專利名稱:提高糖蛋白唾液酸化作用的組合物與方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明一般涉及唾液酸酶。特別地,本發(fā)明涉及提高糖蛋白唾液酸化作用的組合 物與方法。
背景技術(shù):
采用DNA重組技術(shù)培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞而生產(chǎn)的糖蛋白,代表了人類保健治療藥品 中的一個重要的種類。糖蛋白的生物學(xué)功能往往高度依賴于其碳水化合物結(jié)構(gòu)。在糖蛋白 中發(fā)現(xiàn)的眾多糖中,末端唾液酸被認(rèn)為是特別重要的。已發(fā)現(xiàn),唾液酸影響各種糖蛋白的溶 解度、熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶的攻擊、抗原性以及比活性。糖蛋白中唾液酸的量是兩個相反過 程的結(jié)果,即通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性胞內(nèi)增加唾液酸以及通過唾液酸酶切割胞外去除唾液 酸。當(dāng)從血清糖蛋白除去末端唾液酸時,與唾液酸化的對應(yīng)物(counterpart)相比, 去唾液酸化的蛋白具有顯著降低的循環(huán)半衰期。其他糖蛋白中唾液酸的去除與降低的生物 活性和增加的血清清除率有關(guān)。此外,在分批培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)糖蛋白的過程中,營養(yǎng)物質(zhì)的 消耗和產(chǎn)物的積累可能會改變細(xì)胞環(huán)境,使得蛋白質(zhì)糖基化隨著時間變化而降低。再者,由 此產(chǎn)生的糖蛋白往往有糖形異質(zhì)性,并且,生產(chǎn)過程中有顯著的批次變化。這些變化在用于 蛋白質(zhì)治療藥物大規(guī)模生產(chǎn)的生物加工過程中是不可接受的。因此,在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng) 系統(tǒng)中,我們往往需要使糖蛋白產(chǎn)物中最終唾液酸含量最大化,以確保其作為有效藥物的 質(zhì)量和一致性。因此,存在對具有增強(qiáng)的糖蛋白唾液酸化作用的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的 需求。這一系統(tǒng)將提高充分唾液酸化的重組糖蛋白的生產(chǎn)。發(fā)明概述在本發(fā)明的各個方面中,提供了一種細(xì)胞系,該細(xì)胞系包括至少一種編碼非細(xì)胞 質(zhì)唾液酸酶的染色體整合的核酸序列的受破壞的表達(dá)。表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶 的氨基酸序列選自由以下組成的組(a)與SEQ IDNO :2至少約95%同一的序列,和(b)與 SEQ ID NO :4至少約80%同一的序列。本發(fā)明的另一個方面包括一種生產(chǎn)糖蛋白的方法。該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)編碼 糖蛋白的核酸序列,所述細(xì)胞包括至少一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整合的核酸序 列的受破壞的表達(dá),其中糖蛋白相對于適當(dāng)對照,具有增強(qiáng)的唾液酸化作用。在細(xì)胞中表達(dá) 受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列選自由以下組成的組(a)與SEQ ID N0:2至 少約95%同一的序列,和(b)與SEQ ID NO :4至少約80%同一的序列。本發(fā)明的另一個方面提供了一種分離的核酸,該核酸編碼氨基酸序列由SEQ ID NO 2組成的多肽。本發(fā)明的另一個方面還包括一種分離的核酸,該核酸編碼氨基酸序列由SEQ ID NO 4組成的多肽。本發(fā)明的另一個可選方面提供了一種純化的多肽,該多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO 2組成。本發(fā)明的另一個方面包括一種純化的多肽,該多肽的氨基酸序列由SEQID NO 4組成。本發(fā)明的其他方面和特征在下面更為詳細(xì)地描述。彩色附圖的引用本申請文件包含至少一副彩色照片。具有彩色照片的這一專利申請公布文本的拷 貝在經(jīng)過請求和償付必要的費用后由專利局提供。
圖1示出由CHO NeuU Neu2和Neu3基因編碼的蛋白質(zhì)的唾液酸酶活性。所呈現(xiàn) 的是,使用含有所示各種基因的編碼區(qū)的表達(dá)構(gòu)建體(或任何空表達(dá)構(gòu)建體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 溶胞產(chǎn)物中的酶活性。圖2示出由CHO NeuU Neu2和Neu3基因編碼的蛋白質(zhì)的唾液酸酶活性的抑制。 所呈現(xiàn)的是,在不存在或存在兩種濃度的兩種不同的唾液酸酶抑制劑的情況下,在用含有 各種基因編碼區(qū)的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中所測量的酶活性。圖3示出Neul、Neu2和Neu3蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置。所呈現(xiàn)的是共焦熒光顯微圖 像,其中帶FLAG標(biāo)簽的Neu蛋白質(zhì)以綠色顯示,溶酶體(Lys)標(biāo)志物以紅色顯示,而質(zhì)膜 (PM)標(biāo)志物以藍(lán)色顯示。圖4示出采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)對Neul、Neu2和Neu3mRNA表達(dá)的敲低。所 呈現(xiàn)的是,在使用基因特異性siRNA (S1-S5)或者靶向不相關(guān)GFP核酸序列的對照siRNA (C) 敲低各種基因后,采用基因特異性引物通過RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。對照基因(β_2微球蛋白 (microglubulin), β 2Μ)的表達(dá)不受 siRNA 影響。圖 5 示出采用小干擾 RNA(siRNA)技術(shù)對(A)Neul、(B)Neu2 和(C)Neu3mRNA的敲低表達(dá)。所呈現(xiàn)的是Q-RT PCR結(jié)果,其顯示當(dāng)使用對每種Neu基因特異 的siRNA或者靶向不相關(guān)核酸序列(GFP)的對照siRNA時,各種基因的相對表達(dá)。圖6示出CHO-hlFNY細(xì)胞中的唾液酸酶活性,其中在CH0_hIFN γ細(xì)胞中Neu 基因的表達(dá)使用siRNA敲低。所呈現(xiàn)的是CHO-hlFNY細(xì)胞中的唾液酸酶活性,其中在 CHO-hlFN γ細(xì)胞中每種Neu基因被沉默,兩種Neu基因被沉默,或者全部Neu基因被沉默。 還顯示的是缺乏siRNA構(gòu)建體(CHO)或者包括靶向不相關(guān)核酸序列(GFP)的對照siRNA的 CHO-hlFN γ細(xì)胞中唾液酸酶的活性。圖 7 示出采用短發(fā)夾 RNA (shRNA)技術(shù)對(A) Neul、(B) Neu2 和(C) Neu3mRNA 表達(dá) 的穩(wěn)定的敲低。所呈現(xiàn)的是Q-RT PCR結(jié)果,其顯示相應(yīng)敲低的CH0-hIFNY細(xì)胞或者對照 CHO-hlFN γ細(xì)胞(非靶向)中每種唾液酸酶基因的相對表達(dá),所述對照CH0-hIFNY細(xì)胞包 括靶向不相關(guān)核酸序列的對照siRNA。圖8示出使用shRNA對CHO-hlFN γ細(xì)胞中唾液酸酶活性的穩(wěn)定的敲低。所呈現(xiàn) 的是CHO-hlFNy細(xì)胞中唾液酸酶的活性,其中在CHO-hlFNy細(xì)胞中,唾液酸酶基因(Neul、 Neu2或Neu3)中的每一種被沉默。還顯示了對照CHO-hlFN γ細(xì)胞(非靶向)中的唾液酸 酶活性,所述對照CH0-hIFNY細(xì)胞包括靶向不相關(guān)核酸序列的對照shRNA。*p < 0. 005, **p < 0. 0001。圖9示出細(xì)胞生長不受唾液酸酶基因沉默影響。所呈現(xiàn)的是作為培養(yǎng)天數(shù)函數(shù)的 細(xì)胞生長(即,活細(xì)胞密度(V⑶)和生存力百分比)。對CH0-hIFNY細(xì)胞(其中每種唾液
6酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低)或者對照(非靶向)CH0_hIFN γ細(xì)胞(其包括靶 向不相關(guān)核酸序列的對照shRNA)繪制生長數(shù)據(jù)的圖。圖10示出人干擾素γ (hIFNy)的產(chǎn)生不受唾液酸酶基因沉默影響。所繪制的是 由CHO-hlFNy細(xì)胞或者對照(非靶向)CHO-hlFNy細(xì)胞產(chǎn)生的hIFNy蛋白的水平,在所 述CHO-hlFNy細(xì)胞中,每種唾液酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低。圖11示出唾液酸酶敲低細(xì)胞產(chǎn)生了具有增加的唾液酸水平的糖蛋白。所繪制的 是由CHO-hlFNY細(xì)胞(其中每種唾液酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低)或者對照 (非靶向)CHO-hlFNY細(xì)胞(其包括靶向不相關(guān)核酸序列的對照shRNA)產(chǎn)生的人干擾素 Y (hIFN γ )中的唾液酸的濃度。NS,不顯著,*p < 0. 01,**p < 0. 05。發(fā)明詳述唾液酸酶是從糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸殘基的酶。已知中國倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞含有細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)分離并表征了 CHO細(xì)胞中另外兩種 唾液酸酶,即溶酶體唾液酸酶和質(zhì)膜相關(guān)唾液酸酶。因此,本發(fā)明提供了包括兩種新鑒定 的唾液酸酶基因的受破壞的表達(dá)的細(xì)胞系,其中所述基因單獨,相互組合,或者與細(xì)胞質(zhì)唾 液酸酶組合。本發(fā)明還提供了使用包括受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞生產(chǎn)感興趣的糖蛋白 的方法。一般而言,相對于具有正常唾液酸酶活性的親代細(xì)胞所生產(chǎn)的糖蛋白,由本發(fā)明的 方法所生產(chǎn)的糖蛋白具有增加的唾液酸含量。(I)非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶本發(fā)明的一個方面包括一種分離的核酸序列,該核酸序列編碼氨基酸序列由SEQ ID NO :2組成的多肽。一般而言,分離的核酸序列與SEQ ID NO :1至少約80%同一。在一 些實施方案中,分離的核酸序列可與SEQ ID NO 1約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99. 5%同一。在其他實施方案中,分離的核酸序列可 主要由SEQ ID N0:1組成。在這些實施方案中,可能有側(cè)翼于分離的核酸序列的5’端、3’ 端或者兩端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性內(nèi)切核 酸酶切割位點的連接體,與用于擴(kuò)增和/或其他檢測方法的引物互補(bǔ)的連接體,及類似物。 在另外一些實施方案中,分離的核酸序列可由SEQ ID N0:1組成。本發(fā)明的另一個方面提供了一種分離的核酸序列,該核酸序列編碼氨基酸序列由 SEQ ID NO :4組成的多肽。一般而言,分離的核酸序列與SEQ IDNO :3至少約80%同一。在 一些實施方案中,分離的核酸序列可與SEQ IDNO 3約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99. 5%同一。在其他的實施方案中,分離的核酸序列 可主要由SEQ ID NO :3組成。在這些實施方案中,可能有側(cè)翼于分離的核酸序列的5’端、3’ 端或者兩端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性內(nèi)切核 酸酶切割位點的連接體,與用于擴(kuò)增和/或其他檢測方法的引物互補(bǔ)的連接體,及類似物。 在另外一些實施方案中,分離的核酸序列可由SEQ ID N0:3組成。本發(fā)明的另一個方面包括了一種純化的多肽,所述純化的多肽的氨基酸序列可與 SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少約95%同一,其中純化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一 些實施方案中,純化的多肽的氨基酸序列可與SEQ IDNO 2的氨基酸序列約95、96、97、98、 99或99. 5%同一。在其他的實施方案中,純化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID NO 2 組成。在這些實施方案中,可能有側(cè)翼于純化的多肽的氨基末端、羧基末端或者兩端的外源
7氨基酸序列,其中純化的多肽的生物活性沒有改變。這些外源氨基酸序列可包括,但不限于 抗體表位標(biāo)簽,如FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、HSV標(biāo)簽,及類似物。 在進(jìn)一步的實施方案中,純化的多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO :2組成。通常,由SEQ ID NO 2編碼的多肽(或相關(guān)多肽)位于真核細(xì)胞的溶酶體。本發(fā)明的另一個方面還提供了一種純化的多肽,所述純化的多肽的氨基酸序列可 與SEQ ID NO :4的氨基酸序列至少80%同一,其中純化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一 些實施方案中,純化的多肽的氨基酸序列可與SEQ IDNO 4的氨基酸序列約80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 99. 5% 同一。在其他的實施方案 中,純化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID N0:4組成。在這些實施方案中,可能有側(cè) 翼于純化的多肽的氨基末端、羧基末端或者兩端的外源氨基酸序列,其中純化的多肽的生 物活性沒有改變。這些外源氨基酸序列可包括,但不限于抗體表位標(biāo)簽,如FLAG標(biāo)簽、myc 標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、HSV標(biāo)簽,及類似物。在進(jìn)一步的實施方案中,純化的 多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO 4組成。通常,由SEQ ID NO 2編碼的多肽(或相關(guān)多 肽)位于真核細(xì)胞的質(zhì)膜。(II)包括受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞系本發(fā)明的另一個方面提供了細(xì)胞系,在該細(xì)胞系中至少一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸 酶的內(nèi)源性、染色體整合的核酸序列的表達(dá)被破壞,使得細(xì)胞系具有降低的唾液酸酶活性。 該細(xì)胞系還可包括編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的內(nèi)源性、染色體整合的核酸序列的受破壞的表 達(dá)。在一些實施方案中,該細(xì)胞系包括至少一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整合 的核酸序列的受破壞的表達(dá),其中唾液酸酶的氨基酸序列選自由以下組成的組(a)與SEQ ID NO :2至少約95%同一的序列,和(b)與SEQ IDNO :4至少約80%同一的序列。在一些 實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可與SEQ ID NO :2約95、96、97、98、99或者 99,5%同一。在另一個實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可主要由SEQ IDNO 2組成。在另一個實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可由SEQ ID N0:2組成。 在其他的實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可與SEQ ID NO :4的氨基酸序列 約 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或者 99. 5% 同一。 在可選的實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可主要由SEQ ID N0:4組成。在 另一個實施方案中,表達(dá)受到破壞的非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可由SEQ ID N0:4組成。在一些迭代中,細(xì)胞系可具有一種非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。例如,溶酶 體唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO 2)的表達(dá)可能被破壞。另外,質(zhì)膜相關(guān)唾液酸酶(即關(guān)于 SEQ ID NO 4)的表達(dá)可能被破壞。在其他迭代中,細(xì)胞系可具有兩種非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的 受破壞的表達(dá)。也就是說,溶酶體唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO :2)和質(zhì)膜相關(guān)唾液酸酶 (即關(guān)于SEQ ID NO 4)的表達(dá)可能都被破壞。在可選的實施方案中,細(xì)胞系還可包括編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整合的核酸 序列的受破壞的表達(dá),所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列可與SEQID NO 5至少約85%同 一。在一些實施方案中,表達(dá)受到破壞的細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可與SEQ ID NO :5的氨基酸序列 約 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 99. 5% 同一。在另一個實施方案 中,表達(dá)受到破壞的細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可主要由SEQ ID NO :5組成。在另一個實施方案中,表達(dá)受到破壞的細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶可由SEQ ID NO 5組成。在某些迭代中,細(xì)胞系可具有一種非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶和細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的受破壞 的表達(dá)。例如,溶酶體唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO 2)和細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO 5)的表達(dá)可能被破壞。可選地,質(zhì)膜相關(guān)唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO 4)和細(xì)胞質(zhì)唾 液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO 5)的表達(dá)可能被破壞。在某些其他迭代中,細(xì)胞系可具有非細(xì) 胞質(zhì)唾液酸酶和細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶兩者的受破壞的表達(dá)。也就是說,溶酶體唾液酸酶(即關(guān) 于SEQ ID NO :2),質(zhì)膜相關(guān)唾液酸酶(即關(guān)于SEQ ID NO :4),和細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶(即關(guān)于 SEQ ID NO 5)的表達(dá)可能都被破壞。(a)細(xì)胞類型 一般而言,真核細(xì)胞將會用于本發(fā)明的實施中。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括真菌或酵 母,如巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)或者釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae); 昆蟲細(xì)胞,如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的SF9細(xì)胞或者黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的S2細(xì)胞;植物細(xì)胞;和動物細(xì)胞,如小鼠、大鼠、倉鼠、非人靈長類動物或 者人類細(xì)胞。適當(dāng)細(xì)胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVI系 (C0S7);人胚胎腎系293;幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK);小鼠支持細(xì)胞(TM4);猴腎細(xì)胞(CVI-76); 非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76);人宮頸癌細(xì)胞(HELA);犬腎細(xì)胞(MDCK);布法羅大鼠肝細(xì)胞 (buffalo rat liver cell,BRL 3A);人肺細(xì)胞(W138);人肝細(xì)胞(Hep G2);小鼠乳腺腫瘤 細(xì)胞(MMT);大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(HTC) ;HIH/3T3細(xì)胞和TRI細(xì)胞。對于一份全面的哺乳動 物細(xì)胞系清單,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可參考美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄(ATGC Mamassas, VA)。一般而言,細(xì)胞可以是多種細(xì)胞類型,如成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、T細(xì)胞或B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞,等等。在優(yōu)選的實施方案中,細(xì)胞是一種廣泛用于生產(chǎn)糖蛋白的 類型。在一個示例的實施方案中,細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞。其中一些產(chǎn)生感興趣的糖蛋白的 眾多CHO細(xì)胞系可從ATCC獲得。穩(wěn)定表達(dá)感興趣的糖蛋白的CHO細(xì)胞的例子,包括產(chǎn)生細(xì) 胞內(nèi)細(xì)胞粘附分子-1的CH0-ICAM-1細(xì)胞和產(chǎn)生人干擾素γ的CHO-hlFNY細(xì)胞。(b)受破壞的表達(dá)一般而言,本發(fā)明中的細(xì)胞系具有降低的唾液酸酶表達(dá)。該表達(dá)可能會在基因表 達(dá)過程的幾個不同階段受到破壞。例如,編碼唾液酸酶多肽的DNA序列可能會被改變,使得 功能信使RNA(mRNA)(和,因此,功能多肽)不能合成??蛇x地,該mRNA可能會被改變(或 降解),使得多肽不能合成或合成較低水平的多肽。(i) RNA 干擾使用抑制靶mRNA或者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)的RNA干擾(RNAi)劑可破壞唾液酸酶的表 達(dá)。RNAi劑可導(dǎo)致靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的裂解??蛇x地,RNAi劑可阻止或者破壞靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯為 蛋白質(zhì)。在一些實施方案中,RNAi劑可以是短干擾RNA (SiRNA)。一般而言,siRNA包括雙鏈 RNA分子,長度范圍為約15至約29個核苷酸。siRNA的長度可以為約16-18,17-19,21-23, 24-27,或者27-29個核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中,siRNA的長度可為約21個核苷酸。 siRNA還可任選地包括一個或兩個單鏈突出端,例如,在一端或兩端的3’突出端。siRNA可 由雜交在一起的兩個RNA分子形成,或者可選地,可由短發(fā)夾RNA(shRNA)生成(見下文)。 在一些實施方案中,siRNA的兩條鏈可能完全互補(bǔ),使得在兩條序列之間形成的雙鏈體中不
9存在錯配或者凸起。在其他的實施方案中,SiRNA的兩條鏈可能大體上互補(bǔ),使得在兩條序 列之間形成的雙鏈體中可存在一個或多個錯配和/或凸起。在某些實施方案中,SiRNA的 5’端中的一個或兩個可能具有磷酸基,而在其他的實施方案中,5’端中的一個或兩個可能 沒有磷酸基。在其他的實施方案中,siRNA的3’端中的一個或兩個可能具有羥基,而在其 他的實施方案中,5’端中的一個或兩個可能沒有羥基。siRNA的一條鏈被稱為“反義鏈”或“指導(dǎo)鏈”,包括與靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的部分。在 優(yōu)選的實施方案中,siRNA的反義鏈,可能與靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的區(qū)域完全互補(bǔ),即其在長度為約 15和約29個核苷酸,長度優(yōu)選為至少16個核苷酸,以及長度更優(yōu)選為約18-20個核苷酸的 靶區(qū)域內(nèi),與靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交而沒有一個錯配或凸起。在其他的實施方案中,反義鏈可能與 靶區(qū)域大體上互補(bǔ),即由反義鏈和靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的雙鏈體中可能存在一個或多個錯配和 /或凸起。通常情況下,siRNA靶向于靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的外顯子序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉設(shè) 計靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的siRNA的程序、算法和/或商業(yè)服務(wù)。示例的例子是Rosetta siRNA設(shè)計 算法(Rosetta Inpharmatics,North Seattle, WA)和]MISSION siRNA(Sigma—Aldrich, St. Louis,MO) 0 siRNA可在體外用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法酶促合成。可選地,siRNA可 以用本領(lǐng)域熟知的寡核苷酸合成技術(shù)化學(xué)合成。在其他的實施方案中,RNAi劑可以是短發(fā)夾RNA(shRNA)。一般而言,shRNA是一 種RNA分子,包括至少兩個雜交或者能夠雜交形成足夠長以介導(dǎo)RNA干擾的雙鏈結(jié)構(gòu)的互 補(bǔ)部分(如上所述),和至少一個與形成雙鏈體的shRNA區(qū)連接而形成環(huán)的單鏈部分。該結(jié) 構(gòu)也可以稱為莖-環(huán)結(jié)構(gòu),以莖作為雙鏈體部分。在一些實施方案中,該結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分 可能完全互補(bǔ),使得shRNA的雙鏈體區(qū)域中不存在錯配或凸起。在其他的實施方案中,該結(jié) 構(gòu)的雙鏈體部分可能大體上互補(bǔ),使得shRNA的雙鏈體部分中可存在一個或多個錯配和/ 或凸起。該結(jié)構(gòu)的環(huán)長度可能為約1至約20個核苷酸,優(yōu)選長度為約4至約10個核苷酸, 以及更優(yōu)選長度為約6至約9個核苷酸。該環(huán)可能位于與靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的區(qū)域的5’或 3’端(即shRNA的反義部分)。該shRNA在5’或3’端還可包括突出端。任選的突出端長度可能為約1至約20 個核苷酸,以及更優(yōu)選長度為約2至約15個核苷酸。在一些實施方案中,突出端可包括一 個或者多個U殘基,如約1和約5個U殘基之間。在一些實施方案中,shRNA的5’端可具有 磷酸基,而在其他的實施方案中可能沒有。在其他的實施方案中,shRNA的3’端可具有羥 基,而在其他的實施方案中可能沒有。一般而言,通過保守的細(xì)胞RNAi機(jī)制,將shRNA加工 成siRNA。因此,shRNA是siRNA的前體并且類似地,能夠抑制與shRNA的一部分(即shRNA 的反義部分)互補(bǔ)的靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉設(shè)計和合成shRNA的可用 的資源(如上面提到的細(xì)節(jié))。示例的例子是MISSION ShRNA(Sigma-Aldrich)。在其他的實施方案中,RNAi劑可以是RNAi表達(dá)載體。通常地,RNAi表達(dá)載體可用 于在細(xì)胞內(nèi)(體內(nèi))合成RNAi劑,如siRNA或shRNA。在一個實施方案中,兩條獨立的互補(bǔ) siRNA鏈可使用包含兩個啟動子的單一載體轉(zhuǎn)錄,兩個啟動子中的每一個指導(dǎo)單一 siRNA 鏈的轉(zhuǎn)錄(即每個啟動子可操作地與siRNA的模板連接,使得轉(zhuǎn)錄可以發(fā)生)。兩個啟動子 可以在相同的方向上,在這種情況下,每個啟動子可操作地與互補(bǔ)siRNA鏈之一的模板連 接??蛇x地,兩個啟動子可以在相反的方向上,其側(cè)翼于單一模板,使得啟動子的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致 兩個互補(bǔ)siRNA鏈的合成。在另一個實施方案中,RNAi表達(dá)載體可包括一個啟動子,該啟動子驅(qū)動包括兩個互補(bǔ)區(qū)域的單一 RNA分子的轉(zhuǎn)錄,使得轉(zhuǎn)錄物形成shRNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解,在體內(nèi)通過多于一個的轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生siRNA 和shRNA劑是優(yōu)選的。一般而言,用來指導(dǎo)一個或多個siRNA或者shRNA轉(zhuǎn)錄單元在體內(nèi) 表達(dá)的啟動子可以是RNA聚合酶III (Pol III)啟動子。某些Pol III啟動子,如TO或者 Hl啟動子,不需要轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的順式作用調(diào)控元件(cis-acting regulatory element),因 此,在某些實施方案中是優(yōu)選的。在其他的實施方案中,Pol II啟動子可用于驅(qū)動一個或 多個siRNA或shRNA轉(zhuǎn)錄單元的表達(dá)。在一些實施方案中,可以使用組織特異性的、細(xì)胞特 異性的或者可誘導(dǎo)的Pol II啟動子??墒褂脴?biāo)準(zhǔn)重組DNA方法生產(chǎn)提供合成siRNA或shRNA模板的構(gòu)建體,并插入 適于在真核細(xì)胞中表達(dá)的多種不同載體中的任一種。指導(dǎo)可參閱最新分子生物學(xué)實驗方 法匯編(Current Protocols in Molecular Biology ;Ausubel 等,John Wiley & Sons, New York, 2003)或分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning :A Laboratory Manual ; Sambrook & Russell,Cold SpringHarbor PressiCold Spring Harbor,NY,第3片反,2001)。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員還了解,載體可包括附加的調(diào)控序列(例如,終止序列、翻譯控制序列 等),以及選擇性標(biāo)記序列。本領(lǐng)域已知DNA質(zhì)粒,包括基于pBR322、PUC的那些,等等。由 于許多表達(dá)載體已經(jīng)包含了適當(dāng)?shù)囊粋€或多個啟動子,可能只需要在相對于啟動子的適當(dāng) 位置插入編碼感興趣的RNAi劑的核酸序列。病毒載體也可用于提供RNAi劑的細(xì)胞內(nèi)表 達(dá)。適當(dāng)?shù)牟《据d體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹 病毒載體,等等。在優(yōu)選的實施方案中,RNAi表達(dá)載體是shRNA的基于慢病毒的載體或慢 病毒粒子,例如,MISSION TRC shRNA產(chǎn)品(Sigma-Aldrich)中所提供的。RNAi劑或RNAi表達(dá)載體可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法引入細(xì)胞。指導(dǎo)可參閱, 例如Ausubel等,見上或Sambrook & Russell,見上。在一些實施方案中,RNAi表達(dá)載體, 例如,病毒載體,可穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的基因組中,使得后續(xù)的細(xì)胞后代中的唾液酸酶表達(dá) 被破壞。(ii)基因靶向在其他的實施方案中,可使用同源重組技術(shù)來破壞基因組DNA水平上的唾液酸酶 表達(dá)。因此,這些技術(shù)可以用來刪除核酸序列,刪除核酸序列的一部分,或在核酸序列中引 入點突變,使得沒有功能產(chǎn)品可以被合成。在一個實施方案中,可通過使用Capecchi (Cell 22:4779-488,1980)和 Smithies ((Proc Natl Acad Sci USA 91:3612-3615,1994))的技 術(shù)的同源重組來靶向核酸序列。在其他的實施方案中,可使用Cre-IoxP位點特異性重組系 統(tǒng),F(xiàn)Ip-FRT位點特異性重組系統(tǒng),或其變型來靶向核酸序列。這種重組系統(tǒng)是商業(yè)可得的, 并且更多的指導(dǎo)可參閱Ausubel等,見上。在另一個實施方案中,可使用鋅指核酸酶(ZFN) 介導(dǎo)的基因靶向(Sangamo Biosciences, Richmond, CA)來靶向基因。簡單地說,ZFN是合 成的蛋白質(zhì),其包括與FokI限制性內(nèi)切核酸酶的切割結(jié)構(gòu)域融合的設(shè)計的鋅指DNA結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。ZFN可用于誘導(dǎo)特定DNA序列中的雙鏈斷裂,從而促進(jìn)基因組序列的位點特異性同源 重組和靶向操控。ZFN可經(jīng)過設(shè)計以便靶向任何感興趣的DNA序列。(iii)測量受破壞的表達(dá)上述RNAi和基因靶向方法,通常將導(dǎo)致唾液酸酶基因的降低的表達(dá),因而導(dǎo)致降 低的唾液酸酶活性。因此,所述細(xì)胞通常將具有降低水平的唾液酸酶mRNA和/或唾液酸酶蛋白。可使用本領(lǐng)域已知的多種方法來測量mRNA水平、蛋白質(zhì)水平或酶活性。RNA檢測方 法的非限制性例子包括逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR、核酸微陣列、基于雜交的方法、支 鏈DNA檢測技術(shù)、Northern印跡和核酸酶保護(hù)測定。蛋白質(zhì)檢測方法的非限制性例子包括 蛋白質(zhì)印跡法、ELISA測定和其他免疫測定。每種唾液酸酶可逐一檢測或者全部三個可同 時檢測,這取決于這些檢測測定中所用探針的特異性。然而,與特異性無關(guān),可通過將具有 受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞中的(mRNA和/或蛋白質(zhì)的)水平與未處理細(xì)胞中的水平進(jìn) 行比較而確定表達(dá)水平的降低。優(yōu)選地,唾液酸酶表達(dá)的降低導(dǎo)致細(xì)胞中(例如,在從細(xì)胞 獲得的溶胞產(chǎn)物中),培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中或兩者中的唾液酸酶活性的降低。唾液酸酶 的活性,可使用本領(lǐng)域中各種已知的唾液酸酶測定來測量。例如,唾液酸酶的活性可使用實 施例2中所述的測定來測量。在一些實施方案中,相對于未處理細(xì)胞,唾液酸酶mRNA的水平可能降低至少2倍、 至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10,000倍。在其他的實施方案中, 相對于未處理的細(xì)胞,唾液酸酶蛋白的量可能降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100 倍、至少1000倍或至少10,000倍。此外,唾液酸酶活性可降低未處理細(xì)胞值的20% -50%, 50% -60%,60% -70%,70% -80%,80% -90%,或 90% -100%。(c)優(yōu)選的實施方案優(yōu)選地,包括受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞系,來源于CHO細(xì)胞系。在一個實施方 案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :2組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。在另一個實施方 案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :4組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。還有另一個實施 方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ) ID NO :2和SEQ ID NO :4組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。 在進(jìn)一步的實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 5組成的唾液酸酶 的受破壞的表達(dá)。在另一個實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ IDNO :4和SEQ ID NO :5組 成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。在另一個可選的實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。優(yōu)選地,唾液酸酶的表 達(dá)通過RNAi破壞。(III)生產(chǎn)具有增強(qiáng)的唾液酸化作用的糖蛋白的方法本發(fā)明的另一個方面提供了一種生產(chǎn)包括增強(qiáng)的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。 一般而言,該方法包括在細(xì)胞中表達(dá)編碼感興趣的糖蛋白的核酸序列,所述細(xì)胞包括至少 一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的核酸序列的受破壞的表達(dá),其中細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白具有增加 的唾液酸化作用。在其他的實施方案中,該細(xì)胞還包括編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的核酸的受破 壞的表達(dá)。本發(fā)明方法中適用的唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞在上文第(II)部分中描述。相比于唾液酸酶表達(dá)未改變的對照細(xì)胞(例如,唾液酸酶被破壞的細(xì)胞所源自的 親代細(xì)胞)所產(chǎn)生的糖蛋白,具有受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白通常將具 有更高水平的唾液酸化作用。具有受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液 酸化作用,可能比對照細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸化作用高至少約10%。在一些實施方 案中,具有受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸化作用,可能比對照細(xì) 胞所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸化作用高約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、 300、350、400、450或500 %。在其他的實施方案中,具有受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞所產(chǎn) 生的糖蛋白的唾液酸化作用,可能比對照細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸化作用高約500%以上。在一些實施方案中,用于生產(chǎn)糖蛋白的唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞可能已經(jīng)表達(dá)了 感興趣的糖蛋白。例如,糖蛋白對細(xì)胞而言可能是內(nèi)源性的;據(jù)此編碼糖蛋白的核酸存在細(xì) 胞的基因組中??蛇x地,糖蛋白對細(xì)胞而言可能是外源性的,并且編碼糖蛋白的核酸序列可 能已穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的染色體上。如上第(II) (a)部分所述,具有商業(yè)上可得的表達(dá)外 源糖蛋白的細(xì)胞系。例如,CHO細(xì)胞系,即CHO-hlFN γ,穩(wěn)定地表達(dá)了人干擾素γ。在其他的實施方案中,用于生產(chǎn)糖蛋白的唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞可能不表達(dá)感 興趣的糖蛋白。在這種情況下,唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞中可引入編碼感興趣的糖蛋白的 核酸序列。編碼感興趣的糖蛋白的核酸序列,可穩(wěn)定地整合到唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞的 基因組中??蛇x地,編碼感興趣的糖蛋白的核酸序列,可瞬時引入唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞 中。換一種說法,編碼感興趣的糖蛋白的核酸序列可能是染色體外的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 熟悉將核酸引入細(xì)胞的合適載體和方法。此外,指導(dǎo)可參閱Ausubel等,見上或Sambrook & Russell,見上??捎赏僖核崦甘艿狡茐牡募?xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白的例子包括生長因子、生長因子受 體、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素和其他免疫系統(tǒng)蛋白、干擾素、紅細(xì)胞生成素、整合蛋白、地址素、 選擇蛋白、歸巢受體、T細(xì)胞受體、免疫球蛋白、單克隆抗體、可溶性主要組織相容性復(fù)合體 抗原、酶(例如,組織纖溶酶原激活物、鏈激酶、膽固醇生物合成或降解酶、促類固醇生成 酶、激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、脫氫酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、 磷脂酶、芳香酶、細(xì)胞色素等)、激素或肽受體、結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、癌蛋白質(zhì)或 原癌蛋白質(zhì)、肌蛋白、脊髓蛋白(myeloprotein)、神經(jīng)活性蛋白、腫瘤生長抑制蛋白、抗敗血 癥蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和血液蛋白(例如,凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因 子X、蛋白C、血管假性血友病因子(von Willebrand factor)等)。在一些實施方案中,糖 蛋白可包括肽標(biāo)簽,如抗體表位標(biāo)簽(例如,F(xiàn)LAG標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、6xHis標(biāo)簽等), 在其他實施方案中,糖蛋白可以是包括來自感興趣的糖蛋白的第一結(jié)構(gòu)域和來自另一種感 興趣的蛋白質(zhì)的第二結(jié)構(gòu)域的融合蛋白,其中兩個結(jié)構(gòu)域或融合在一起,或由一個或多個 另外的結(jié)構(gòu)域隔離。例如,第一結(jié)構(gòu)域可包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其一部分,而第二結(jié)構(gòu)域 可包括非免疫球蛋白多肽。多肽或其一部分可以是天然存在的多肽,可以是天然存在的多 肽的改造或改變的形式,或者可以是人工或人造的多肽。該方法還包括,在糖蛋白產(chǎn)生條件下培養(yǎng)唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員將會了解,培養(yǎng)特定類型細(xì)胞的適當(dāng)條件。在一些實施方案中,所述細(xì)胞可在生產(chǎn)少 量糖蛋白(例如,毫克-克)的小型容器中生長。在其他的實施方案中,所述細(xì)胞可在生產(chǎn) 大量糖蛋白(如,千克數(shù)量)的大型生物反應(yīng)器中維持。一般而言,相對于唾液酸酶表達(dá)未 被破壞的相同類型的細(xì)胞所產(chǎn)生的相同的糖蛋白,由唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞所產(chǎn)生的糖 蛋白將具有增強(qiáng)的唾液酸化作用。與感興趣的糖蛋白軛合的唾液酸的量,可通過本領(lǐng)域已 知的幾個測定之一或使用商用試劑盒測量。經(jīng)過一段時間后,通常將收集細(xì)胞和/或培養(yǎng)基,并可以從中純化感興趣的 糖蛋白。適當(dāng)?shù)募兓椒òㄓH和色譜、免疫親和色譜、疏水相互作用色譜、離子交換 色譜、尺寸排阻色譜、沉淀、透析,以及它們的組合。參見,例如,Roe(編輯),Protein Purification Techniques :A Practical Approach(蛋白質(zhì)純化技術(shù)一種實用方法),Oxford University Press,第二版,2001。熟練的技術(shù)人員將能夠選擇適用于感興趣的特 定糖蛋白的方法。(IV)試劑盒本發(fā)明還有一個方面包括試劑盒,該試劑盒用于產(chǎn)生包括增強(qiáng)的唾液酸化作用的 糖蛋白。通常地,試劑盒包括本發(fā)明的細(xì)胞系,其中細(xì)胞系包括至少一種非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶 的受破壞的表達(dá)。在一些實施方案中,該細(xì)胞系還可包括細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。 適用于本發(fā)明試劑盒的唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞在上文第(II)部分中描述。該試劑盒還 可包括使用說明書。在一個實施方案中,該試劑盒還可包括培養(yǎng)唾液酸酶受到破壞的細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐?養(yǎng)基。在另一個實施方案中,該試劑盒還可包括將編碼感興趣的糖蛋白的核酸序列引入唾 液酸酶受到破壞的細(xì)胞的構(gòu)建體(例如,質(zhì)粒、病毒等)。在另一個實施方案中,該試劑盒也 還可包括用于檢測和/或純化本發(fā)明中細(xì)胞所產(chǎn)生的糖蛋白的試劑。合適試劑的非限制性 例子包括PCR引物、多克隆抗體、單克隆抗體、親和色譜介質(zhì)、免疫親和色譜介質(zhì),及類似試 劑。在優(yōu)選的實施方案中,該試劑盒包括CHO細(xì)胞系,所述細(xì)胞系包括受破壞的唾液 酸酶表達(dá)。在一個實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :2組成的唾液酸酶的受破壞 的表達(dá)。在另一個實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :4組成的唾液酸酶的受破壞 的表達(dá)。在另一個實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4組成的唾 液酸酶的受破壞的表達(dá)。在進(jìn)一步的實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :5組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。在另一個實施方案中,CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5組成的唾液酸酶的受破壞的表達(dá)。在另一個可選的實施方案中, CHO細(xì)胞系包括由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ IDNO 5組成的唾液酸酶的受破壞的 表達(dá)。優(yōu)選地,唾液酸酶的表達(dá)通過RNAi破壞。^X為方便理解本發(fā)明,下面定義了 一些術(shù)語。本文中所使用的術(shù)語“互補(bǔ)”是指雙鏈核酸通過特定的氫鍵進(jìn)行堿基配對(即 5’ -AGTC-3’與互補(bǔ)序列3’ -TCAG-5’配對)的締合。兩個單鏈分子可能完全互補(bǔ),即所有 的堿基對是互補(bǔ)的,并且沒有錯配??蛇x地,兩個單鏈分子可能大體互補(bǔ),即至少一個錯配 存在于兩條鏈之間。本文中所使用的短語“受破壞的表達(dá)”,是指編碼多肽的核酸序列的操控使得沒有 合成多肽(即敲除)或以降低的水平合成多肽(即敲低)。表達(dá)可能會在幾個水平受到破 壞。例如,編碼多肽的DNA可能會被改變,使得沒有功能信使RNA,和因此,沒有功能蛋白被 合成。可選地,信使RNA可能受到影響,使得不能合成多肽或者以降低的水平合成多肽。本文中所使用的術(shù)語“雜交”,指的是在包括兩個互補(bǔ)的單鏈核酸分子的堿基之間 進(jìn)行氫鍵合或堿基配對以形成雙鏈雜合體或雙鏈體的過程?!半s交”的嚴(yán)格性通常由溫度和 離子強(qiáng)度條件確定。核酸雜合體穩(wěn)定性一般以解鏈溫度或Tm表示,這是雜合體在確定條件 下有50%變性的溫度。對方程式進(jìn)行推導(dǎo)以便估算給定雜合體的Tm ;該方程式考慮了核酸 中的G+C含量、雜合體的性質(zhì)(如DNA:DNA,DNA:RNA等)、核酸探針的長度等(參見,例如, Sambrook和Russell,見上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解,在基于雜交的反應(yīng)過程中操控哪一個參數(shù)來優(yōu)化雜交。然而,在一些基于雜交的反應(yīng)中,如聚合酶反應(yīng)、擴(kuò)增反應(yīng)等,反應(yīng)溫度 通常決定了雜交的嚴(yán)格性。此外,溫度通常還決定體內(nèi)反應(yīng)過程中的雜交嚴(yán)格性。本文中所使用的術(shù)語“同一性”或“同一的”,是指當(dāng)比對最大一致性時,兩個核苷 酸序列或兩個氨基酸序列相同的程度。核苷酸序列之間的最優(yōu)比對和百分比同一性可采 用 Altschul 等人的 BLASTN 算法(J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990)確定;而兩個氨基酸 序列之間的最優(yōu)比對和百分比同一性可采用Karlin和Altschul的BLASTP算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 =2264-2268,1993)確定。在 NCBI 網(wǎng)站上,這些算法被納入 BLAST 程 序(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。為了獲得用于比較目的的缺口比對,可以如 Altschul 等人(Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402,1997)描述的使用缺口 BLAST。當(dāng)使用 BLAST和缺口 BLAST程序時,使用各自程序的默認(rèn)參數(shù)。序列同一性的百分比通過在比較窗 口內(nèi)比較兩個優(yōu)化比對的序列而確定,其中比較窗口中的序列部分與用于兩個序列最優(yōu)比 對的參考序列(其不包括添加或缺失)相比,可包括添加或缺失(即缺口)。所述百分比通 過以下來計算確定兩個序列中相同核苷酸出現(xiàn)的位置數(shù)以獲得匹配位置數(shù),將匹配位置 數(shù)除以在比較窗口中的位置總數(shù),并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分比。術(shù)語“核酸”是指包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。該核苷酸可以是標(biāo) 準(zhǔn)核苷酸(即腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸類似物。核苷酸類似物是指具有修 飾的嘌呤或嘧啶堿基或修飾的核糖部分的核苷酸。核苷酸類似物可以是天然存在的核苷 酸(如肌苷)或非天然存在的核苷酸。對核苷酸的糖或堿基部分修飾的非限制性例子包 括添加(或去除)乙?;?、氨基、羧基、羧甲基、羥基、甲基、磷?;土虼蓟约笆褂闷渌?原子取代堿基的碳原子和氮原子(例如,7-脫氮嘌呤)。核苷酸類似物還包括二脫氧核 苷酸、2’ -0-甲基核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和嗎啉代核苷酸(morpholinos)。 核苷酸可通過磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯(phosphothioate)鍵、亞磷酰胺鍵或磷酰二胺 (phosphorodiamidate)鍵相連接?!巴僖核崦浮笔谴呋┒送僖核釟埢鶑奶擒椇衔锶缣堑鞍姿獾囊唤M酶。唾液酸酶 也被稱為外_ α -唾液酸酶(exo- α -sialidase)、神經(jīng)氨酸酶或乙酰神經(jīng)氨酸酶。當(dāng)引用本發(fā)明或其優(yōu)選實施方案中的元素時,冠詞〃 一(a) “、〃一 (an)“、“該 (the)“和〃所述(said)“旨在說明有一種或多種元素。術(shù)語〃包括(comprising)“、“ 包括(including)"和"具有(having)"預(yù)期為包容性的,說明除了列出的元素還有其他 元素。已詳細(xì)描述了本發(fā)明,明顯的是修飾和改變是可能的,而不背離所附權(quán)利要求中 定義的本發(fā)明的范圍。
實施例包括以下實施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解,下面 實施例中所公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實施中良好運作的技術(shù)。但 是,根據(jù)本公開內(nèi)容,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識到,所公開的具體實施方案中可以進(jìn)行很多 變化,且仍得到相似或類似結(jié)果,而不背離本發(fā)明的精神和范圍,因此,所有提到的內(nèi)容將 被解釋為說明性的,而不是限制性的含義。實施例1. CHO細(xì)胞中另外的唾液酸酶基因的分離。
已在人、小鼠和大鼠中鑒定出四種唾液酸酶基因(Neul、Neu2、Neu3和Neu4),并已 良好表征。這些唾液酸酶表現(xiàn)出不同的酶活性、底物偏好和亞細(xì)胞位置。然而,到目前為 止,只有一種唾液酸酶基因已在CHO細(xì)胞中表征。這種基因編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶(即Neu2) (Gramer MJ, Goochee CF. (1993) Biotechnol Prog,9 :366)。本研究的目的是確定 CHO 細(xì)胞 是否包含其他唾液酸酶基因。采用RT_PCR、5,/3,RACE (cDNA末端的快速擴(kuò)增)和其他標(biāo)準(zhǔn)方法,從CHO細(xì)胞中 分離和克隆了其他三種唾液酸酶基因。CHO Neul編碼具有410個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),而 CHO Neu3編碼具有417個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(表1)。另一方面,CHO Neu4似乎是CHO細(xì) 胞中的假基因。Neul和Neu3兩者與其他物種中的其對應(yīng)物享有高度相似性(表2)。表1. CHO細(xì)胞中新唾液酸酶的特性
cDNASEQ ID NO 蛋白質(zhì)SEQ ID NO Neul1463bp1410aa2Neu31833bp3417aa4表2.唾液酸酶蛋白之間的百分比相似性
CHO唾液酸酶人 唾液酸酶小鼠 唾液酸酶大鼠唾液酸酶Neul (SEQ ID NO 2)86. 5%95. 4%95. 6%Neu277. 1 %86. 5%87. 1%(SEQ ID NO 5)Neu3 (SEQ ID NO 4)76. 8%81. 1%83. 3%實施例2. CHO Neul和CHO Neu3是唾液酸酶進(jìn)行酶促唾液酸酶活性研究,以證實由CHO細(xì)胞中有預(yù)期功能的這兩種新基因編 碼的蛋白質(zhì)。簡言之,Neul基因(SEQ ID NO 1)的編碼區(qū)和Neu3基因(SEQ ID NO 3)的 編碼區(qū),以及以前報道的 Neu2 基因(Ferrari 等.(1994)Glycobiology 4(3) :367_373)的 編碼區(qū)被克隆入pcDNA3. 1哺乳動物表達(dá)載體。然后,該表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入C0S7細(xì)胞,以過 表達(dá)唾液酸酶蛋白。單獨的pcDNA3. 1載體也轉(zhuǎn)染入C0S7細(xì)胞作為模擬轉(zhuǎn)染。含綠色熒光 蛋白(GFP)的表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染入C0S7細(xì)胞,以標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24小時后,通過超聲溶解細(xì)胞。細(xì)胞碎片在4°C,1000 X g下離心IOmin除去, 收集上清液部分用于酶活性。如前所述(Gramer等.(1993)Biotechnol Prog 9:366-373),
16使用ImM的4-甲基傘形酮-Neu5Ac作為底物,進(jìn)行唾液酸酶測定。對于每個溶胞產(chǎn)物, IOOyg蛋白質(zhì)被用于測定。該測定進(jìn)行三次。在使用GFP讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后,CHO Neul和Neu3 蛋白質(zhì)相比于陰性對照(模擬轉(zhuǎn)染)和陽性對照(Neu2),有顯著的唾液酸酶活性(圖1)。 事實上,Neu3蛋白質(zhì)具有Neu2活性約6_15倍以上的活性。為了進(jìn)一步考察這些唾液酸酶蛋白的活性,在兩種濃度的兩種不同唾液酸酶抑制 劑(Neu5Ac和Neu5AC2en)存在下,進(jìn)行了唾液酸酶測定。如圖2所示,Neu5Ac2en對所有 唾液酸酶具有比Neu5Ac強(qiáng)的抑制作用。使用CH0Neu3為例,0. ImM Neu3Ac2en降低活性約 30%,而0. 5mM Neu3Ac2en降低活性約60%。這些數(shù)據(jù)表明,新鑒定的CHO基因(Neul和 Neu3)編碼唾液酸酶。實施例3. CHO唾液酸酶的亞細(xì)胞定位為鑒定這兩個新CHO唾液酸酶的亞細(xì)胞位置,進(jìn)行了使用共聚焦掃描顯微鏡技術(shù) 的免疫細(xì)胞化學(xué)。概括地講,編碼8個氨基酸殘基(DYKDDDDK)的Flag標(biāo)簽被克隆到Neu 表達(dá)構(gòu)建體的3’ -末端,以表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白。帶有Flag標(biāo)簽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染 入C0S7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后,使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行細(xì)胞免疫染色。結(jié)果示于圖3。唾液酸酶的亞細(xì)胞位置由FITC軛合的抗FLAG抗體產(chǎn)生的綠色 熒光表示。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也用細(xì)胞器標(biāo)志物進(jìn)行免疫染色在圖3中,溶酶體標(biāo)志物(Lyso Tracker DND-99)由紅色熒光表示,和質(zhì)膜標(biāo)志物(麥胚凝集素647)由藍(lán)色信號表示。本 研究顯示,Neul位于溶酶體;其染色模式幾乎與溶酶體標(biāo)志物的染色模式一樣。Neu3位于 質(zhì)膜,以與質(zhì)膜標(biāo)志物染色模式相似的方式。此外,陽性對照Neu2顯示了所預(yù)期的細(xì)胞質(zhì) 染色。實施例4.采用SiRNA技術(shù)的基因沉默采用小干擾RNA(SiRNA)技術(shù),敲低三種CHO唾液酸酶基因的每一種的表達(dá)。根 據(jù)cDNA序列,設(shè)計并合成了幾個針對CHO唾液酸酶基因(Neul、Neu2和Neu3)的每種 基因的siRNA。序列示于表3。這些siRNA轉(zhuǎn)染入穩(wěn)定表達(dá)人干擾素、的CHO細(xì)胞系 (CHO-hlFN y ) 0該轉(zhuǎn)染重復(fù)操作兩次。轉(zhuǎn)染48小時后,收獲細(xì)胞。RNA和蛋白質(zhì)從轉(zhuǎn)染細(xì) 胞中分離。使用標(biāo)準(zhǔn)程序,進(jìn)行了利用基因特異性引物的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和 定量 RT-PCR(O-RT-PCR)。 *大寫字母表示19 nt siRNA序列,小寫字母表示3’突出端。如圖4所示,RT-PCR分析表明,每組siRNA中的至少兩種能夠降低每個基因的 mRNA 表達(dá)。Neul-S2、Neul-S3 和 Neul_S4 降低了 Neul mRNA 的表達(dá),Neu2_S2 和 Neu2_S3 降 低了 Neu2 mRNA的表達(dá),而Neu3-Sl和Neu3-S2降低了 Neu3 mRNA的表達(dá)。定量逆轉(zhuǎn)錄酶 (Q-RT)PCR分析表明,與靶向不相關(guān)核酸序列(GFP核酸序列)的對照siRNA相比,針對CHO 唾液酸酶基因的siRNA顯著地降低了 mRNA的表達(dá)水平(即 70% -95% )(圖5)。Neul mRNA 表達(dá)降低了約 90% (圖 5A) ;Neu2 mRNA 表達(dá)降低了約 70-85% (圖 5B)禾Π Nue3 mRNA 表達(dá)降低了約95% (圖5C)。為了進(jìn)一步證實蛋白質(zhì)水平上的基因沉默效應(yīng),進(jìn)行了唾液酸酶活性測定。粘附 CHO-hlFNy細(xì)胞懸浮在化學(xué)成份確定且不合動物組分的培養(yǎng)基中。上述鑒定的陽性siRNA 通過電穿孔轉(zhuǎn)染入CHO-hlFNY細(xì)胞的懸浮液,重復(fù)兩次。為了研究潛在的協(xié)同基因沉默效 應(yīng),每種Neu基因單獨和組合(即兩種或三種基因沉默)沉默。轉(zhuǎn)染72小時后,收獲細(xì)胞, 并用預(yù)冷的IX PBS緩沖液洗滌??俁NA和蛋白質(zhì),從siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分別分離。如 上所述,總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄(和Q-RT PCR)。蛋白質(zhì)用于體外唾液酸酶活性測定,如實施例 2中詳述。與對照(親代CHO-hlFN γ細(xì)胞和GFP siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)相比,單個siRNA和 siRNA組合都顯著降低了唾液酸酶的活性(圖6)。最有趣的是,針對Neul和Neu3的siRNA 的組合顯著降低唾液酸酶活性至不可檢測的水平。
實施例5.利用shRNA技術(shù)的穩(wěn)定的基因沉默根據(jù)實施例4顯示的Neu mRNA和唾液酸酶的活性可使用siRNA敲低的結(jié)果,用 shRNA 技術(shù)平臺(Mission :RNAi , Sigma Aldrich, St. Louis, MO)穩(wěn)定地敲低 CHO hIFNy 細(xì)胞中Neu基因的表達(dá)。將編碼每種唾液酸酶基因(Neul_S4、Neu2_S3、Neu3_S2)的有效siRNA的DNA片 段克隆到pLKO. 1-puro shRNA表達(dá)載體。DNA測序確認(rèn)后,質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞, 以產(chǎn)生包裝有shRNA盒的慢病毒。使用含shRNA盒的慢病毒感染CH0_hIFN γ細(xì)胞懸浮液 和進(jìn)行嘌呤霉素選擇后,獲得了攜帶Neul、Neu2和Neu3基因shRNA盒的CH0_hIFN γ細(xì) 胞。進(jìn)行Q-RTPCR來證實在mRNA水平上的基因沉默效應(yīng)(圖7)。在Neul-shRNA細(xì)胞中, Neul (Neul-S4)的 mRNA 表達(dá)敲低超過 95 % (圖 7A),在 Neu2_shRNA 細(xì)胞中,Neu2 (Neu2_S3) 的敲低為約50% (圖7b),而在Neu3-shRNA細(xì)胞中,Neu3 (Neu3_S2)的敲低超過70% (圖 7 C)。如上所詳述的,通過測量唾液酸酶活性,還在蛋白質(zhì)水平證實了基因敲低效應(yīng)。與 對照(非靶向shRNA)相比,針對所有三種唾液酸酶基因的shRNA顯著降低了 CHO-hlFNy 細(xì)胞中唾液酸酶的活性(見圖8)。攜帶Neu3-S2shRNA的細(xì)胞具有最顯著的唾液酸酶活性 的降低。為了評估shRNA是否影響細(xì)胞生長和/或蛋白質(zhì)的生產(chǎn),分析了這些CHO-ShRNA 細(xì)胞的生長及其對人干擾素Y蛋白的生產(chǎn)。簡言之,以 200,000細(xì)胞/毫升活細(xì)胞密度 將細(xì)胞接種于補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺的培養(yǎng)基(化學(xué)成分確定且不含動物組分)中。細(xì)胞生 長測定重復(fù)進(jìn)行兩次。細(xì)胞在37°C,含5%C02&5L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。在適當(dāng)?shù)臅r間點, 收集培養(yǎng)基樣品用于進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。5L生物反應(yīng)器細(xì)胞生長數(shù)據(jù)表明,相比于非靶向shRNA對照細(xì)胞,無shRNA負(fù)面影 響細(xì)胞生長(圖9)。人IFN γ的生產(chǎn)使用人IFN γ ELISA試劑盒(eBioscience,San Diego, CA)測量。如圖10所示,相比于非靶向?qū)φ占?xì)胞,無shRNA負(fù)面影響蛋白質(zhì)生產(chǎn)。事實上, 通過一些唾液酸酶shRNA靶向細(xì)胞生產(chǎn)高水平的人類IFN γ蛋白。采用250毫升搖瓶得到 了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例6. CHO Neu基因的沉默產(chǎn)生了具有增加的唾液酸含量的糖蛋白通過HPLC,分析了唾液酸酶shRNA靶向細(xì)胞和非靶向shRNA對照細(xì)胞所產(chǎn)生的人 IFNy蛋白中的唾液酸水平。廢培養(yǎng)基樣品收集自5L生物反應(yīng)器培養(yǎng)物的穩(wěn)定期(第6 天,細(xì)胞生存力約95% )和死亡期(第13天,細(xì)胞生存力約20% )。通過免疫親和純化從 細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化人干擾素Y蛋白。簡言之,經(jīng)離心和過濾除去細(xì)胞碎片后,將30毫升 蛋白質(zhì)樣品負(fù)載到與hIFNy抗體軛合的親和柱上。洗滌柱后,hIFNy蛋白用洗脫緩沖液 洗脫。在AKTA Explorer 100色譜系統(tǒng)(Amersham Biosciences)上進(jìn)行純化。純化的蛋 白通過ELISA定量,如前所述。通過HPLC對純化的hIFN γ蛋白的唾液酸化作用進(jìn)行分析。簡言之,將50 μ g純 KWhIFNY蛋白樣品冷凍干燥,并重新懸浮于含有2N乙酸的100 μ 1超純水中。該樣品在 80°C水解3小時。之后,過濾樣品,并快速真空干燥(speed-vac dried)。釋放的唾液酸殘 基用熒光化合物1,2_ 二氨基-4,5-(亞甲二氧基)苯(DMB)衍生化,然后用C18反相柱進(jìn) 行 HPLC。
數(shù)據(jù)示于圖11。在第6天,由Neul和Neu2shRNA CHO細(xì)胞產(chǎn)生的hIFN γ蛋白質(zhì) 中的唾液酸水平,與非靶向shRNA對照無顯著差異(圖11Α)。雖然Neu2shRNA細(xì)胞中的 唾液酸水平似乎略高,但不顯著(Neu2 1.945士0. Illpmol唾液酸/pmol hIFNy vs.非靶 向1.600士0. 090pmol 唾液酸/pmol hIFN γ,ρ = 0. 0528,η = 4)。然而,與來自對照細(xì) 胞的蛋白相比,來自Neu3 shRNA CHO細(xì)胞的hIFN γ蛋白的唾液酸含量顯著提高(Neu3 2. 133 士 0. IOlpmol 唾液酸 /pmol hIFNy vs.非革巴向:1. 600 士 0. 090pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ < 0. 01,η = 4)。在第13天,由NeulshRNA CHO細(xì)胞產(chǎn)生的hIFN γ的唾液酸化作用沒有明 顯改善。然而,Neu2 細(xì)胞(Neu2 4. 948士0. 150pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , vs.非靶 向4· 113士0. 113pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ < 0. 01,η = 4)禾口 Neu3 細(xì)胞(Neu3 5. 175士0. 414pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , vs.非靶向4. 113士0. 113pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ <0.05,η = 4)產(chǎn)生的hIFNy蛋白中的唾液酸水平提高了(圖11B)。由Neu3 和Neu2 shRNA CHO細(xì)胞產(chǎn)生的人干擾素γ蛋白的唾液酸化作用的提高表明,唾液酸酶基 因(Neu3和Neu2)的下調(diào)降低了總唾液酸酶的活性,因而降低了 CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白 中的唾液酸水平。這些實施例表明,采用RNA干擾平臺的靶向基因沉默,是一種提高蛋白質(zhì) 糖基化的有效途徑。
權(quán)利要求
一種細(xì)胞系,所述細(xì)胞系包括至少一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整合的核酸序列的受破壞的表達(dá),所述唾液酸酶的氨基酸序列選自由以下組成的組(a)與SEQ ID NO2至少約95%同一的序列,和(b)與SEQ ID NO4至少約80%同一的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述氨基酸序列選自由以下組成的組(a)與SEQ ID NO :2至少約97%同一的序列,和(b)與SEQ IDNO :4至少約90%同一的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述氨基酸序列主要由選自SEQIDNO :2和SEQ ID NO :4組成的組的序列組成。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述氨基酸序列由選自SEQIDNO :2和SEQ ID NO 4組成的組的序列組成。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述核酸序列的表達(dá)通過選自以下組成的組的技 術(shù)破壞RNA干擾、同源重組和位點特異性重組。
6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞系,其中RNA干擾(RNAi)通過選自以下組成的組的RNAi 劑介導(dǎo)短干擾RNA、短發(fā)夾RNA和RNAi表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述細(xì)胞系選自由昆蟲細(xì)胞系、哺乳動物細(xì)胞系、 嚙齒動物細(xì)胞系、非人靈長類動物細(xì)胞系和人類細(xì)胞系組成的組。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,其中所述細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞系,其中所述唾液酸酶由SEQID N0:2組成。
10.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞系,其中所述唾液酸酶由SEQID N0:4組成。
11.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞系,其中所述唾液酸酶由SEQID NO :2和SEQ ID NO 4 組成。
12.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系,所述細(xì)胞系還包括編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整 合的核酸序列的受破壞的表達(dá),所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:5至少約 85% 同一。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞系,其中氨基酸序列主要由SEQIDNO :5組成。
14.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞系,其中氨基酸序列由SEQID NO :5組成。
15.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞系,其中所述核酸序列的表達(dá)通過選自以下組成的組的 技術(shù)破壞RNA干擾、同源重組和位點特異性重組。
16.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞系,其中RNA干擾(RNAi)通過選自以下組成的組的RNAi 劑介導(dǎo)短干擾RNA、短發(fā)夾RNA和RNAi表達(dá)載體。
17.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞系,其中所述細(xì)胞系選自由昆蟲細(xì)胞系、哺乳動物細(xì)胞 系、嚙齒動物細(xì)胞系、非人靈長類動物細(xì)胞系和人類細(xì)胞系組成的組。
18.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞系,其中所述細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
19.如權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :2組成。
20.如權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDN0:4組成。
21.如權(quán)利要求18所述的細(xì)胞系,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :2和SEQ ID NO 4 組成。
22.—種生產(chǎn)糖蛋白的方法,所述方法包括在細(xì)胞中表達(dá)編碼所述糖蛋白的核酸序列, 所述細(xì)胞包括至少一種編碼非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整合的核酸序列的受破壞的表達(dá), 所述唾液酸酶的氨基酸序列選自以下組成的組(a)與SEQ ID NO 2至少約95%同一的序列,和(b)與SEQ IDNO 4至少約80%同一的序列,其中所述糖蛋白相對于適當(dāng)對照,具有 增加的唾液酸化作用。
23.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述唾液酸酶的氨基酸序列選自由以下組成的 組(a)與SEQ ID NO 2至少約97%同一的序列,和(b)與SEQ ID NO 4至少約90%同一 的序列。
24.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述唾液酸酶的氨基酸序列主要由選自SEQID NO 2和SEQ ID NO 4組成的組的序列組成。
25.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述唾液酸酶的氨基酸序列由選自SEQID NO 2 和SEQ ID NO 4組成的組的序列組成。
26.如權(quán)利要求22所述的方法,其中編碼所述唾液酸酶的所述核酸序列的表達(dá)通過選 自以下組成的組的技術(shù)破壞RNA干擾、同源重組和位點特異性重組。
27.如權(quán)利要求26所述的方法,其中RNA干擾(RNAi)通過選自以下組成的組的RNAi 劑介導(dǎo)短干擾RNA、短發(fā)夾RNA和RNAi表達(dá)載體。
28.如權(quán)利要求22所述的方法,其中編碼所述糖蛋白的所述核酸序列選自由染色體整 合的核酸序列和染色體外核酸序列組成的組。
29.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述細(xì)胞選自由昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、嚙齒動 物細(xì)胞、非人靈長類動物細(xì)胞和人類細(xì)胞組成的組。
30.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :2組成。
32.如權(quán)利要求30所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :4組成。
33.如權(quán)利要求30所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO 2和SEQ ID N0:4組成。
34.如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述細(xì)胞還包括編碼細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的染色體整 合的核酸序列的受破壞的表達(dá),所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:5至少約 85% 同一。
35.如權(quán)利要求34所述的方法,其中所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列主要由SEQID NO 5組成。
36.如權(quán)利要求34所述的方法,其中所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的氨基酸序列由SEQID NO 5組成。
37.如權(quán)利要求34所述的方法,其中編碼所述細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶的所述核酸序列的表達(dá) 通過選自以下組成的組的技術(shù)破壞RNA干擾、同源重組以及位點特異性重組。
38.如權(quán)利要求37所述的方法,其中RNA干擾(RNAi)通過選自以下組成的組的RNAi 劑介導(dǎo)短干擾RNA、短發(fā)夾RNA和RNAi表達(dá)載體。
39.如權(quán)利要求34所述的方法,其中所述細(xì)胞選自由昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、嚙齒動 物細(xì)胞、非人靈長類動物細(xì)胞和人類細(xì)胞組成的組。
40.如權(quán)利要求34所述的方法,其中所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求40所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :2組成。
42.如權(quán)利要求40所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :4組成。
43.如權(quán)利要求40所述的方法,其中所述非細(xì)胞質(zhì)唾液酸酶由SEQIDNO :2和SEQ IDN0:4組成。
44.一種分離的核酸,該核酸編碼氨基酸序列由SEQ ID NO :2組成的多肽。
45.一種分離的核酸,該核酸編碼氨基酸序列由SEQ ID NO :4組成的多肽。
46.一種純化的多肽,該多肽的氨基酸序列由SEQ ID N0:2組成。
47.一種純化的多肽,該多肽的氨基酸序列由SEQ ID N0:4組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有增強(qiáng)的唾液酸化作用的糖蛋白的組合物和方法。特別地,本發(fā)明提供了包括受破壞的唾液酸酶表達(dá)的細(xì)胞系和使用該細(xì)胞系來生產(chǎn)具有增強(qiáng)的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。
文檔編號C12N15/113GK101896616SQ200880111449
公開日2010年11月24日 申請日期2008年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者J·S·羅斯, 張民 申請人:西格馬-奧利奇有限公司