圍內(nèi)，可以以不同于本文中所具體描述的方式實(shí)施本發(fā)明。
關(guān)于用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際相互承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約原始保藏的收據(jù)(譯文)致李相琪(RHEE.Sang Ki)Ga-101.Geukdong Villa，Gwangjang-dong，Gwangjin-ku，Seoul 143-210，韓國(guó)漢城

關(guān)于用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際相互承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約原始保藏的收據(jù)(譯文)致李相琪(RHEE.Sang Ki)Ga-101.Geukdong Villa，Gwangjang-dong，Gwangjin-ku，Seoul 143-210，韓國(guó)漢城

權(quán)利要求
1.一種用酵母宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組的人甲狀旁腺激素(hPTH)的方法，包括以下步驟使酵母宿主細(xì)胞進(jìn)行缺陷型突變，即阻斷酵母細(xì)胞中能編碼蛋白酶yapsin家系Yapsin1，Yapsin2和Yapsin3的至少一個(gè)基因；用載有一個(gè)編碼人的甲狀旁腺激素的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，且在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的酵母宿主細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該缺陷型突變是通過(guò)使用一種酵母選擇性標(biāo)志物來(lái)阻斷能編碼蛋白酶yapsin家系Yapsin1，Yapsin2和Yapsin3的至少一個(gè)基因而實(shí)現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中酵母宿主細(xì)胞在YPS1和YPS3基因上被阻斷。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中酵母宿主細(xì)胞在YPS1、YPS2和YPS3基因上被阻斷。
5.一種酵母菌株，是由載有人的甲狀旁腺激素的一個(gè)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母yps1Δyps3Δ突變株構(gòu)建的。
6.如權(quán)利要求5所述的酵母菌株，其中該酵母菌株是啤酒酵母SLH16/pG10-hPTH(菌種保藏號(hào)為KCTC 0815BP)，表達(dá)載體為pG10-hPTH1。
7.一種酵母菌株，是由載有人的甲狀旁腺激素的一個(gè)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母yps1Δyps2Δyps3Δ突變株構(gòu)建的。
8.如權(quán)利要求7所述的酵母菌株，其中該酵母菌株是啤酒酵母SLH18/pG10-hPTH(菌種保藏號(hào)為KCTC 0816BP)，表達(dá)載體為pG10-hPTH1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的生產(chǎn)人的甲狀旁腺激素的啤酒酵母突變株系。這種新的株系中能編碼蛋白酶yapsin家系Yapsin 1，Yapsin 2和Yapsin 3的至少一種基因發(fā)生了阻斷，并且其基因組中有人的甲狀旁腺激素基因。培養(yǎng)這種新的株系可以在培養(yǎng)基上大量生產(chǎn)完整的人的甲狀旁腺激素(hPTH)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1449441SQ01814919
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2001年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月31日
發(fā)明者相琪·李, 賢阿·加奈, 鳳賢·鄭, 修民·高 申請(qǐng)人:東國(guó)制藥株式會(huì)社, 韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院