專利名稱：AXMI-066和AXMI-076:δ-內(nèi)毒素蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺蟲蛋白的新基因。這些蛋白質(zhì)和編碼 它們的核酸序列可用于制備殺蟲制劑以及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的抗害蟲植物。
背景技術(shù)：
蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，其特 征在于它能產(chǎn)生對某些目和種的昆蟲有特異性毒性，但是對植物和其他非靶向生物體無害 的晶狀包含體。因此，包含蘇云金桿菌菌株或它們的殺蟲蛋白的組合物可用作環(huán)境可接受 的殺蟲劑以控制農(nóng)業(yè)蟲害或針對多種人或動物疾病的昆蟲媒介。來自蘇云金桿菌的晶體(Cry)蛋白(S-內(nèi)毒素)具有主要針對鱗翅目，雙翅 目和鞘翅目幼蟲的有效殺蟲活性。這些蛋白質(zhì)還顯示出抗膜翅目，同翅目，虱目，食毛目 和螨害蟲目，以及如線蟲，扁形動物和Sarcomastigorphora等其他無脊椎動物目的活性 (Feitelson(1993)TheBacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc.，New York, N. Y.)。這些蛋白質(zhì)主要基于它們的殺蟲活 性而最初被劃分為Cryl到CryV。這些主要的類別是鱗翅目特異性的(I)，鱗翅目和雙翅目 特異性的(II)，鞘翅目特異性的(III)，雙翅目特異性的(IV)，以及線蟲特異性的(V)和 (VI)。所述蛋白質(zhì)被進(jìn)一步劃分為亞家族；各個家族內(nèi)更密切相關(guān)的蛋白質(zhì)被指派上分類 字母，如Cry 1A, Cry IB, Cry 1C等等。在各亞類內(nèi)更緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)則命名為如Cry 1C1, CrylC2 等等。最近出現(xiàn)了一種針對Cry基因的新命名法，其基于的是氨基酸序列同源性而非昆 蟲靶特異性(Crickmore 等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807_813)。在該新的分 類法中，每種毒素被分配了一個獨(dú)特的名稱，其中合并了第一分類(阿拉伯?dāng)?shù)字)、第二分 類(大寫字母)、第三分類(小寫字母)和第四分類(另一個阿拉伯?dāng)?shù)字)。在該新的分類 法中，羅馬數(shù)字被轉(zhuǎn)換成第一分類的阿拉伯?dāng)?shù)字。序列同一性小于45%的蛋白質(zhì)具有不同 的第一分類，而對于第二和第三分類而言這一標(biāo)準(zhǔn)分別為78%和95%。晶體蛋白在已經(jīng)被攝取和在昆蟲中腸溶解前不顯示殺蟲活性。被攝取的前毒素 在昆蟲消化道內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解成活性的毒性分子。(Hofte和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53 :242-255)。此毒素與靶幼蟲中腸內(nèi)的頂端刷狀緣受體結(jié)合并插入頂端膜中，產(chǎn)生離 子通道或孔，導(dǎo)致幼蟲死亡。6 -內(nèi)毒素通常具有5個保守的序列結(jié)構(gòu)域和3個保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(參見，例 如，de Maagd等人(2001) Trends Genetics 17:193-199)。第一個保守的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域由 7個a螺旋組成，并涉及膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘語key構(gòu)型的3個日折 疊片組成，而結(jié)構(gòu)域III由“薄卷餅型(非同源蛋白質(zhì)折疊)”形式的兩個反向平行0折疊 組成(de Maagd等人，2001，同上文)。結(jié)構(gòu)域II和III涉及受體識別和結(jié)合，并因此被認(rèn) 為是毒素特異性的決定簇。由于昆蟲可造成的破壞，和通過控制蟲害而致的產(chǎn)量提高，所以一直需要發(fā)現(xiàn)新 形式的殺蟲毒素。
發(fā)明概述提供了賦予細(xì)菌，植物，植物細(xì)胞，組織和種子殺蟲活性的組合物和方法。組合物 包括編碼殺蟲和殺昆蟲多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的載體，和包含這些載體的宿 主細(xì)胞。組合物還包括殺蟲多肽序列和針對那些多肽的抗體。該核苷酸序列可用于DNA構(gòu) 建體或表達(dá)盒中，用于轉(zhuǎn)化生物體和在生物體中表達(dá)，該生物體包括微生物和植物。核苷酸 或氨基酸序列可以是已經(jīng)被設(shè)計(jì)成用于在生物體中表達(dá)的合成序列，包括但不限于，微生 物或植物。組合物還包括轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，植物，植物細(xì)胞，組織和種子。特別地，提供了編碼殺蟲蛋白的分離的核酸分子。另外，包含與該殺蟲蛋白對應(yīng)的 氨基酸序列。尤其是，本發(fā)明提供了下述分離的核酸分子，其含有編碼SEQ ID N0:2或5中 所示的氨基酸序列的核苷酸序列，和SEQID N0:l、3、4、6、9或11中所示的核苷酸序列，或者 保藏在登錄號為NRRL B-50045的細(xì)菌宿主中的質(zhì)粒的DNA插入物的5 -內(nèi)毒素核苷酸序 列，及其變體和片段。還包含與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)或與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸 序列。還提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，以及利用那些多肽來控制或殺死鱗翅 目，鞘翅目，線蟲或雙翅目害蟲的方法。還包括用于在樣品中檢測本發(fā)明的核酸和多肽的方 法和試劑盒。本發(fā)明的組合物和方法用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗蟲性或耐受性的生物體。這些生物 體和包含該生物體的組合物是農(nóng)業(yè)用途所需的。本發(fā)明的組合物也用于產(chǎn)生具有經(jīng)改變或 改良的殺蟲活性的蛋白質(zhì)，或用于檢測產(chǎn)品或生物體中殺蟲蛋白或核酸的存在。附圖簡述

圖1顯示了 axmi-066基因的DNA序列和它周圍的DNA區(qū)域(SEQ IDN0 :8)。第1 個ATG (對應(yīng)于SEQ ID NO 1的起始位點(diǎn)；SEQ ID NO 1的翻譯編碼AXMI-066 (SEQ ID NO 2))，位于該圖中所示序列的第52位核苷酸。第2個內(nèi)部的甲硫氨酸(其翻譯編碼SEQ ID NO :2的14到637位殘基)位于該圖中的第91位。TAA終止密碼子開始于該圖中的序列的 第1963位。ATG起始密碼子和TAA終止密碼子以黑體字顯示。2個推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn) 以斜體和下劃線表示。圖 2A-2D 顯示 了 AXMI-066_long(SEQ ID NO 2), AXMI-066 (SEQID N0:10)、 Cry2Aal(SEQ ID NO :14)、Cry2Abl(SEQ ID NO : 15)、Cry2Acl(SEQ ID NO : 16)、Cry2Adl(SEQ ID NO 17)、Cry2Ael (SEQ IDN0 18)、CrylAc(SEQ ID NO 19)和 Cry3Aal (SEQ ID NO 20) 的序列比對。該序列比對顯示了以黑色突出顯示的最高度保守氨基酸殘基，和以灰色突出 顯示的高度保守氨基酸殘基。詳細(xì)說明本發(fā)明涉及用于調(diào)控生物體，尤其是植物或植物細(xì)胞中害蟲抗性或耐受性的組合 物和方法?！翱剐浴笔侵负οx(例如，昆蟲)在攝取本發(fā)明的多肽或者與本發(fā)明的多肽以其 他方式接觸之后被殺死?！澳褪苄浴笔侵笓p害或減少害蟲的運(yùn)動，進(jìn)食，繁殖或其他的功能。 該方法包括用編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物體。具體而言，本發(fā)明的核苷 酸序列可用于制備具有殺蟲活性的植物和微生物。因而，提供了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，植物，植物細(xì) 胞，植物組織和種子。組合物是芽孢桿菌屬或其他物種的殺蟲核酸和蛋白質(zhì)。所述序列發(fā)現(xiàn) 用于構(gòu)建表達(dá)載體，其用于隨后轉(zhuǎn)化入目的生物體內(nèi)，作為探針用于分離其他的同源(或
6部分同源)基因，以及通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白，如結(jié)構(gòu)域交換或DNA改 組。所述蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)用于控制或殺死鱗翅目，鞘翅目，雙翅目和線蟲害蟲種群，以及用于產(chǎn) 生具有殺蟲活性的組合物。含有本發(fā)明的axmi-066核苷酸序列的質(zhì)粒于2007年5月29日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī) 構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection,Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815North UniversityStreet, Peoria,伊利諾斯州 61604, 美國)的永久收藏中，登錄號為NRRLB-50045。該保藏物將根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的 微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行維持。在申請未決期間，對于專利和商標(biāo)的委員和經(jīng) 求由該委員確定對其有資格的人員可獲得這些保藏物。在本申請的任何權(quán)利要求得到批 準(zhǔn)時，諸位申請人將依據(jù)37C. F. R. § 1. 808，將使由NRRL保藏的這種或這些樣品可供公眾 獲取。。進(jìn)行這種保藏僅僅是為了本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的方便，而非承認(rèn)保藏是根據(jù)35U. S.C. § 112所要求的。“殺蟲毒素”或“殺蟲蛋白”是指對一種或多種害蟲具有毒性的毒素，或者與這 種蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)，所述害蟲包括但不限于，鱗翅目，雙翅目和鞘翅目或線蟲 門的成員。已經(jīng)從生物體包括例如芽孢桿菌，雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)和 Paenibacillus popilliae分離出殺蟲蛋白。殺蟲蛋白包含由這里公開的全長核苷酸序列 推導(dǎo)出來的氨基酸序列，以及由于使用可選擇的下游起始位點(diǎn)或者由于產(chǎn)生具有殺蟲活性 的較短蛋白質(zhì)的加工所造成的比全長序列短的氨基酸序列。加工可發(fā)生在表達(dá)所述蛋白質(zhì) 的生物體內(nèi)，或者在攝取所述蛋白質(zhì)后的害蟲體內(nèi)。殺蟲蛋白包括內(nèi)毒素。內(nèi)毒素包括被確認(rèn)為cryl到cry 43、cytl和 cyt2的蛋白質(zhì)，以及Cyt-類毒素的蛋白質(zhì)。目前有超過250種具有廣泛特異性和毒性的 已知 6 -內(nèi)毒素。更全面的名單參見 Crickmore 等(1998)，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 807-813，而定期的更新參見 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index 上 白勺 Crickmore 等(2003) "Bacillusthuringiensis toxin nomenclature，，。因此，這里提供了賦予殺蟲活性的新的分離的核苷酸序列。這些分離的核苷酸序 列編碼與已知的內(nèi)毒素或二元毒素同源的多肽。還提供了殺蟲蛋白的氨基酸序列。由 該基因的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可使細(xì)胞控制或殺死攝取它的害蟲。分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明的一個方面是關(guān)于含有編碼殺蟲蛋白和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷 酸序列的分離的或重組核酸分子，以及足以用作雜交探針來鑒定編碼具有序列同源性區(qū)域 的蛋白質(zhì)的核酸分子的核酸分子。如這里使用的，術(shù)語“核酸分子”意在包括DNA分子(例 如，重組DNA，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和利用核苷酸類似物產(chǎn)生的所 述DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選是雙鏈DNA?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或蛋白質(zhì)或者其生物學(xué)活性部分，指當(dāng)通過重組 技術(shù)生產(chǎn)時基本上無其他的細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上無化學(xué)前體或其 他的化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選的，“分離的”核酸中沒有在該核酸來源的生物體的基因組DNA內(nèi)天然 狀態(tài)下處于該核酸兩側(cè)(即，位于所述核酸的5’和3’末端的序列)的序列(優(yōu)選蛋白質(zhì) 編碼序列)。就本發(fā)明的目的而言，“分離的”當(dāng)用于描述核酸分子時，并不包括分離的染 色體。例如，在多種實(shí)施方案中，分離的編碼殺蟲蛋白的核酸分子可包含天然存在于所述核酸來源的細(xì)胞的基因組DNA中該核酸分子兩側(cè)的小于大約5kb，4kb，3kb，2kb，lkb，0. 5kb或 0. lkb的核苷酸序列?；旧蠠o細(xì)胞物質(zhì)的殺蟲蛋白包括具有少于大約30%，20%，10%或 5% (干重)的非殺蟲蛋白(這里也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制品。編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括SEQ ID N0:l，3，4，6，9或11中所示的序列， 或者保藏在登錄號B-50045的細(xì)菌宿主中的核苷酸序列及其變體，片段和互補(bǔ)序列?！盎パa(bǔ) 序列”意指足以與給定核苷酸序列互補(bǔ)以致可與該給定核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙 螺旋的核苷酸序列。由該核苷酸序列編碼的殺蟲蛋白的相應(yīng)氨基酸序列在SEQ ID N0:2或 5中所示。作為編碼殺蟲蛋白的這些核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本發(fā)明內(nèi)?！捌?段”指編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼殺蟲蛋白的生物學(xué) 活性部分，或者它可以是可以用作下面公開的方法中雜交探針或PCR引物的片段。為編碼 殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大約50、100、200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400個連續(xù)核苷酸，或者至多編碼這里公開的 殺蟲蛋白的全長核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目，這取決于目的用途。“連續(xù)”核苷酸指彼 此緊密相鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段將編碼保留殺蟲蛋白的生物學(xué)活 性，并從而保持殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段?！氨Ａ艋钚浴敝杆銎尉哂袣⑾x蛋白的殺蟲活性 的至少大約30 %，至少大約50 %，至少大約70 %，80 %，90 %，95 %或更高。在一個實(shí)施方 案中，殺蟲活性是殺鞘翅目活性。在另一個實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺鱗翅目活性。在另 一個實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺線蟲活性。在另一個實(shí)施方案中，殺蟲活性是殺雙翅目活 性。用于測定殺蟲活性的方法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480_2485 ；Andrews 等(1988)Biochem. J. 252 199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290_293 ；和美國專利
發(fā)明者D·J·湯姆索, K·S·桑普森, N·德賽, S·沃爾拉斯, S·阿加瓦爾, V·海因里希斯 申請人:阿森尼克斯公司