含有唾液酸的糖鏈的制造方法
【專利摘要】已知唾液酸以α2,3連接或α2,6連接于糖鏈的非還原末端的糖鏈的重要性，存在對此糖鏈化合物的工業(yè)化生產(chǎn)的需求。尤其，在例如制造糖蛋白藥物時(shí)，在控制唾液酸的連接模式（α2,6連接或α2,3連接）的同時(shí)，大規(guī)模生產(chǎn)均一結(jié)構(gòu)的糖鏈?zhǔn)遣豢苫蛉钡?。對?分支型或4分支型的N-型復(fù)合型糖鏈，一般認(rèn)為難以化學(xué)合成在所有的非還原末端均具有唾液酸的糖鏈，目前尚未報(bào)道過化學(xué)合成的該糖鏈。酶學(xué)上亦難以有效率地制備此糖鏈。本發(fā)明中，新發(fā)現(xiàn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶具有在CMP存在下分解反應(yīng)產(chǎn)物中的唾液酸的活性，發(fā)現(xiàn)可通過酶而分解CMP，從而有效率地制造含唾液酸的糖鏈。進(jìn)而還發(fā)現(xiàn)，對于傳統(tǒng)上難以合成的以α2,6連接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖鏈，可以以2分支型糖鏈為原料，進(jìn)行糖鏈延長反應(yīng)，在不進(jìn)行各步酶反應(yīng)后的純化的情況下，以一鍋法合成而高產(chǎn)率地進(jìn)行制備。
【專利說明】含有唾液酸的糖鏈的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可應(yīng)用于糖蛋白等藥物、分析儀器用的標(biāo)準(zhǔn)品、學(xué)術(shù)用試劑、糖鏈陣列等的糖鏈的合成法。
【背景技術(shù)】
[0002]先前的大量研究表明連接于蛋白質(zhì)的糖鏈結(jié)構(gòu)在該蛋白質(zhì)的生物活性的機(jī)能上扮演著重要角色。并且，糖鏈也稱為“細(xì)胞的臉”。已知在細(xì)胞表面上表達(dá)的糖鏈與細(xì)胞間相互作用或信號傳遞、發(fā)育或分化、受精、癌轉(zhuǎn)移等相關(guān)。關(guān)于哺乳類的糖鏈修飾，為人熟知的主要是Asn連接型、黏蛋白型、蛋白多糖型糖基化和其它的類型。這些修飾通過不同的生物合成途徑，形成它們各自固有的糖鏈結(jié)構(gòu)。已知的是在這樣的糖鏈結(jié)構(gòu)的非還原末端側(cè)，加成海藻糖或唾液酸等糖。
[0003]唾液酸是對作為連接有氨基或羧基的特殊的9碳糖的神經(jīng)氨酸中氨基或羥基被取代的化合物的總稱。5位的氨基被乙?；腘-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)可能是自然界中最多的形式。另外，還已知有5位的氨基是以乙醇?；揎椀腘-乙醇酰基神經(jīng)氨酸或去氨基神經(jīng)氨酸KDN等各種結(jié)構(gòu)。
[0004]據(jù)報(bào)道，含有唾液酸的糖鏈不僅存在于人類或老鼠等哺乳類中，還存在于脊椎動物或棘皮動物，甚至原生生物或具有革蘭氏陰性病原性的一些細(xì)菌中。通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶制備該含有唾液酸的糖鏈。唾液酸轉(zhuǎn)移酶用加成于胞苷一磷酸(CMP)的唾液酸作為底物供體，通過存在于唾液酸供體的2位的醛基，將唾液酸轉(zhuǎn)移至例如半乳糖的3位或6位、N-乙酰半乳糖胺的6位、或另一唾液酸的8位等。例如轉(zhuǎn)移唾液酸于半乳糖的3位的酶被稱為α _2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移唾液酸于半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的6位的酶被稱為α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)移唾液酸于另一唾液酸的8位的酶被稱為α-2，8-聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶。其中，關(guān)于α-2，6-唾`液酸轉(zhuǎn)移酶，已知人類中作為轉(zhuǎn)移唾液酸于半乳糖的6位的酶，有ST6Gal-1和ST6Gal-1I，及作為轉(zhuǎn)移唾液酸于N-乙酰半乳糖胺的6位的酶，有ST6GalNAc-1、ST6GalNAc-11、ST6GalNAc-1II 和 ST6GalNAc_IV。
[0005]ST6Gal-1將作為具有連接于4位的半乳糖的N-乙酰葡糖胺的N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)(Gal β l-4GlcNAc)識別為底物受體，從而修飾一些糖脂質(zhì)或N-連接型糖鏈的非還原末端結(jié)構(gòu)。其對底物受體的特異性主要是利用2分支或3分支的N-連接型糖鏈進(jìn)行分析。據(jù)報(bào)道，唾液酸容易轉(zhuǎn)移于α?，3連接的甘露糖的分支上的乳糖胺(參考非專利文獻(xiàn)I)。關(guān)于2分支或3分支的N-連接型糖鏈的制備，因?yàn)槔珉y以從天然物中提取糖基轉(zhuǎn)移酶的底物，和酶的大規(guī)模制備法尚未確立等，所以很難有效率地大量地生產(chǎn)這些糖鏈。
[0006]另一方面，關(guān)于4分支之N-連接型糖鏈的α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，已通過使用來自牛的ST6Gal-1來進(jìn)行研究。在糖鏈的4個(gè)N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)中，唾液酸最容易轉(zhuǎn)移至在α?，3連接的甘露糖上以β?，2連接加成的N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)上，然后是在al，3連接的甘露糖上以β?，4連接加成的N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的是在al，6連接的甘露糖上加成的2個(gè)N-乙酰乳糖胺結(jié)構(gòu)中任一者，但未發(fā)現(xiàn)含有四分子唾液酸的產(chǎn)物(參考非專利文獻(xiàn)2)。另外，人ST6Gal-1，以及ST6Gal-1I已被報(bào)道具有底物特異性(參考非專利文獻(xiàn)3和4。)。但對于以4分支的N-連接型糖鏈為受體底物的唾液酸加成還未進(jìn)行研究。
[0007]據(jù)報(bào)道，有關(guān)ST6Gal-1的因CMP的產(chǎn)物抑制，其被0.25mM的CMP抑制49% (參考非專利文獻(xiàn)5)，或抑制71% (參考非專利文獻(xiàn)6)。
[0008]另一方面，作為來自細(xì)菌的α 2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，報(bào)道有Photobacteriumdamsel a JT0160 (參考非專利文獻(xiàn) 7)、Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (參考非專利文獻(xiàn)8)等，但關(guān)于以4分支的N-連接型糖鏈為受體底物的唾液酸的加成，它們中的任一種均未被研究。
[0009]另外，關(guān)于4分支的N-連接型糖鏈的α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將其中四分子的唾液酸以α 2，3連接加成的4分支N-連接型糖鏈加成于紅細(xì)胞生成素(EPO)等糖蛋白(參考非專利文獻(xiàn)9)，據(jù)報(bào)道，唾液酸加成對糖蛋白在血中的穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)(參考非專利文獻(xiàn)10)。雖然這些結(jié)構(gòu)為天然中存在的結(jié)構(gòu)，但未見有實(shí)際上大量制備四分子的唾液酸以α 2，3連接加成的4分支的N-連接型糖鏈的報(bào)告例。這是因?yàn)?，就成本而言，用作原料的EPO等很難進(jìn)行大量的制備，并且在酶合成中，也很難由其他天然物廉價(jià)地制備成作為受體的去唾液酸4分支型N-連接型糖鏈。并且，已知的是在EPO中也混合存在加成于糖蛋白的α 2，3連接及α 2，6連接的4分支型N-連接型糖鏈等(參考非專利文獻(xiàn)11)。
[0010]關(guān)于加成于抗體藥物或細(xì)胞因子等糖蛋白藥物中的N-型糖鏈的唾液酸的連接模式，有報(bào)道稱加成α 2，6連接唾液酸的蛋白質(zhì)比加成α 2，3連接唾液酸的蛋白質(zhì)在血中消失得更快。對于糖蛋白從血中清除，糖蛋白通過與體內(nèi)的凝集素(Lectins)結(jié)合而攝入細(xì)胞內(nèi)，最終被代謝。因此，具有α 2，6連接的唾液酸的糖蛋白有希望通過結(jié)合特異的凝集素而被以特異于器官的方式攝入，以及有希望靈活地用于藥物傳遞。另外，已知的是糖蛋白根據(jù)分子尺寸，在腎臟中隨尿液排出。據(jù)報(bào)道，紅細(xì)胞生成素的表觀分子尺寸隨其糖鏈的分支數(shù)目的增多而增加，從而導(dǎo)致在血中清除得慢。因此，具有α 2，3連接和/或α 2，6連接的唾液酸的糖鏈，尤其是具有四分子的α 2，3連接和/或α 2，6連接的唾液酸的4分支N-型糖鏈的合成，有希望應(yīng)用于生產(chǎn)不同的臟器攝入效率的糖蛋白藥物。
[0011]另外，人流感病毒可識別在細(xì)胞表面表達(dá)的糖鏈中的α 2，6連接的唾液酸而進(jìn)行感染，而來自鳥類的流感病毒可識別α 2，3連接的唾液酸而進(jìn)行感染。不僅流感病毒，許多病毒也通過識別待感染細(xì)胞的糖鏈結(jié)構(gòu)而感染該細(xì)胞，所以有必要使用各種糖鏈，來調(diào)查與病毒的結(jié)合特異性。因此，具有α 2，3連接或α 2，6連接的唾液酸的糖鏈可作為用于研究病毒結(jié)合特異性的材料，而應(yīng)用于病毒檢測等。
[0012][文獻(xiàn)列表]
[0013][非專利文獻(xiàn)]
[0014][非專利文獻(xiàn) I]:van den Eijnden DH et al., Biochem Biophys ResCommun.，92(3)，839-45(1980)
[0015][非專利文獻(xiàn) 2] Joziasse et al.，JBC, 262，2025-2033 (1987)
[0016][非專利文獻(xiàn) 3]:Takashima et al.，JBC, 277，45719-45728 (2002)
[0017][非專利文獻(xiàn) 4] =Krzewinsk1-Recchi et al.，EJB, 270，950-961 (2003)
[0018][非專利文獻(xiàn) 5]:Miyazaki T et al., Glycobiology, 18, 187-194(2008)
[0019][非專利文獻(xiàn) 6]:Kleineidam et al., Glycoconj.J., 14, 57-66 (1997)[0020][非專利文獻(xiàn) 7]:Yamamoto T et al.，BBB, 62，210-214 (1998)
[0021][非專利文獻(xiàn) 8] =Yamamoto T et al.，Glycobiology, 17，1167-1174 (2007)
[0022][非專利文獻(xiàn) 9]:Takeuchi et al.，J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)
[0023][非專利文獻(xiàn) 10]:Tsuda et al.，Eur J Biochem.，188 (2)，405-11 (1990)
[0024][非專利文獻(xiàn) 11]:Takeuchi et al., J.Biol.Chem.，263 (8)，3657-63 (1988)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025](本發(fā)明要解決的技術(shù)問題)
[0026]已知具有在糖鏈的非還原末端的α 2，3連接或α 2，6連接唾液酸的糖鏈?zhǔn)呛苤匾摹τ谶@些糖鏈化合物，盡管有可能是天然存在的，但由于自天然物提取有作為天然物的稀少性、取得的困難性、安全性等問題，因此需要它們的工業(yè)化生產(chǎn)。尤其，制造抗體醫(yī)藥品或細(xì)胞因子等糖蛋白藥物或研究病毒的結(jié)合特異性等時(shí)，不可避免地需要通過控制唾液酸的連接模式(α 2，6連接或α 2，3連接)，量產(chǎn)均一結(jié)構(gòu)的糖鏈。尤其，對于3分支型或4分支型的N-型復(fù)合型糖鏈，一般認(rèn)為難以從化學(xué)上合成所有的非還原末端都具有唾液酸的糖鏈，例如對于所有的非還原末端都具有α 2，6連接唾液酸的4分支型N-型復(fù)合型糖鏈，并沒有化學(xué)合成的報(bào)道。此外，酶學(xué)上也難以有效率地制備這些具有唾液酸的3分支型或4分支型的糖鏈。
[0027]解決問題的方法
[0028]本發(fā)明的發(fā)明人等新發(fā)現(xiàn)了唾液酸轉(zhuǎn)移酶在CMP存在下分解反應(yīng)產(chǎn)物上的唾液酸的活性，還發(fā)現(xiàn)所生成的CMP可通過酶而分解，從而可有效率地制造含唾液酸的糖鏈。本發(fā)明的發(fā)明人等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)對于傳`統(tǒng)上難以合成的以α 2，6連接加成四分子唾液酸的4分支N-型糖鏈，可以通過包含以2分支型糖鏈為原料的糖鏈延長反應(yīng)的一鍋法合成，無需在各步酶反應(yīng)后進(jìn)行精制，從而可高產(chǎn)率地制備。
[0029]亦即，本發(fā)明涉及制造具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的方法，包括
[0030]在唾液酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶(phosphatase)存在下，使第一糖鏈或其衍生物與CMP-唾液酸進(jìn)行反應(yīng)，
[0031]以將唾液酸轉(zhuǎn)移至所述第一糖鏈或其衍生物的非還原末端。
[0032]在此，根據(jù)本發(fā)明的具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案，所述第一糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型復(fù)合型糖鏈或它們的衍生物。
[0033]另外，根據(jù)本發(fā)明的具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案，所述第一糖鏈或其衍生物為由下式所表示的化合物:
[0034]
【權(quán)利要求】
1.具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物的制造方法，所述制造方法包括: 在唾液酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶的存在下，使第一糖鏈或其衍生物與CMP —唾液酸進(jìn)行反應(yīng)， 以將唾液酸轉(zhuǎn)移至所述第一糖鏈或其衍生物的非還原末端。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型復(fù)合型糖鏈或其衍生物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一糖鏈或其衍生物為下式所表示的化合物:
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物為3分支型或4分支型的N-連接型復(fù)合型糖鏈，且為在糖鏈的各非還原末端都具有唾液酸的化合物或其衍生物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述具有唾液酸的第二糖鏈或其衍生物為由下式所表示的化合物，
6.具有唾液酸的糖鏈或其衍生物的制造方法，所述方法包括以下步驟:(a)在糖基轉(zhuǎn)移酶的存在下，使由下式所表示的糖鏈

7.在非還原末端具有唾液酸的糖鏈或其衍生物的制造方法，所述方法包括以下步驟: Ca)在MAGAT4和MGAT5的存在下，使去半乳糖2分支復(fù)合型糖鏈或其衍生物與UDP-GlcNAc反應(yīng)的步驟； (b)在β4GalTl的存在下，使所述步驟(a)的產(chǎn)物與UDP-Gal反應(yīng)的步驟；和 (c)在唾液酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶的存在下，使上述步驟(b)的產(chǎn)物與CMP-唾液酸反應(yīng)的步驟。`
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶為α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶為人源唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
10.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶為ST6Gal-1。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述CMP-唾液酸為CMP-Neu5Ac。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述磷酸酶為堿性磷酸酶。
13.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述磷酸酶為來自大腸桿菌的堿性磷酸酶。
14.化合物，所述化合物在4分支型的N-連接型復(fù)合型糖鏈或其衍生物的各非還原末端都具有唾液酸。
15.化合物，所述化合物在4分支型的N-連接型復(fù)合型糖鏈或其衍生物的各非還原末端都具有α 2，6連接型的唾液酸。
16.由下式所表示的化合物:
【文檔編號】C12N15/09GK103502462SQ201280011234
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月4日
【發(fā)明者】千葉靖典, 高橋佳江, 成松久, 深江一博 申請人:株式會社糖鎖工學(xué)研究所