專利名稱：生物蝶呤的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中有一種或多種參與四氫生物蝶呤生物合成的酶的基因?qū)?，以及還涉及利用該轉(zhuǎn)化地細(xì)胞生產(chǎn)生物蝶呤化合物的方法。
背景技術(shù)：
在本說明書中，四氫生物蝶呤(L-赤型-5，6，7，8-四氫生物蝶呤；下文稱為THBP)、7，8-二氫生物蝶呤(L-赤型-7，8-二氫生物蝶呤；下文稱為DHBP)或生物蝶呤(下文稱為BP)或它們中的任何兩種或多種的組合整體上都稱為生物蝶呤化合物。
THBP是生物物質(zhì)，其廣泛分布于動物中，并于1963年由Kaufman揭示是大鼠肝臟中的苯丙氨酸羥化酶的輔酶。此后，又揭示出THBP通常是作用于酪氨酸羥化酶和色氨酸羥化酶的輔酶，并且發(fā)現(xiàn)在參與神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成中發(fā)揮重要作用。近年來，還發(fā)現(xiàn)其作為一氧化氮(NO)合成酶的輔酶起作用，并作為用于各種生物物質(zhì)的生物合成酶的輔酶已受到公眾的關(guān)注。人們一直認(rèn)為人中THBP的缺陷導(dǎo)致上述氨基酸羥化酶的活性的減少，誘發(fā)異常高的苯酮尿以及異常高的苯丙尿，并將THBP用作治療如腐蝶呤氫氯化物(sapropterinhydrochloride)的先天的代謝錯誤病。
人們一直認(rèn)為動物中的THBP是利用如

圖1所示的GTP環(huán)化脫水酶I(下文簡稱GCH)、6-丙酮?；臍涞屎铣擅?6-pyruvoyltetrahydropterin synthase)(下文簡稱PTPS)和墨蝶呤還原酶(下文簡稱SPR)通過三步酶反應(yīng)自鳥苷三磷酸生物合成而成。同時，除動物以外，已有報道THBP存在于果蠅(Weisberg，E.P.和O’Donnell，J.M.J.Biol.Chem.2611453-1458，1996)、蠶(Iino，T.，Sawada，H.，Tsusue，M.和Takikawa，S.-I.，Biochim.Biophys.Acta1297191-199，1996)、真核微生物如Euglena gracillis、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)和Pycomyces blakesleeanus(Maier，J.，Ninnemann，H.Photochamishtry和Photobiology 6143-53，1995)以及原核微生物的諾卡菌種(Son，J.K.，Rosazza J.P.J.Bacteriol.1823644-3648，2000)。同樣，盡管有許多生命體其中報道了THBP的存在，但是由于進(jìn)化原因，微生物與動物尤其大有區(qū)別，所以人們認(rèn)為THBP整體上不是微生物中通常可得到的生物物質(zhì)。
THBP是分子中具有三個不對稱碳原子的化合物，因此，其是化學(xué)合成困難的化合物，關(guān)于其主要的合成方法，一直已知的是其中L-赤-生物蝶呤(BP)的合成利用鼠李糖或脫氧阿拉伯糖作為起始物質(zhì)，然后進(jìn)行化學(xué)不對稱的還原以合成該產(chǎn)物。然而，這些化學(xué)合成方法有許多反應(yīng)步驟，并在反應(yīng)步驟過程中，存在反應(yīng)產(chǎn)率低的過程。還有困難的是鼠李糖和脫氧阿拉伯糖作為起始物質(zhì)價格昂貴，因此，依據(jù)操作、產(chǎn)率、成本等，據(jù)說它們不是有利的生產(chǎn)方法。
在這些條件下，kagamiyama等嘗試了通過酶法反應(yīng)合成THBP，純化了三種參與THBP合成的酶的每一個，并利用三種酶在含有GTP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型)(下文簡稱NADPH)的反應(yīng)器中成功地合成了THBP(日本專利
發(fā)明者藪田雅之, 古川和明, 宮本伸江, 山本克彥, 大末和廣 申請人:第一三得利制藥株式會社