專利名稱：通過樹突細(xì)胞脫唾液酸糖蛋白受體(dc-asgpr)結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞的活性劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及通過樹突細(xì)胞脫唾液酸糖蛋白受體(DC-ASGPR)結(jié)合(engage) 抗原呈遞細(xì)胞的活性劑(agent)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
不限制本發(fā)明的范圍，對與抗原呈遞相關(guān)的背景進(jìn)行描述。樹突細(xì)胞通過提供可溶性的細(xì)胞間信號然后病原體識別而在控制先天性和獲得 性免疫之間的界面中起關(guān)鍵作用。樹突細(xì)胞的這些功能極大地依賴于特定的表面受體“模 式識別受體”(PRR)，最顯著的代表為toll樣受體(TLR)和C型凝集素或凝集素樣受體 (LLR)的表達(dá)(1-3)。在當(dāng)前的范式中，TLR的主要作用在于提醒DC產(chǎn)生白細(xì)胞介素12(IL_12)和其他 炎癥性細(xì)胞因子以起始免疫應(yīng)答。C型LLR作為巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中強(qiáng)大的抗原捕獲和 攝取機(jī)制的組成部分起作用(1)。然而，與TLR相比，LLR可能具有更為廣闊的生物學(xué)功能， 包括細(xì)胞遷移(4)、細(xì)胞間相互作用(5)丄1^具有這些多重功能可能是由于不同于111 丄1^ 能夠識別自身和非自身的事實(shí)。LLR的復(fù)雜性，包括在免疫細(xì)胞中表達(dá)大量LLR的冗余性， 這些已經(jīng)成為了解各個LLR的詳細(xì)功能的主要障礙之一。此外，大部分這些受體的天然配 體仍然未被確定。雖然如此，最近研究的證據(jù)表明，在微生物感染過程中，LLR與TLR協(xié)作， 對激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生作用(6-14)。Valladeau 等人(The Journal of Immunology，2001，167 :5767_5774)描述了一 種新LLR受體，位于未成熟的人樹突細(xì)胞上，并且與肝臟脫唾液酸糖蛋白受體相關(guān)，其被證 明有效地介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用。主要是在免疫組織中即在DC和粒細(xì)胞中而不是在T細(xì)胞、B 細(xì)胞或NK細(xì)胞或單核細(xì)胞中觀察到DC-ASGPR mRNA。DC-ASGPR種類限于從CD34來源的祖 細(xì)胞獲得的CD14來源的DC，而不是來自CDla來源的亞類。單核細(xì)胞來源的DC和扁桃體間 質(zhì)型DC都表達(dá)DC-ASGPR蛋白，而郎格罕氏型細(xì)胞不表達(dá)該蛋白。此外，DC-ASGPR是未成 熟的特征，因?yàn)楫?dāng)CD40活化時不表達(dá)。與胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域中存在基于酪氨酸的雙亮氨酸基序 一致，抗DC-ASGPR的mAb在37°C下迅速被DC內(nèi)在化。最后，細(xì)胞內(nèi)的DC-ASGPR位于初級 內(nèi)體中，表明在配體內(nèi)在化后，該受體再循環(huán)到細(xì)胞表面。這些發(fā)現(xiàn)確定了 DC-ASGPR/人巨 噬細(xì)胞凝集素是未成熟的DC的特征，作為對于DC專門Ag捕獲功能來說重要的另一種凝集素。發(fā)明概述盡管已知DC-ASGPR能夠指導(dǎo)替代抗原內(nèi)在化入人DC中，但是本發(fā)明利用 DC-ASGPR的新生物學(xué)活性在免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生特別期望的改變，一些改變與抗原攝取(例 如，疫苗接種)相關(guān)，另一些通過DC-ASGra效應(yīng)分子獨(dú)特的作用(單獨(dú)地或者與其他免疫 調(diào)控分子一起)，這些效應(yīng)分子能夠通過DC、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上的該受體引發(fā)信號傳導(dǎo)。 本發(fā)明公開了開發(fā)能夠激活攜帶DC-ASGPR的細(xì)胞的獨(dú)特的活性劑的方法，以及公開了在 接受這些信號作用的細(xì)胞中產(chǎn)生的變化對免疫系統(tǒng)中的其他細(xì)胞所產(chǎn)生的作用。這些作用(或者單獨(dú)地，或者與其他信號一同(即共刺激))高度預(yù)測特定疾病狀態(tài)的治療效果或者 與疫苗接種相關(guān)的加強(qiáng)保護(hù)的效果。本發(fā)明包括用于增加表達(dá)DC-ASGPR的抗原呈遞細(xì)胞抗原呈遞效力的組合物和方 法，通過分離和純化DC-ASGPR特異性抗體或其片段進(jìn)行，其中目標(biāo)活性劑與所述DC-ASGPR 特異性抗體或其片段結(jié)合形成抗體_抗原復(fù)合物，其中所述活性劑通過已與所述抗原_活 性劑復(fù)合物接觸的例如樹突細(xì)胞加工和呈遞。在一個實(shí)施方案中，抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì) 胞，DC-ASGI3R特異性抗體或其片段與Coherin/Dockerin對的一半結(jié)合。DC-ASGI3R特異性 抗體或其片段還可以與Coherin/Dockerin對的一半結(jié)合，而抗原與Coherin/Dockerin對 的互補(bǔ)性一半(complementary half)結(jié)合，形成復(fù)合物。非限制性的示例活性劑包括一種 或多種肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸以及它們的組合。所述活性劑可以是一種或多種細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素，轉(zhuǎn)化生 長因子(TGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子 (EGF)，結(jié)締組織激活肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長因子的生物學(xué)活性類似物、片段和 衍生物，B細(xì)胞/T細(xì)胞分化因子，B細(xì)胞/T細(xì)胞生長因子，促有絲分裂細(xì)胞因子，趨化細(xì)胞 因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-α，IFN-β，IFN- y , ILl, IL2，IL3，IL4，IL5，IL6， IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 等，瘦素(Ieptin), 肌肉生長抑制素(myostatin)，巨噬細(xì)胞刺激蛋白、血小板衍生生長因子，TNF-α，TNF-β， NGF，CD40L，CD137L/4_1BBL，人淋巴毒素- β , G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-I α，ILl-β， IP-10, PF4，GR0，9E3，促紅細(xì)胞生成素，內(nèi)皮抑素(endostatin)，血管抑素(angiostatin)， VEGF，包括轉(zhuǎn)化生長因子β (例如TGF-β l、TGF-i3 2、TGF-i3 3)在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) 超基因家族；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如 BMP-1，BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8，BMP-9)；肝素結(jié)合生長因子(成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，表皮生長因子(EGF)，血小 板衍生生長因子(PDGF)，胰島素樣生長因子(IGF))；抑制素(例如抑制素A、抑制素B)；生 長分化因子(例如GDF-1)；以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。在另一個實(shí) 施方案中，該活性劑包括抗原，該抗原是細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生動物蛋白或癌 蛋白。本發(fā)明還包括用于增加樹突細(xì)胞抗原呈遞效力的組合物和方法，包括結(jié)合 DC-ASGPR特異性抗體或其片段，其中抗原與該DC-ASGPR特異性抗體或其片段結(jié)合形成抗 體-抗原復(fù)合物，其中該抗原通過已與該抗體-抗原復(fù)合物接觸的樹突細(xì)胞加工并呈遞。另 一個實(shí)施方案是針對DC-ASGPR的抗體或其它特異性結(jié)合分子用于將抗原遞送至抗原呈遞 細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)引起保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答目的的用途。對DC-ASGra特異的抗原靶向性試 劑用于通過皮膚進(jìn)行疫苗接種的用途；對DC-ASGra特異的抗原靶向性試劑與共給藥或連 接的佐劑聯(lián)合使用用于疫苗接種，或者能夠作為重組抗原-抗體融合蛋白表達(dá)的特定抗原 用于抗原靶向(疫苗接種)目的的用途。另一個實(shí)施方案包括通過以下用于增加樹突細(xì)胞效力的方法分離患者的樹突 細(xì)胞；使所述樹突細(xì)胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗體或其片段和抗原，形成負(fù)載抗原 的活化樹突細(xì)胞；和將該負(fù)載抗原的活化樹突細(xì)胞再引入患者中?？乖梢允羌?xì)菌蛋 白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生動物蛋白或癌蛋白。本發(fā)明還包括由哺乳動物細(xì)胞分泌的 抗DC-ASGPR的免疫球蛋白或其部分以及與該免疫球蛋白結(jié)合的抗原。該免疫球蛋白與cohesin/dockerin結(jié)構(gòu)域的一半結(jié)合，或者其還可以包括與同模塊式rAb載體形成復(fù)合 物的抗原結(jié)合的cohesin-dockerin結(jié)合對的互補(bǔ)性一半，或者與抗原形成融合蛋白的 cohesin-dockerin結(jié)合對的互補(bǔ)性一半?？乖禺愋越Y(jié)構(gòu)域可以是全長抗體、抗體可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段、Fv片段、Fabc片段和/或具有Fc結(jié)構(gòu)域部 分的Fab片段?？笵C-ASGPR的免疫球蛋白還可以與毒素結(jié)合，其中該毒素選自放射性同 位素、金屬、酶、肉毒桿菌毒素、破傷風(fēng)、蓖麻毒素、霍亂、白喉、黃曲霉毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌 (perfringens)毒素、真菌毒素、志賀菌毒素、葡萄球菌腸毒素B、T2、seguitoxin、蛤蛘毒 素、才目JS豆毒素、cyanoginosin、α毒素、 可月豕毒素、aconotoxin、蛇毒禾口_蟲朱毒?？乖梢?是與免疫球蛋白構(gòu)成的融合蛋白，或者是化學(xué)共價結(jié)合的或不是化學(xué)共價結(jié)合的。本發(fā)明還包括通過以下用于增加樹突細(xì)胞效力的組合物和方法分離患者的樹 突細(xì)胞；使所述樹突細(xì)胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗體或其片段以及抗原，形成負(fù)載 抗原的活化樹突細(xì)胞；將該負(fù)載抗原的活化樹突細(xì)胞再引入患者中。該活性劑用于單獨(dú) 或者與共激活劑一起結(jié)合DC-ASGPR以激活抗原呈遞細(xì)胞用于治療性或保護(hù)性應(yīng)用，結(jié)合 DC-ASGPR和/或活化活性劑單獨(dú)或者與共激活劑一起與抗原連接用于保護(hù)性或治療性的 疫苗接種。另一種用途是開發(fā)能夠結(jié)合和活化DC-ASGPR的特異性抗體V區(qū)序列，用作與毒 性劑連接的抗DC-ASGPR活性劑，用于在疾病的情況下的治療性目的，這種疾病已知或者被 懷疑是由于經(jīng)DC-ASGPR的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)激活而引起，以及用作含有DC-ASGI3R特異性 抗體或其片段的疫苗，其中抗原與該DC-ASGPR特異性抗體或其片段結(jié)合形成抗體_抗原復(fù) 合物，其中該抗原被已與該抗體_抗原復(fù)合物接觸的樹突細(xì)胞加工并呈遞。附圖的簡要說明為了更完整地理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)參考發(fā)明詳述以及附圖，在附圖中圖IA至IE例示通過凝集素樣受體DC-ASGra信號傳導(dǎo)來激活DC，導(dǎo)致共刺激分 子以及細(xì)胞因子和趨化因子水平升高。圖IA顯示3天和6天的GM/IL-4DC用FITC標(biāo)記的 山羊抗小鼠IgG染色，接著用小鼠單克隆抗人DC-ASGI3R抗體染色。圖IB顯示6天的GM/ IL-4DC在用抗DC-ASGPR或者對照mAb (l-2ug/ml)包被的平板中培養(yǎng)16_18h。細(xì)胞用熒光 染料標(biāo)記的抗CD86和HLA-DR抗體染色。柱狀圖中的空白柱和黑色柱分別代表用同型對照 mAb和抗凝集素mAb激活的細(xì)胞。圖IC顯示6天的GM/IL-4DC在用mAb包被的平板中培養(yǎng) 12h，并進(jìn)行RNA分離和Affymetrix基因芯片分析，如方法部分所述。將抗凝集素mAb刺激 的基因表達(dá)增加的倍數(shù)與用對照mAb刺激的DC中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。圖ID顯示來 自圖IB所示試驗(yàn)的培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子和趨化因子，通過Luminex方法測量。圖IE 顯示6天的GM/IL-4DC在含有或不含有50ng/ml可溶性⑶40L下，在mAb包被的平板中培 養(yǎng)16-18h，然后用抗CD83抗體染色。來自圖IE所示試驗(yàn)的上清液中的細(xì)胞因子和趨化因 子通過Luminex方法測量。所示結(jié)果代表使用來自不同正常供體的細(xì)胞的三個獨(dú)立試驗(yàn)。圖2A至2D顯示在DC上表達(dá)的DC-ASGI3R導(dǎo)致增強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。在用抗 DC-ASGPR或者對照mAb包被的96孔平板中，培養(yǎng)5 X IO3/孔6天的GM/IL-4DC 16_18h，然 后在20單位/mlIL-2和50nM CpG存在下，共培養(yǎng)經(jīng)CFSE染色的1 X IO5自體CD19+B細(xì)胞。 圖2A是用熒光標(biāo)記的抗體染色的6天的細(xì)胞的FACS。將CD3+細(xì)胞和7-AAD+細(xì)胞作門去 除(gate out)。通過FACS分選儀純化⑶38+和CFSE—細(xì)胞，進(jìn)行吉姆薩染色。圖2B是第 13天的培養(yǎng)物上清液，通過夾心ELISA分析IgM、IgG和IgM的總量。圖IC顯示用感染復(fù)數(shù)(moi)為5的熱滅活流感病毒(PR8)脈沖刺激并用B細(xì)胞培養(yǎng)的DC。在第13天，分析培 養(yǎng)物上清液中的流感特異性免疫球蛋白(Ig)。圖ID顯示對用抗DC-ASGI3R或?qū)φ誱Ab培養(yǎng) 的DC染色用于細(xì)胞表面的APRIL表達(dá)，并分析上清液中的可溶性APRIL。圖3A至3D顯示B細(xì)胞上的細(xì)胞表面表達(dá)的DC-ASGPR導(dǎo)致B細(xì)胞活化和免疫球 蛋白的產(chǎn)生。圖3A是來自血沉棕黃層的PBMC，用抗⑶19、抗⑶3和抗DC-ASGPR或者對照 mAb染色。對⑶19+和⑶3+細(xì)胞作門，通過流式細(xì)胞儀測量⑶19+B細(xì)胞上的分子表達(dá)水平。 圖3B是來自血沉棕黃層的CD19+B細(xì)胞，其在用mAb包被的平板上培養(yǎng)12h，進(jìn)行如方法部 分所述的RNA分離和Affymetrix基因芯片分析。將由抗DC-ASGPR mAb引起的基因表達(dá)倍 數(shù)增加與用對照mAb刺激的⑶19+B細(xì)胞中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。圖3C顯示在用mAb 包被的平板中培養(yǎng)16_18h的⑶19+B細(xì)胞，然后通過Luminex分析培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因 子和趨化因子。圖3D顯示1 X IO5⑶19+B細(xì)胞，這些細(xì)胞在用mAb包被的平板中培養(yǎng)13天。 Ig總水平通過ELISA測量。數(shù)據(jù)代表使用來自三個不同的正常供體的細(xì)胞進(jìn)行的兩組重復(fù) 試驗(yàn)。圖4A至4D顯示純化的同種異體T細(xì)胞的增殖被用對DC-ASGPR特異的mAb刺激 的DC顯著地增強(qiáng)。圖5顯示某些抗DC-ASGPR mAb能夠激活DC. GM_CSF/IL_4。DC用一組12種純抗 ASGPR mAb中的一種培養(yǎng)24h。然后對細(xì)胞表面⑶86 (DC活化標(biāo)記物)進(jìn)行檢測，并分析上 清液中的分泌細(xì)胞因子。來自抗ASGPR mAb組的三種mAb (36、38、43)激活DC。圖6顯示在DC-ASGPR rAb的情況下能夠表達(dá)不同的抗原?？蓪⑦@種抗DC-ASGPR rAb. Doc蛋白與任何cohesin融合蛋白簡單地混合，組裝成穩(wěn)定的非共價的[rAb. DociCoh. 融合物]復(fù)合物，其作為rAb融合蛋白起作用。圖 7-GM-CSF/IFNa DC (5，000/ 孔)負(fù)載了 IOnM 或 InM 的抗 DC-ASGP R. Doc Coh. Flu M1，或者 hIgG4. Doc:Coh. Flu Ml 復(fù)合物。在 6h 后，將自體 CD8+T 細(xì)胞(200，000/ 孔)添加到培養(yǎng)物中。在第8天，分析CD8+T細(xì)胞中的攜帶有對HLA-A201免疫顯性肽 (immuno-dominant peptide)特異的TCR的細(xì)胞的擴(kuò)增。內(nèi)部方框指示四聚體特異性⑶8+T 細(xì)胞的百分比。圖8例示不同抗體與猴ASGPR的之間的交叉反應(yīng)性。發(fā)明詳述盡管下文詳細(xì)討論本發(fā)明的各種實(shí)施方案的制造和使用，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明 提供了許多可應(yīng)用的創(chuàng)造性設(shè)想，它們可以大量不同的特定方式具體實(shí)施。在此討論的特 定實(shí)施方案僅僅是例示制造和使用本發(fā)明的特定方式，而不界定本發(fā)明的范圍。為了便于理解本發(fā)明，下文對大量術(shù)語進(jìn)行定義。本文定義的術(shù)語具有與本發(fā)明 相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語，如“一個”、“一種"和“該”等不意欲為 僅指單數(shù)實(shí)體，而是包括其中特定的例子可以用于例示的總體類別。本文的術(shù)語用于描述 本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是除了在權(quán)利要求書中進(jìn)行概括之外，它們的使用不界定本發(fā) 明。樹突細(xì)胞(DC)是在調(diào)節(jié)抗原特異性免疫性中起關(guān)鍵作用的抗原呈遞細(xì)胞 (Mellman 禾口 Steinman 2001)，(Banchereau，Briere 等人，2000)，(Cella, Sallusto 等人， 1997)。DC捕獲抗原，將它們加工成肽，再呈遞給T細(xì)胞。因此，將抗原直接遞送給DC是改良疫苗的焦點(diǎn)領(lǐng)域。一個這樣的例子就是使用負(fù)載抗原的離體自體DC然后再將該DC重 新給予患者來開發(fā)基于DC的疫苗(Banchereau，Schuler-Thurner等人，2001)，(Steinman 和Dhodapkar 2001)。增加疫苗效力的另一種策略是將與針對內(nèi)在化DC特異性受體的抗 體結(jié)合的抗原特異性靶向DC。重要的小鼠研究表明通過靶向DC進(jìn)行疫苗接種的可能性。 在體內(nèi)，用與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)的抗LOX-ImAb靶向，通過向MHCI類途徑的交叉呈遞外源 性抗原，來誘導(dǎo)保護(hù)性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(Delneste，Magistrelli等人2002)。此外，與抗 DEC205mAb結(jié)合的OVA和⑶40L成熟刺激物聯(lián)合體內(nèi)增強(qiáng)DC的MHC I類限制性地呈遞，并 導(dǎo)致持久形成效應(yīng)分子記憶CD8+T細(xì)胞(Bonifaz，Bonnyay等人2004)。這兩個研究都顯 示顯著的劑量節(jié)約(即，在極低抗原劑量下產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫應(yīng)答)，并且提示產(chǎn)生了比通常 用其他類型的OVA免疫更為廣泛的反應(yīng)。最近通過DEC205將HIV gag抗原靶向DC的研究 已經(jīng)將這些構(gòu)思擴(kuò)展到臨床相關(guān)的抗原，并證實(shí)抗原靶向DC的宗旨(tenent)-通過單次疫 苗接種顯著的劑量節(jié)約的保護(hù)性反應(yīng)，以及抗原特異性T細(xì)胞在CD8和CD4區(qū)室中的擴(kuò)增 (Trumpfheller, Finke 等人 2006)。本發(fā)明提供以受控的多元方式將多種抗原或蛋白質(zhì)(獨(dú)立地從原發(fā)mAb開始工程 化、表達(dá)和純化)與單個原發(fā)重組mAb復(fù)合。目前，有多種方法將位點(diǎn)特異性生物素化位點(diǎn) 工程化，以提供用于將不同蛋白質(zhì)(工程化的各個分別與鏈霉抗生物素連接)添加到該一 個原發(fā)HlAb上。然而，本發(fā)明提供以固定的等摩爾比例和位置，將分別工程化的蛋白質(zhì)的多 組合添加到原發(fā)mAb上。如在此所用，術(shù)語“模塊式rAb載體”用于描述一種重組抗體系統(tǒng)，該系統(tǒng)被工程 化以提供以受控的模塊式的方式將不同抗原、活化蛋白質(zhì)或者其他抗體添加到單個重組單 克隆抗體(mAb)上。rAb可以是用常規(guī)雜交瘤技術(shù)、重組抗體展示制備的單克隆抗體，人源 化單克隆抗體等等。模塊式rAb載體可用于，例如(通過抗內(nèi)在化受體例如人樹突細(xì)胞受 體的原發(fā)重組抗體)將多種抗原和/或抗原與活化細(xì)胞因子靶向至樹突細(xì)胞(DC)。模塊式 rAb載體還可以用于以受控的確定方式將兩種不同的重組mAb首末相連?！澳K式rAb載體”的抗原結(jié)合部分可以是一個或多個可變結(jié)構(gòu)域，一個或多個可 變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab'片段，F(xiàn)(ab)2片段以及Fv片段，F(xiàn)abc片段和 /或具有部分Fc結(jié)構(gòu)域的Fab片段，其中關(guān)聯(lián)模塊式結(jié)合部分被添加到氨基酸序列上和/ 或與之結(jié)合。用于模塊式rAb載體中的抗體可以是任何同種型或類別、亞類或者來自任何 來源(動物和/或重組體)。在一個非限制性例子中，將模塊式rAb載體工程化為具有一個或多個模塊式 cohesin-dockerin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，用于制備在工程化的重組mAb情況下的特異且明確的蛋 白質(zhì)復(fù)合物。mAb是融合蛋白質(zhì)的一部分，該融合蛋白質(zhì)包括一個或多個來自mAb的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的模塊式cohesin-dockerin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域羧基。cohesin-dockerin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域甚至可以在翻譯后被連接，例如使用化學(xué)交聯(lián)劑和/或二硫化鍵連接。術(shù)語“抗原”用于此是指能夠在該抗原接受者中啟動體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免 疫應(yīng)答的分子。在本發(fā)明中，抗原以兩種不同含義使用作為抗體或者rAb的其他抗原識別 結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)，或者作為一種分子，其作為模塊式rAb載體的dockerin/cohesin分子補(bǔ)體 的一部分，被rAb攜帶到和/或進(jìn)入細(xì)胞或目標(biāo)?？乖ǔＪ菍?dǎo)致疾病的活性劑，對于該疾 病來說，疫苗接種是有效的治療。當(dāng)抗原被呈遞在MHC上時，該肽通常為約8至約25個氨基
8酸。抗原包括任何類型生物分子，包括例如簡單的中間代謝產(chǎn)物、糖、脂質(zhì)和激素以及大分 子，如復(fù)合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白質(zhì)。常見的抗原種類包括，但是不限于病毒抗原， 細(xì)菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原和其他寄生蟲抗原，腫瘤抗原，參與自體免疫性疾病、過 敏反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)的抗原和其他多種抗原。模塊式rAb載體能夠運(yùn)載多種活性劑，例如抗生素、抗感染藥、抗病毒藥、抗腫瘤 藥、解熱藥、鎮(zhèn)痛藥、抗炎藥、骨質(zhì)疏松治療劑、酶、細(xì)胞因子、抗凝血藥、多糖、膠原、細(xì)胞以 及兩種或多種前述活性劑的組合。用本發(fā)明方法遞送的抗生素的例子包括而不限于四環(huán) 素、氨基糖苷類、青霉素、頭孢菌素、磺胺類藥物、氯霉素琥珀酸鈉、紅霉素、萬古霉素、林可 霉素、氯林可霉素、制霉菌素、兩性霉素B、金剛胺、碘苷、對氨基水楊酸、異煙胼、利福平、放 線菌素D、光輝霉素、道諾霉素、阿霉素、博來霉素、長春堿、長春新堿、甲基芐胼、咪唑氨甲酰寸寸。用本發(fā)明遞送的抗腫瘤藥的例子包括，但是不限于阿霉素、柔紅霉素、紫杉 醇，氨甲蝶呤等等。解熱藥和鎮(zhèn)痛藥的例子包括阿司匹林、美林(Motrin )、布洛芬 (Ibuprofen )、萘普生、醋氨酚等等。用本發(fā)明遞送的抗炎藥的例子包括，但是不限于NSAIDS、阿司匹林、甾族化合物、 地塞米松、氫化可的松、波尼松龍、雙氯芬酸鈉等等。用本發(fā)明遞送的用于治療骨質(zhì)疏松的治療劑和作用于骨和骨骼的其他因子的例 子包括，但是不限于鈣，阿倫膦酸鹽，骨GLa肽，甲狀旁腺素及其活性片段，組蛋白H4相關(guān)骨 形成和增生肽及其突變體、衍生物和類似物。用本發(fā)明遞送的酶和酶輔助因子的例子包括，但是不限于胰酶(pancrease)、 L-天冬酰胺酶、透明質(zhì)酸酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、鏈激酶、尿激酶、胰酶制劑、膠原 酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、血纖維蛋白溶酶原、鏈激酶、腺苷酸環(huán)化酶、過氧化物歧化酶 (SOD)等等。用本發(fā)明遞送的細(xì)胞因子的例子包括，但是不限于白細(xì)胞介素，轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子(EGF)，結(jié) 締組織激活肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生物。細(xì) 胞因子可以是B細(xì)胞/T細(xì)胞分化因子、B細(xì)胞/T細(xì)胞生長因子、促有絲分裂細(xì)胞因子、趨 化細(xì)胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、IFN-α、IFN-β、IFN- γ , ILU IL2、IL3、IL4、 IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、ILlU IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18 等、瘦素、、 肌肉生長抑制素、巨噬細(xì)胞刺激蛋白、血小板衍生生長因子、TNF-α、TNF-β、NGF,⑶40L、 CD137L/4-1BBL、人淋巴毒素- β、G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF, IL-I α、ILl-β、ΙΡ-10、 PF4、GR0、9E3、促紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮抑素1、血管抑素1、VEGF或者其任何片段或組合。其 他因子包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超基因家族的成員，包括轉(zhuǎn)化生長因子β (例如TGF-β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如 ΒΜΡ-1、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、 ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8、ΒΜΡ-9)；肝素結(jié)合生長因子(例如、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因 子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF))；抑制素(例如抑制素Α、 抑制素B)；生長分化因子(例如GDF-1)；以及活化素(例如活化素Α、活化素B、活化素AB)。用本發(fā)明遞送的生長因子的例子包括，但是不限于從天然或自然來源例如從哺乳 動物細(xì)胞分離的生長因子，或者可以通過合成制備例如通過DNA重組技術(shù)或者各種化學(xué)方
9法制備的生長因子。此外，可以使用這些因子的類似物、片段或者衍生物，只要它們表現(xiàn)天 然分子的至少一些生物學(xué)活性。例如，可以通過表達(dá)位點(diǎn)特異性突變或者其他遺傳工程技 術(shù)改造的基因來制備類似物。用本發(fā)明遞送的抗凝血藥包括，但是不限于華法令、肝素，水蛭素等等。用本發(fā)明 遞送的作用于免疫系統(tǒng)的因子的例子包括，但是不限于控制炎癥和惡性贅生物的因子以及 攻擊感染性微生物的因子，例如趨化肽和緩激肽。病毒抗原的例子包括，但是不限于，例如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒抗原，如來自人免疫缺陷病 毒(HIV)抗原的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒抗原，例如gag、pol和env基因的基因產(chǎn)物，Nef蛋白，反轉(zhuǎn) 錄酶和其他HIV成分；肝炎病毒抗原，例如乙肝病毒的S、M和L蛋白，乙肝病毒和其他肝炎 病毒的pre-S抗原，例如甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒的pre-S抗原，病毒成分例如丙肝 病毒RNA ；流感病毒抗原，例如血球凝集素和其他流感病毒成分；麻疹病毒抗原，例如麻疹 病毒融合蛋白和其他麻疹病毒成分；風(fēng)疹病毒抗原，如蛋白El和E2以及其他的風(fēng)疹病毒 成分；輪狀病毒抗原，例如VP7sc和其他的輪狀病毒成分；巨細(xì)胞病毒抗原，例如包膜糖蛋 白B和其他巨細(xì)胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，例如RSV融合蛋白，M2蛋白和其他 呼吸道合胞病毒抗原成分；單純皰疹病毒抗原，例如立即早期蛋白，糖蛋白D，以及其他單 純皰疹病毒抗原成分；水痘帶狀皰疹病毒抗原，例如gpl、gpll以及其他的水痘帶狀皰疹病 毒抗原成分；日本腦炎病毒抗原，例如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80% Ε,以及其 他的日本腦炎病毒抗原成分；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病糖蛋白，狂犬病核蛋白以及其他 的狂犬病病毒抗原成分。關(guān)于其他的病毒抗原實(shí)例，參見Fundamental Virology，第二版， Fields, B. N.禾口 Knipe，D. M 編著(Raven Press, New York，1991)?？梢允褂帽景l(fā)明的rAb-DC/DC-抗原疫苗遞送的抗原性靶標(biāo)包括編碼抗原例如編 碼病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原或者寄生蟲抗原的基因。病毒包括微小核糖核酸病毒、冠 狀病毒、囊膜病毒、棒狀病毒、副粘病毒、正粘病毒，布尼亞病毒，沙粒病毒、呼腸孤病毒、逆 轉(zhuǎn)錄酶病毒、乳頭瘤病毒、細(xì)小病毒、皰疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒以及海綿狀病毒。其 他的病毒靶標(biāo)包括流感、單純皰疹病毒1和2、麻疹、登革熱、天花、脊髓灰質(zhì)炎或者HIV。病 原體包括錐蟲、絳蟲、蛔蟲、蠕蟲，瘧疾。腫瘤標(biāo)記物，例如胚胎抗原或前列腺特異性抗原可 以這種方式打靶。其他例子包括HIV env蛋白和乙肝表面抗原。按照本發(fā)明用于疫苗接 種目的的載體的給予要求載體結(jié)合的抗原是足夠非免疫原性的，以使得轉(zhuǎn)基因能夠長期表 達(dá)，以期對此產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。在某些情況下，對個體疫苗接種的需要僅是不經(jīng)常的， 例如每年或者每兩年一次，并提供對感染活性劑產(chǎn)生長期的免疫保護(hù)作用。在本發(fā)明中用 作載體并且最終用作抗原的生物體、過敏原和核酸和氨基酸序列的特定例子可以在美國專 利US6，541,011中找到，該專利的相關(guān)部分在此引入作為參考，特別地，可用于本發(fā)明的與 生物體以及特定序列相對應(yīng)的表格。與在此公開的rAb疫苗一起使用的細(xì)菌抗原包括，但是不限于，例如細(xì)菌抗原，例 如百日咳毒素、絲狀血球凝集素、百日咳桿菌粘附素、FIM2、FIM3、腺苷酸環(huán)化酶以及其他 百日咳細(xì)菌抗原成分；白喉細(xì)菌抗原，例如白喉毒素或類毒素以及其他白喉細(xì)菌抗原成分； 破傷風(fēng)細(xì)菌抗原，例如破傷風(fēng)毒素或類毒素以及其他破傷風(fēng)細(xì)菌抗原成分；鏈球菌抗原，例 如M蛋白以及其他的鏈球菌抗原成分；革蘭氏陰性桿菌細(xì)菌抗原，例如脂多糖以及其他的 革蘭氏陰性細(xì)菌抗原成分，結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌抗原，例如霉菌酸，熱休克蛋白65 (HSP65)，30kDa主要分泌性蛋白，抗原85A以及其他的分枝桿菌抗原成分；幽門螺桿菌抗原成分；肺 炎球菌抗原，例如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖以及其他的肺炎球菌抗原成分；流感 嗜血桿菌細(xì)菌抗原，例如莢膜多糖以及其他的流感嗜血桿菌抗原成分；炭疽桿菌抗原，例如 炭疽保護(hù)性抗原以及其他的炭疽桿菌抗原成分；立克次體細(xì)菌抗原，例如rompA以及其他 的立克次體細(xì)菌抗原成分。本文描述的細(xì)菌抗原還包括任何其他的細(xì)菌、分枝桿菌、支原 體、里克次氏體或者衣原體的抗原。部分或者整個的病原體還可以是流感嗜血桿菌；鐮狀 瘧原蟲；腦膜炎奈瑟氏球菌；肺菌鏈球菌；淋病奈瑟氏菌；傷寒沙門氏菌血清型；志賀氏菌； 霍亂弧菌；登革熱；腦炎；日本腦炎；萊姆??；鼠疫耶爾森氏菌；西尼羅河病毒；黃熱病；兔 熱??；肝炎(病毒性；細(xì)菌性)；RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV 1和HPIV 3 ；腺病毒；天花； 過敏物和癌癥物質(zhì)。用于本發(fā)明的組合物和方法中的真菌抗原包括，但是不限于，例如念珠菌屬真菌 抗原成分；組織胞漿菌屬真菌抗原，例如熱休克蛋白60(HSP60)以及其他的組織胞漿菌屬 真菌抗原成分；隱球菌真菌抗原，例如莢膜多糖以及其他的隱球菌真菌抗原成分；球孢子 菌真菌抗原，例如小球體(spherule)抗原以及其他的球孢子菌真菌抗原成分；以及癬真菌 抗原，例如發(fā)癬菌素以及其他的球孢子菌真菌抗原成分。原生動物和其他的寄生蟲抗原的例子包括，但是不限于，例如惡性瘧原蟲抗原，例 如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，環(huán)子孢子抗原，配子母細(xì)胞/配子表面抗原，紅內(nèi)期 抗原pfl55/RESA以及其他的瘧原蟲抗原成分；弓形體屬抗原，例如SAG-1、p30以及其他 的弓形體抗原成分；裂體吸蟲抗原，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、副肌球蛋白，以及其他的血 吸蟲抗原成分；利什曼原蟲主要抗原以及其他的利什曼原蟲抗原，例如gp63、磷脂聚糖及 其相關(guān)蛋白質(zhì)，以及其他的利什曼原蟲抗原成分；和克氏錐蟲抗原，例如75-77kDa抗原、 56kDa抗原以及其他的錐蟲抗原成分。用本發(fā)明的rAb靶向的抗原通常根據(jù)許多因素來選擇，所述因素包括內(nèi)在化的 可能性、免疫細(xì)胞特異性的水平、靶向的免疫細(xì)胞的類型、免疫細(xì)胞的成熟程度和/或活化 等。樹突細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物的例子包括，但是不限于MHC I類、MHC II類、B7-2、⑶18、 CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR 和 / 或 ASPGR 等等；在某些情況下，缺乏 CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD56 和 / 或 ⑶57?？乖蔬f細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物例子包括，但是不限于MHC I類、MHC II類、⑶40、 CD45、B7-l、B7-2、IFN-γ受體和IL-2受體、ICAM-I和/或Fc γ受體。T細(xì)胞的細(xì)胞表面 標(biāo)記物的例子包括，但是不限于 CD3、CD4、CD8、CD14、CD20、CDllb、CD16、CD45 和 HLA-DR。用于遞送的細(xì)胞表面上的目標(biāo)抗原包括腫瘤抗原特征性的那些抗原，其通常來自 腫瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞表面、胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞器等等。本發(fā)明的抗體部分的腫瘤靶標(biāo)的例 子包括，但是不限于血液癌例如白血病和淋巴瘤，神經(jīng)腫瘤例如星形細(xì)胞瘤或惡性膠質(zhì)瘤， 黑色素瘤，乳癌，肺癌，頭頸癌，胃腸腫瘤例如胃癌或結(jié)腸癌，肝癌，胰腺癌，泌尿生殖器腫瘤 如宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌，骨腫瘤，血管腫瘤，或者唇、 鼻咽、咽和口腔，食道、直腸、膽囊、膽道系統(tǒng)、喉、肺和支氣管、膀胱、腎臟、大腦以及神經(jīng)系 統(tǒng)的其他部分、甲狀腺的癌癥，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤和白血病?？梢杂帽景l(fā)明單獨(dú)或者聯(lián)合地遞送至免疫細(xì)胞用于抗原呈遞的抗原例子包括腫 瘤蛋白質(zhì)，例如突變的癌基因；腫瘤相關(guān)病毒蛋白，以及腫瘤粘蛋白和糖脂。抗原可以是腫瘤相關(guān)的病毒蛋白，其是來自上述病毒種類的蛋白質(zhì)。某些抗原可以是腫瘤特征性的(一 個亞集，是通常不在腫瘤前體細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì))，或者可以是通常在腫瘤前體細(xì)胞中表 達(dá)但是具有腫瘤特征性的突變的蛋白質(zhì)。其他抗原包括具有改變的活性或亞細(xì)胞分布的正 常蛋白質(zhì)的突變型變體，例如產(chǎn)生腫瘤抗原的基因突變。腫瘤抗原的特定非限制性例子包括CEA，前列腺特異性抗原(PSA)，HER-2/neu, BAGE，GAGE，MAGE 1-4,6 和 12，MUC(粘蛋白)(例如 MUC_1、MUC_2 等)，GM2 和 GD2 神經(jīng)節(jié)苷 脂，ras，myc，酪氨酸酶，MART (黑色素瘤抗原)，Pmel 17 (gplOO)，GnT-V內(nèi)含子V序列(N-乙 酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶V內(nèi)含子V序列)，前列腺Ca psm, PRAME (黑色素瘤抗原)，β -連環(huán)蛋 白，MUM-I-B (黑色素瘤遍在突變基因產(chǎn)物)，GAGE (黑色素瘤抗原)1，BAGE (黑色素瘤抗 原)2-10，C-ERB2 (Her2/neu)，EBNA (EB 病毒細(xì)胞核抗原)1_6，gp75，人乳頭瘤病毒(HPV) E6 和E7，p53，肺抗性蛋白(LRP)，Bcl-2和Ki-67。此外，免疫原性分子可以是參與自體免疫 性疾病的起始和/或進(jìn)展的自體抗原，該疾病的病理學(xué)主要是由相關(guān)靶器官、組織或細(xì)胞 表達(dá)的分子的特異性抗體的活性引起，例如SLE或MG。在這些疾病中，可能期望將進(jìn)行中 的針對相關(guān)自體抗原的抗體介導(dǎo)的(即Th2型)免疫應(yīng)答引向細(xì)胞型(即Thl型)免疫應(yīng) 答?；蛘?，可能期望在沒有感染但是疑似易感染相關(guān)自體免疫疾病的受試者中通過預(yù)防性 誘導(dǎo)針對適當(dāng)?shù)淖泽w抗原的Thl反應(yīng)來防止針對自體抗原的Th2反應(yīng)的起始或者降低該反 應(yīng)的水平。感興趣的自體抗原包括，但不限于(a)關(guān)于SLE，Smith蛋白、RNP核蛋白、SS-A 和SS-B蛋白；以及(b)關(guān)于MG，乙酰膽堿受體。參與一類或多類自體免疫應(yīng)答的其他各種 抗原的例子包括，例如內(nèi)源性激素，例如黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、生長激素、催 乳素和其他激素。參與自體免疫性疾病、過敏和移植排斥的抗原可被在本發(fā)明的組合物和方法使 用，例如參與以下任何一種或多種自體免疫性疾病或障礙的抗原可被用于本發(fā)明中糖尿 病(diabetes、diabetes mellitus)，關(guān)節(jié)炎(包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎)，多發(fā)性硬化，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，自體免疫性甲狀腺 炎，皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)，銀屑病，斯耶格倫氏綜合征，包括繼發(fā)于斯耶 格倫氏綜合征的干燥性角膜結(jié)膜炎，斑禿，由于節(jié)肢動物叮咬而引起的過敏反應(yīng)，克羅恩氏 病，口瘡性潰瘍，虹膜炎，結(jié)膜炎，角膜結(jié)膜炎，潰瘍性結(jié)腸炎，哮喘，過敏性哮喘，皮膚紅斑 狼瘡，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥疹、麻風(fēng)病逆向反應(yīng)(1印rosy reversal reaction)，麻風(fēng) 結(jié)節(jié)性紅斑，自體免疫性葡萄膜炎，過敏性腦脊髓炎，急性壞死性出血性腦病，特發(fā)性雙側(cè) 進(jìn)行性感覺神經(jīng)性聽力喪失，再生障礙性貧血，單純性紅細(xì)胞貧血，特發(fā)性血小板減少癥， 多軟骨炎，韋格納氏肉芽腫，慢性活動性肝炎，斯_約二氏綜合征，特發(fā)性口炎性腹瀉，扁 平苔癬，克羅恩氏病，格雷夫斯眼病，結(jié)節(jié)病，原發(fā)性膽汁性肝硬化，后葡萄膜炎(uveitis posterior)，以及間質(zhì)性肺纖維化。參與自體免疫性疾病的抗原例子包括谷氨酸脫羧酶 65 (GAD 65)、天然DNA、髓磷脂堿性蛋白、髓磷脂蛋白脂質(zhì)蛋白、乙酰膽堿受體成分、甲狀腺 球蛋白和促甲狀腺激素(TSH)受體。參與過敏癥的抗原例子包括花粉抗原，例如日本柳杉 花粉抗原、豚草屬花粉抗原、黑麥草花粉抗原，動物來源的抗原，例如塵螨抗原和貓科抗原， 組織相容性抗原，和青霉素以及其他的治療性藥物。參與移植排斥反應(yīng)的抗原例子包括移 植給移植接受者的移植物的抗原性成分，例如心臟、肺、肝、胰腺、腎臟和神經(jīng)移植物成分。 抗原可以是用于治療自體免疫性疾病的經(jīng)改造的肽配體。
如在此所用，術(shù)語“表位”是指肽或蛋白質(zhì)抗原，其包括一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)或三級 結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)與位于大量的由病原體DNA或RNA編碼的病原體多肽的任何一種中的表位 類似。相似性的程度一般達(dá)到使得抗這種多肽的單克隆或多克隆抗體也結(jié)合、反應(yīng)或者識 別該肽或蛋白質(zhì)抗原。各種免疫測定方法可以與這種抗體聯(lián)合使用，例如，蛋白質(zhì)印跡法、 ELISA、RIA等等，這些方法全部都是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的。確定可用作疫苗的病原體表位 和/或它們的功能性等價物也是本發(fā)明的一部分。一旦病原體表位被分離和確定，可以容 易地獲得其功能性等價物。例如，可以采用美國專利US4，554，101中教導(dǎo)的Hopp方法，其 根據(jù)親水性從氨基酸序列中鑒定和制備表位，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。在其他一些文獻(xiàn) 中描述的方法以及基于這些方法的軟件程序也可以用于確定表位核心序列(參見，例如， Jameson和Wolf，1988 ；Wolf等人，1988 ；美國專利US4，554，101)。然后，通過肽合成技術(shù)或 重組技術(shù)，可容易地將這些“表位核心序列”的氨基酸序列摻入肽中?？蓪幋a本發(fā)明抗原的核酸作為活性成分的疫苗組合物制備成注射劑，為液 體溶液或者懸浮液；也可以制備成適合在注射前溶解或者懸浮在液體中的固體形式?？蓪?制劑乳化，包封在脂質(zhì)體中?；钚悦庖咴猿煞滞ǔＥc載體混合，該載體是藥學(xué)上可接受的 并且與活性成分相容的。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指不會在被給予的受試者中引發(fā)過敏反應(yīng)或者 其他不期望作用的載體。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽 水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合中的一種或多種。此外，如果期望，疫苗可含有少 量的輔助性物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑和/或增強(qiáng)疫苗效力的佐劑?？赡苡行?的佐劑的例子包括，但是不限于氫氧化鋁，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺 (thr-MDP)、N-乙酰-nor-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺、MTP-PE和RIBI，RIBI含有 三種在2%鯊烯/Tween 80乳劑中的細(xì)菌提取成分，單磷酰脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯以及 細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的其他例子包括DDA(溴化二甲基雙十八烷基銨)、弗氏 完全佐劑和不完全佐劑以及QuilA。此外，免疫調(diào)節(jié)物，例如淋巴因子(例如IFN-γ、IL-2 和IL-12)或者合成的IFN-Y誘導(dǎo)劑，例如poly I C與本文描述的佐劑聯(lián)合使用。如本發(fā)明中所述，藥品以生理學(xué)上可接受的可給藥形式包括具有單個或多個拷貝 的特定核苷酸序列的裸多核苷酸，該核苷酸序列與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定 DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。多核苷酸可以編碼生物活性肽、反義RNA或者核酶，并以生理學(xué)上可接 受的可給藥形式提供。可來自本發(fā)明的另一種藥品以生理學(xué)上可接受的可給藥形式包括 高純度的血漿脂蛋白部分和預(yù)先結(jié)合到純化的脂蛋白部分的包含單個或多個拷貝的特定 核苷酸序列的多核苷酸，所述血漿脂蛋白部分按照本文描述的方法從患者血液或者其他來 源中分離，所述特定核苷酸序列與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)
I=I ο另一種藥品以生理學(xué)上可接受的可給藥形式包括高純度的血漿脂蛋白部分，該血 漿脂蛋白部分含有包含單個或多個拷貝的特定DNA結(jié)合基序的重組載脂蛋白片段，其預(yù)先 與含有單個或多個拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸結(jié)合。還有一種藥品以生理學(xué)上可接 受的可給藥形式包括高純度的血漿脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分含有包含單個或多個拷 貝的特定DNA結(jié)合基序的重組載脂蛋白片段，其預(yù)先與含有單個或多個拷貝的特定核苷酸 序列的多核苷酸結(jié)合。
給藥劑量很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀況，以及給藥途徑 和治療頻率。包含預(yù)先與高純度的血漿脂蛋白部分結(jié)合的裸多核苷酸的藥物組合物可以按 1 μ g-lmg多核苷酸和1 μ g-100mg蛋白質(zhì)的量給予。向患者給予rAb以及rAb復(fù)合物遵循給予化學(xué)治療劑的一般方案，如果載體存在 毒性的話，應(yīng)考慮載體的毒性?？梢韵氲桨葱枰貜?fù)治療循環(huán)。還還考慮，各種標(biāo)準(zhǔn)治療方 法以及手術(shù)干預(yù)可以與所述基因治療方法聯(lián)合使用。在考慮基因治療的臨床應(yīng)用時，需要制備復(fù)合物作為適合目的應(yīng)用的藥物組合 物。通常需要制備基本上不含有熱原以及任何其他對人和動物會產(chǎn)生損害的雜質(zhì)的藥物組 合物。通常還期望使用合適的鹽和緩沖液，以使得該復(fù)合物穩(wěn)定和允許被靶細(xì)胞攝取。本發(fā)明的含水組合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在藥學(xué)上可接受的 載體或含水介質(zhì)中。這種組合物也被稱作為接種物。這種介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的 應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的。任何常規(guī)介質(zhì)或試劑除非與活性成分不相容，否則其在治療性組合 物中的使用被考慮。補(bǔ)充性活性成分也可以被添加到組合物中。本發(fā)明的組合物可以包括 典型的藥學(xué)制劑。還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體。在通常的 存儲和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。疾病狀態(tài)。根據(jù)要治療的特定疾病，通過任何常規(guī)途徑來給予本發(fā)明的治療組合 物，只要通過該途徑能夠到達(dá)靶組織，使得將抗原最大化地遞送到該位點(diǎn)，產(chǎn)生最大化(或 者在某些情況下最小化)的免疫應(yīng)答。通?？梢酝ㄟ^原位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或者靜 脈內(nèi)注射進(jìn)行給藥。遞送的其它部位包括口、鼻、頰、直腸、陰道或者局部。局部給藥對于 治療皮膚癌是特別有利的。這種組合物通常作為包含生理學(xué)上可接受的載體、緩沖液或者 其他賦形劑的藥學(xué)上可接受的組合物被給予。本發(fā)明的疫苗或治療組合物通過經(jīng)注射腸胃外例如皮下或肌內(nèi)給予。適合其他 給藥方式的其他制劑包括栓劑，以及在一些情況下口服制劑或者適合分配的制劑如氣霧 劑。在口服制劑的情況下，使用佐劑處理T細(xì)胞亞群、抗原包裝或者將單獨(dú)的細(xì)胞因子添 加到各種制劑中產(chǎn)生具有最優(yōu)化免疫應(yīng)答的改良口服疫苗。對于栓劑而言，常規(guī)的粘合劑 和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或者甘油三酯；這種栓劑可用含有0. 5 % -10 %，優(yōu)選 1% 范圍內(nèi)的活性成分的混合物來制備?？诜苿┌ǔＪ褂玫馁x形劑，例如，藥用 級別的甘露糖醇、乳糖、淀粉硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物的形式可以 是溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠囊、緩釋制劑或者粉劑，并且含10% -95%的活性成分，優(yōu)選 25-70% ο將本發(fā)明的編碼抗原的核酸作為中性的或鹽的形式配制入疫苗或者治療組合物 中。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成)，其為與無機(jī)酸例如鹽酸或者 磷酸，或者與有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、馬來酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可 以來自無機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機(jī)堿如異 丙胺、三甲胺、2-氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。疫苗或治療組合物以與制劑相容的方式給予，并且以預(yù)防和/或治療有效的量給 予。要給予的量取決于要治療的受試者，包括例如受試者的免疫系統(tǒng)對合成抗體的容量，以 及期望達(dá)到的保護(hù)或治療程度。適合的劑量范圍為每次疫苗接種為幾百微克級的活性成 分，范圍為約0. lmg-lOOOmg，例如范圍為約lmg_300mg，優(yōu)選范圍為約10mg_50mg。合適的首次給予和強(qiáng)化注射的方案也是變化的，但是通常為首次給予后，接著接種或者進(jìn)行其他 給予?；钚猿煞纸o予所要求的精確含量取決于醫(yī)師的判斷，并且可能為各個受試者所特有。 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明的核酸分子或者融合多肽的治療有效量尤其取決于給藥 方案，給予的抗原的單位劑量，核酸分子或融合多肽是否與其他治療劑聯(lián)合給藥，以及接受 者的免疫狀況和健康狀況，核酸分子或融合多肽的治療活性。組合物可以以單劑量方案或多劑量方案方式給予。多劑量方案是這樣的一種方 案，其中初始疫苗接種時程包括例如1-10個單獨(dú)劑量，在維持和/或加強(qiáng)免疫應(yīng)答所需的 隨后時間段內(nèi)給予其他劑量，例如，在1-4月給予第二劑量，并且如果需要，在數(shù)個月后再 給后續(xù)劑量。需要間隔為1-5年，通常為3年的定期加強(qiáng)來使保護(hù)性免疫保持在期望水平 上。在免疫接種后，對與ESAT6或ST-CF共培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)進(jìn)行體外增殖測 定，測量從致敏的淋巴細(xì)胞中釋放的INF-Y的水平。可以使用常規(guī)的標(biāo)記物例如放射性 同位素、酶、熒光標(biāo)記物等進(jìn)行測定。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的，并可在美國專利 US3, 791，932，US4, 174，384和US3, 949，064中找到，這些文獻(xiàn)的相關(guān)部分引入作為參考。模塊式rAb載體和/或結(jié)合的rAb載體(cohesion/dockerin和/或 dockerin-cohesin)-抗原復(fù)合物(rAb_DC/DC_抗原疫苗)可在一個或多個“單位劑量”中 提供，這取決于是否使用核酸載體，最終的純化蛋白或者使用的最終疫苗的形式。單位劑 量定義為含有計算以產(chǎn)生與治療組合物給藥即適當(dāng)?shù)耐緩胶椭委煼桨赶嚓P(guān)的期望反應(yīng)的 預(yù)定量的治療組合物。給藥量和特定給藥途徑和制劑在臨床領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)能力的范 圍內(nèi)。還可以對要治療的受試者進(jìn)行評估，特別是受試者免疫系統(tǒng)狀態(tài)和期望的保護(hù)作 用。單位劑量不必以單次注射給藥，而是可以包括在設(shè)定的一段時間內(nèi)的連續(xù)輸注。本發(fā) 明的單位劑量以DNA/kg(或者蛋白質(zhì)/Kg)體重方便地描述，給藥范圍約0.05、0. 10,0. 15、 0. 20,0. 25,0. 5、1、10、50、100、1，000或者更多mg/DNA或蛋白質(zhì)/kg體重。同樣地，遞送的 rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以在約0. 2-8. 0mg/kg體重的范圍變化。因此，在特定實(shí)施方 案中，可以將 0. 4mg、0. 5mg、0. 8mg、L 0mg、L 5mg>2. 0mg>2. 5mg>3. 0mg>4. 0mg>5. 0mg>5. 5mg、 6. 0mg、6. 5mg、7. Omg和7. 5mg疫苗體內(nèi)遞送給個體。rAb-DC/DC-抗原疫苗的給藥劑量在 很大程度上取決于所治療的受試者的體重和身體狀況，以及給藥途徑和治療頻率。包含預(yù) 先結(jié)合到脂質(zhì)體或病毒遞送載體上的裸多核苷酸的藥物組合物可以以從ι μ g-lmg多核苷 酸到Iyg-IOOmg蛋白質(zhì)的量范圍給予。因此，特定組合物可以包括約1 μ g、5y g、10y g、 20μ g、30y g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、100y g、150y g、200y g、250y g、500y g、 600 μ g、700 μ g、800 μ g、900 μ g或1，000 μ g之間的多核苷酸或蛋白質(zhì)、該多核苷酸或蛋白 質(zhì)獨(dú)立地與 1μ g、5y g、10y g、20y g、3. ομ g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、100y g、 150 μ g、200y g、250 y g、500y g、600y g、700y g、800y g、900y g、lmg、l. 5mg、5mg、10mg、 20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 或 IOOmg 載體結(jié)合。在體外細(xì)胞系統(tǒng)中測試本發(fā)明，該體外細(xì)胞系統(tǒng)測量被Flu抗原靶向的樹突細(xì)胞 對人Flu特異性T細(xì)胞的免疫刺激作用。本文所示的結(jié)果證明在該系統(tǒng)中，在單獨(dú)無效的 抗原劑量下這些抗原特異性細(xì)胞的特異性擴(kuò)增。本發(fā)明還可以用于制備模塊式rAb載體，該模塊式rAb載體是例如與來自蓖麻毒 素、炭疽熱毒素和葡萄球菌B腸毒素的保護(hù)性抗原復(fù)合的重組人源化mAb (針對特定的人樹 突細(xì)胞受體)。這種實(shí)體的潛在市場是對全體軍事人員的疫苗接種，以及儲備待用以滿足大
15人口中心應(yīng)對與這些活性劑相關(guān)的任何生物威脅的存儲疫苗?？傮w而言，本發(fā)明可廣泛應(yīng) 用于疫苗設(shè)計，包括人和動物用途的疫苗。感興趣的產(chǎn)業(yè)包括制藥和生物技術(shù)行業(yè)。本發(fā)明包括組合物和方法，包括疫苗，其特異性地將抗原靶向(遞送)至抗原呈遞 細(xì)胞(APC)，以引發(fā)有效而廣泛的針對該抗原的免疫應(yīng)答。這些組合物引起針對產(chǎn)生該抗原 的活性劑(病原體或癌癥)的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明產(chǎn)生活性劑，所述活 性劑直接或者與其他活性劑一起通過特異性結(jié)合在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的所謂DC-ASGPR 受體產(chǎn)生治療作用。新的重組人源化mAb (針對特定的人樹突細(xì)胞受體DC-ASGPR)通過抗體(Ab)重鏈 與已知抗原或者懷疑編碼保護(hù)性抗原的物質(zhì)融合。作為用于抵抗各種活性劑的疫苗接種的 例子包括來自流感H5m的血球凝集素；來自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B腸毒素的 減弱毒素的HIV gag;來自melanona抗原的抗原性肽“鏈”(string)等。本發(fā)明可作為處 于危險中或者被感染的患者的預(yù)防性或治療性的疫苗接種。本發(fā)明可廣泛用于抵抗許多疾 病和癌癥的疫苗接種，包括人和動物的用途?？梢允褂帽景l(fā)明的工業(yè)包括藥學(xué)和生物技術(shù) 領(lǐng)域。本發(fā)明可用于將抗原靶向APC用于疫苗接種目的。不知曉哪種抗原內(nèi)在化受體最 適合于該目的。本發(fā)明描述了 DC-ASGH 用于該目的的特別有利的特點(diǎn)。此外，本發(fā)明表明， 結(jié)合DC-ASGPR在具有高度預(yù)期的顯著治療益處的激活免疫系統(tǒng)意義上可能是有益的。本發(fā)明包括開發(fā)抗人DC-ASGPR的高親和性單克隆抗體。分別制備受體胞外結(jié)構(gòu) 域.hlgG(人IgGlFc)和AP(人胎盤堿性磷酸酶)融合蛋白，用于免疫小鼠和篩選mAb。先 前已經(jīng)描述一種hDCIR胞外結(jié)構(gòu)域.IgG的表達(dá)構(gòu)建體(Bates，F(xiàn)ournier等人1999)，并用 小鼠SLAM(mSLAM)信號肽引導(dǎo)分泌(Bendtsen, Nielsen等人2004)。用PCR擴(kuò)增AP殘基 133-1581 (gb IBC009647 I)同時添加近端讀框內(nèi)Xho I位點(diǎn)和遠(yuǎn)端TGA終止密碼子和Not I位點(diǎn)來制備hDCIR胞外結(jié)構(gòu)域.AP的表達(dá)載體。該Xho I-Not I片段替換上述hDCIR胞 外結(jié)構(gòu)域.IgG載體中的IgG編碼序列。在相同的Ig和AP載體系列中的DC-ASGPR胞外結(jié) 構(gòu)域構(gòu)建體中含有編碼(bp 484-1251，gi I 53832017)的插入物。使用FreeStyle 293表 達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)，按照廠商的操作流程(Img總質(zhì)粒DNA用1. 3ml 293Fectin試劑/L 轉(zhuǎn)染)，制備DC-ASGI3R融合蛋白質(zhì)。對于rAb的制備來說，用等量的編碼H鏈和L鏈的載 體共轉(zhuǎn)染。將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)物上清液，加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 天。通過過濾，使合并的上清液澄清。通過HiTrap蛋白A親和層析，用0. IM pH2. 7甘氨酸 洗脫，并用PBS透析，純化受體胞外結(jié)構(gòu)域.hlgG。使用HiTrapMabSelect 柱類似地純化 rAb (后面描述的重組抗體)。用常規(guī)的細(xì)胞融合技術(shù)來制備小鼠mAb。簡而言之，6周齡的 BALB/c小鼠用20 μ g添加Ribi佐劑的受體胞外結(jié)構(gòu)域.hlgGFc融合蛋白進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫， 在10天和15天后用20yg抗原加強(qiáng)免疫。3個月后，在取出脾臟的3天前，再次對小鼠加 強(qiáng)免疫?；蛘撸?0-40天的周期內(nèi)，以每3-4天的間隔，在小鼠足墊中注射于Ribi佐劑中 的I-IOyg抗原。在最后加強(qiáng)免疫后的3-4天，收集引流淋巴結(jié)。用常規(guī)技術(shù)，將來自脾臟 和淋巴結(jié)細(xì)胞的B細(xì)胞與SP2/0-Ag 14細(xì)胞(Shulman，Wilde等人，1978)融合。用ELISA， 對照單獨(dú)的融合伴侶或者與AP融合的受體胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)，從雜交瘤上清液中篩選受體胞 外結(jié)構(gòu)域融合蛋白(Bates，F(xiàn)ournier等人1999)。然后，在FACS中，用瞬時轉(zhuǎn)染編碼全長 受體cDNA的表達(dá)質(zhì)粒的293F細(xì)胞篩選陽性孔。被選的雜交瘤是在CELLine瓶(Intergra)中克隆和擴(kuò)增的單個細(xì)胞。雜交瘤上清液與等體積的1.5M甘氨酸、3M NaClUxPBS,pH 7.8 混合，并與MabSelect樹脂混合。用結(jié)合緩沖液洗滌樹脂，并用0. 1M甘氨酸，pH 2. 7洗脫。 接著用2M Tris中和，用PBS透析mAb。通過直接ELISA表征所純化的抗DC-ASGPR單克隆抗體。通過ELISA確定幾種抗 DC-ASGPR mAb的相對親和力(即將DC-ASGPR. Ig蛋白質(zhì)固定在微量平板的表面上，并以劑 量滴度系列測試抗體與DC-ASGPR. Ig的結(jié)合能力(通過抗小鼠IgG. HRP結(jié)合試劑檢測)。在 該實(shí)例中，PAB42和PAB44顯示比其他mAb具有更高的親和結(jié)合力。這些mAb不能顯著地結(jié) 合已經(jīng)結(jié)合在微量平板表面上的人Ig。這表明，mAb與DC-ASGPR. Ig融合蛋白的DC-ASGPR 胞外結(jié)構(gòu)域部分發(fā)生反應(yīng)(數(shù)據(jù)未給出)。通過間接ELISA表征所純化的抗DC-ASGPR單克隆抗體。接著，通過ELISA確定幾 種抗DC-ASGPR mAb的相對親和力(即將DC-ASGPR. Ig蛋白質(zhì)固定在微量平板的表面上， 并以劑量滴度系列測試抗體與DC-ASGPR. Ig的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自雜交瘤如PAB42、 PAB44和PAB54的上清液的親和結(jié)合力高于其他mAb (數(shù)據(jù)未給出)。通過FACS表征抗DC-ASGPR mAb。還通過FACS，與用指導(dǎo)細(xì)胞表面DC-ASGPR合成 的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞比較，檢測mAb組。與未被轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞比較，從類似的信 號減去平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)這種標(biāo)準(zhǔn)，mAb能夠特異性地結(jié)合到帶有DC-ASGPR的細(xì)胞表面 上。一些mAb，例如37A7在這方面具有顯著優(yōu)勢(數(shù)據(jù)未給出)。

圖1A-1D表明，通過DC-ASGH 信號傳導(dǎo)激活DC。DC是決定免疫應(yīng)答結(jié)果的主要 免疫細(xì)胞，該結(jié)果為誘導(dǎo)或者耐受，這取決于它們的活化狀態(tài)(15)。LLR在DC活化中的作 用尚不清楚。因此，我們測試觸發(fā)LLRDC-ASGPR是否能導(dǎo)致DC的激活。體外培養(yǎng)3天和6 天的GM/IL-4DC都表達(dá)L0X-1、ASGPR和CLEC-6 (圖1A)。6天的DC用對DC-ASGPR特異的 mAb刺激，圖1B中的數(shù)據(jù)表明，通過DC-ASGPR的信號能夠激活DC，導(dǎo)致⑶86和HLA-DR的 表達(dá)增加。觸發(fā)DC上的DC-ASGPR還導(dǎo)致DC中IL-6、MCP-l、IL_12p40和IL-8的生成增加 (圖1C)。通過DC-ASGH 信號傳導(dǎo)還使得其他細(xì)胞因子和趨化因子，TNFa、IP-10、MIP_la 和IL-10顯著增加(數(shù)據(jù)未給出)，表明DC-ASGPR能夠遞送細(xì)胞信號來激活DC。同樣地， 用DC-ASGPR特異性mAb刺激的DC所表達(dá)的多種基因的水平都升高，包括共刺激分子以及 趨化因子和細(xì)胞因子相關(guān)基因(圖ID)。LLR在TLR2和TLR4介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化中的可 能貢獻(xiàn)先前已描述(13，16)。我們觀察到，通過DC-ASGPR的信號能夠與通過⑶40的信號協(xié) 同以進(jìn)一步活化DC(圖1E)。這是重要的，因?yàn)樵隗w內(nèi)DC活化中，LLR可作為共刺激分子。 總的來說，圖1中的數(shù)據(jù)證明通過DC-ASGTO信號傳導(dǎo)能夠激活DC，且DC-ASGTO作為DC活 化的共刺激分子起作用。在⑶40-⑶40L相互作用中DC-ASGPR占用導(dǎo)致IL_12p70的生成 顯著增加。通過DC-ASGPR刺激的DC引發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答。DC通過給T細(xì)胞依賴性和T 細(xì)胞不依賴性B細(xì)胞反應(yīng)提供信號(19-22)，并通過將抗原傳遞給B細(xì)胞(23，24)來在體液 免疫應(yīng)答中起重要作用。除了 DC，作為第三信號的通過TLR9信號傳導(dǎo)對有效的B細(xì)胞反應(yīng) 也是必需的(25，26)。因此，我們測試了在TLR9配體CpG存在下，DC-ASGPR在DC介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答 中的作用。6天的GM/IL-4DC用抗DC-ASGPR mAb刺激，然后共培養(yǎng)純化的B細(xì)胞。如圖2A 中所示，與用對照mAb刺激的DC相比，用抗DC-ASGPR mAb激活的DC導(dǎo)致顯著增加的B細(xì)胞擴(kuò)增(CFSE稀釋)和漿細(xì)胞分化(⑶38+CD20—)。⑶38+CD20—B細(xì)胞具有漿細(xì)胞的典型形態(tài) 學(xué)，但是它們不表達(dá)CD138。大多數(shù)增殖細(xì)胞不表達(dá)CCR2、CCR4、CCR6或CCR7。通過ELISA 測定所生成的總免疫球蛋白(Ig)的量(圖2B)。與圖2A中的數(shù)據(jù)一致，用抗DC-ASGTO刺 激的DC培養(yǎng)的B細(xì)胞導(dǎo)致IgM、IgG和IgA生成的顯著增加。除了總Ig，我們還觀察到，對 于通過B細(xì)胞產(chǎn)生流感病毒特異性IgM、IgG和IgA(圖2C)來說，觸發(fā)DC-ASGPR而活化的 DC比用對照mAb刺激的DC更有效，表明DC-ASGPR介導(dǎo)的DC活化對總的和抗原特異性的 體液免疫應(yīng)答都起作用。我們測試離體抗原呈遞細(xì)胞(APC)中的DC-ASGH 在體液免疫應(yīng) 答中的作用。包括⑶19+和⑶14+細(xì)胞在內(nèi)的PBMC中的部分APC表達(dá)DC-ASGPR (增補(bǔ)的圖 2)。在用抗DC-ASGPR mAb包被的平板中培養(yǎng)來自血沉棕黃層的PBMC，并測定總Ig和B細(xì) 胞增殖。與從DC獲得的數(shù)據(jù)(圖2A) —致，在缺乏(圖2d中的上面一組)或存在(圖2D 中的下面一組)TLR9配體的情況下，通過DC-ASGPR刺激的APC導(dǎo)致B細(xì)胞增殖和漿細(xì)胞分 化增多。當(dāng)PBMC在用抗DC-ASGPR的mAb包被的平板中培養(yǎng)時，總IgM、IgG和IgA也顯著 增加(圖2e)。如圖1中所示，通過DC-ASGH 信號傳導(dǎo)激活的DC具有成熟的表型，并生成 大量炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子，而且成熟的DC表型和來自DC的可溶性因子都對增強(qiáng)的B 細(xì)胞反應(yīng)起作用(圖2)。但是，DC來源的B淋巴細(xì)胞刺激蛋白(BLyS，BAFF)和增殖誘導(dǎo)配 體(APRIL)也是重要分子，DC通過這些分子能夠直接調(diào)控人B細(xì)胞的增殖和功能(27-30)。 因此，我們測試通過DC-ASGPR的信號是否能改變BLyS和APRIL的表達(dá)水平。圖2d中的數(shù) 據(jù)表明，由所表達(dá)的DC-ASGH 刺激的DC增加了細(xì)胞內(nèi)APRIL以及所分泌的APRIL的水平， 但是對BLyS不起作用(未給出)。測定混合培養(yǎng)物中的B細(xì)胞上的BLyS和APRIL受體的 表達(dá)水平，但是沒有顯著的變化(未給出)。DC-ASGPR對B細(xì)胞活化以及Ig生成起作用。CD19+B細(xì)胞表達(dá)DC_ASGPR(圖3A)。 因此，我們測試DC-ASGPR在B細(xì)胞活化中的作用。圖3B中數(shù)據(jù)表明，通過DC-ASGPR刺激 的B細(xì)胞生成顯著更高量的趨化因子。當(dāng)用抗DC-ASGPR mAb刺激B細(xì)胞時，與對照mAb 相比，除了 IL-8和MIP-la外，還觀察到IL-6和TNF a略微增加。與細(xì)胞活化相關(guān)的基因 也被上調(diào)(圖3C)。當(dāng)通過DC-ASGH 刺激B細(xì)胞時，它生成IgM、IgG和IgA(圖3D)，表明 DC-ASGH 在維持體內(nèi)正常的免疫球蛋白水平中起重要作用。然而，單獨(dú)通過DC-ASGH 信號 傳導(dǎo)并不引起顯著的B細(xì)胞增殖。DC-ASGPR在T細(xì)胞反應(yīng)中的作用。通過DC-ASGPR刺激的DC表達(dá)共刺激分子的水 平增強(qiáng)，并且生成的細(xì)胞因子和趨化因子的量增加(參見圖1)，表明DC-ASGra對細(xì)胞免疫 應(yīng)答以及體液免疫應(yīng)答都起作用。這通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來測試。用對DC-ASGPR 特異的mAb刺激DC，顯著增加純化的同種異體T細(xì)胞的增殖(圖4A)。與對照mAb刺激的 DC相比，通過DC-ASGPR活化的DC更有效地致敏Mart_l特異性⑶8T細(xì)胞(圖4B的上一 組)。更重要的是，通過DC-ASGH 信號傳導(dǎo)允許DC交叉致敏(cross-prime)Mart-1肽至 ⑶8T細(xì)胞上(圖4B中的下一組)。這顯示DC-ASGPR在增強(qiáng)DC功能中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致 更好地將抗原致敏和交叉致敏至⑶8T細(xì)胞上。PBMC中的APC混合物上所表達(dá)的DC-ASGPR 在T細(xì)胞反應(yīng)活化中的作用示于圖4C中，其中與用對照mAb刺激的DC相比，用DC-ASGPR 的mAb刺激的PBMC導(dǎo)致Flu Ml四聚體特異性CD8T細(xì)胞的頻率升高。該增強(qiáng)的抗原特異 性⑶8T細(xì)胞反應(yīng)由圖4D中數(shù)據(jù)所支持，表明通過DC-ASGPR刺激的DC顯著地增加⑶4T細(xì) 胞的增殖。
材料與方法?？贵w和四聚體_包括同型對照Ab在內(nèi)的用于DC和B細(xì)胞的表面染色的抗 體(Ab)購自 BD Biosciences (CA)。用于 ELISA 的抗體購自 Bethyl (TX)?？?BLyS 和抗 APRIL 購自 P印roTech(NJ)。四聚體，HLA-A*0201_GILGFVFTL(SEQ ID NO. 1) (Flu Ml)禾口 HLA-A*0201-ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 2) (Mart-1)購自 Beckman Coulter (CA)。細(xì)胞和培養(yǎng)物-來自正常供體的單核細(xì)胞(1 X 106/ml)在含有GM-CSF (lOOng/ml) 和IL-4(50ng/ml) (R&D, CA)的Cellgenics (France)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。對于第3天和第6天 的DC，分別在第1天和第3天將相同量的細(xì)胞因子添加到培養(yǎng)液中。B細(xì)胞用陰性分離試 劑盒(BD)純化。CD4和CD8T細(xì)胞用包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy, CA)純化。使用 Percoll 梯度(GEHealthcare UK Ltd,Buckinghamshire,UK)通過密度梯度離心從血沉棕 黃層中分離PBMC。對于DC活化，將1 X 105DC在用mAb包被的96孔平板中培養(yǎng)16_18h。在 碳酸鹽緩沖液PH 9.4中的mAMljyg/孔)在37°C下培養(yǎng)至少3h。收集培養(yǎng)物上清液， 細(xì)胞因子/趨化因子通過Luminex(Bi0rad，CA)測定。對于基因分析，DC在mAb包被的平 板中培養(yǎng) 8h。在一些實(shí)驗(yàn)中，將可溶性 50ng/ml CD40L(R&D, CA)或 50nM CpG(InVivogen, CA)添加到培養(yǎng)液中。在DC和B細(xì)胞共培養(yǎng)中，將重懸在含有10% FCS和抗生素的RPMI 1640 (Biosource，CA)中的5 X 103DC首先在mAb包被的平板中培養(yǎng)至少6h，然后加入1 X 105 用CFSE(Molecular Probes,OR)標(biāo)記的純化自體B細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，DC用5moi (感染 復(fù)數(shù))熱滅活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脈沖攻擊2h，然后與B細(xì)胞混合。對于DC和T細(xì) 胞共培養(yǎng)，將5X 103DC與IX 105純化的自體⑶8T細(xì)胞或者混合的同種異體T細(xì)胞一起培 養(yǎng)。在培養(yǎng)的最后18h，用1 y Ci/孔3[H]-胸苷脈沖攻擊同種異體T細(xì)胞，然后通過P _計 數(shù)儀(WallaC，MN)測定cpm。以5X 105PBMC/孔在mAb包被的平板中培養(yǎng)。分別在第10天 和第7天，通過用抗⑶8和四聚體染色細(xì)胞來測定Mart-1和Flu Ml特異性⑶8T細(xì)胞的頻 率。將 10 ii M 的 Mart-1 肽(ELAGIGILTV) (SEQID N0. 2)禾P 20nM 的含 Mart-1 肽的重組蛋 白(參見下文)添加到DC和⑶8T細(xì)胞培養(yǎng)物中。將20nM純化的重組Flu Ml蛋白(參見 下文)力口到PBMC培養(yǎng)物中。單克隆抗體-通過常規(guī)技術(shù)制備小鼠mAb。簡而言之，用含有Ribi佐劑的20iig 受體胞外結(jié)構(gòu)域.hlgGFc融合蛋白對6周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行i. p.免疫，然后在第10天 和第15天，用20 y g抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。3個月后，在取出脾臟的前3天，再對小鼠加強(qiáng)免 疫?；蛘?，在30天至40天的期間內(nèi)，每3-4天用在Ribi佐劑中的1-10 y g抗原注射小鼠 足墊。在最后加強(qiáng)免疫后的3-4天，收集引流的淋巴結(jié)，來自脾臟或淋巴結(jié)細(xì)胞的B細(xì)胞與 SP2/0-Agl4細(xì)胞融合。對雜交瘤上清液進(jìn)行篩選，與單獨(dú)的融合伴侶或與堿性磷酸酶融合 的受體胞外結(jié)構(gòu)域(44)相比，分析受體胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白的Ab。然后在FACS中使用用 編碼全長受體cDNA的表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞對陽性孔進(jìn)行篩選。被選的雜交瘤是 在CELLine瓶(Intergra，CA)中克隆和擴(kuò)增的單個細(xì)胞。雜交瘤上清液與等體積的1. 5M 甘氨酸、3M NaClUx PBS，pH 7. 8混合，并與MabSelect樹脂混合。用結(jié)合緩沖液洗滌樹脂， 并用0. 1M甘氨酸，pH 2. 7洗脫。接著用2M Tris中和，用PBS透析mAb。ELISA-進(jìn)行夾心ELISA來測量總IgM、IgG禾口 IgA以及flu特異性免疫球蛋白 (Ig)。含有已知量的Ig的標(biāo)準(zhǔn)人血清(Bethyl)和人AB血清分別用作總Ig和flu特異性 Ig的標(biāo)準(zhǔn)。樣本中的Flu特異性Ab滴度，單位被確定為具有相同的光密度的AB血清的稀釋系數(shù)。用ELISA試劑盒(BenderMedSystem，CA)測定BAFF和BLyS的量。RNA純化和基因分析-用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，并用 2100Bioanalyser (Agilent)分析。生物素標(biāo)記的cRNA靴標(biāo)用Illumina totalpr印標(biāo)記試 劑盒(Ambion)制備并雜交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的轉(zhuǎn)錄本)上。這些微陣列 由附著在3 ym珠上的50mer寡核苷酸探針組成，所述珠固定在硅片表面上蝕刻的微孔中。 用鏈霉抗生物素_Cy3染色后，用Illumim^Beadstation 500X)生產(chǎn)的亞微米分辨掃描儀 成像。用基因表達(dá)分析軟件程序GeneSpring，Version 7. 1 (Agilent)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。重組Flu Ml和MART-1蛋白的表達(dá)和純化-用PCR擴(kuò)增流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)Ml基因的0RF，同時加入起始密碼子遠(yuǎn)端的Nhe I位點(diǎn)以及 終止密碼子遠(yuǎn)端的Not I位點(diǎn)。將消化片段克隆到pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml 0RF 讀框內(nèi)插入His6標(biāo)簽，從而編碼His. Flu Ml蛋白質(zhì)。編碼插入在Nco I和Nhe I之間的來 自熱纖梭菌(C. thermocellum)(未公開)的N端169個殘基cohesin結(jié)構(gòu)域的pET28b (+) 衍生物表達(dá) Coh. His。為了表達(dá) Cohesin-Flex-hMART-1-肽 A-His，序列GACACCACCGAGGCCC GCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATC GGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCC ATCACACTGGCGGCCG (SEQID NO. 3)(編碼 DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRT NNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO. :4)-帶陰影的殘基是免疫顯性的HLA-A2-限制性肽，而 該肽周圍帶下劃線的殘基來自MART-1)被插入到上述載體的Nhe I位點(diǎn)和Xho I位點(diǎn)之間。 蛋白在大腸桿菌菌株BL21(DE3) (Novagen)或者T7Express (NEB)中表達(dá)，這些菌株在37°C 下在LB中培養(yǎng)，以卡那霉素抗性(40 u g/ml)選擇，并以200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶直至生長到對數(shù) 中期，同時添加120mg/L IPTG。3h后，通過離心收集細(xì)胞，保存在_80°C下。將來自每1L發(fā) 酵物中的大腸桿菌細(xì)胞重懸在30ml含有0. lml蛋白酶抑制劑Cocktail II (Calbiochem, CA)的冰冷的50mM Tris,lmM EDTApH 8. 0(緩沖液B)中。在冰上超聲處理細(xì)胞2次，每次 5分鐘，設(shè)定值為18(Fisher SonicDismembrator 60)，其中有5分鐘靜止期，然后在4°C下 以 17, 000r. p. m. (SorvallSA-600)離心 20 分鐘。為了純化 His. Flu Ml，使 50ml 細(xì)胞裂解 物上清液部分通過5ml Q瓊脂糖珠，將6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaCl pH7. 9添加 到Q瓊脂糖流動液中。將其以4ml/分鐘速度上樣到5ml帶有Ni++的HiTrap螯合HP柱上。 結(jié)合柱的蛋白質(zhì)用20mM NaP04,300mM NaCl pH7. 6(緩沖液D)洗滌，接著用100mM H3C00Na pH 4.0再洗滌一次。結(jié)合的蛋白質(zhì)用lOOmM H3C00Na pH 4.0洗脫。合并峰值餾分，以4ml/ 分鐘的速度上樣到用lOOmM H3C00Na pH 5. 5平衡的5ml Hi Trap S柱上，用平衡緩沖液洗 滌，接著用在50mM NaP04pH 5. 5中的梯度為0-1M的NaCl洗脫。合并用約500mM NaCl洗脫 的峰值餾分。為了純化Coh. Flu Ml. His,如上所述將來自2L培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解。離心后， 將2. 5ml Triton 29X114加到上清液中，在冰上培育5分鐘。在25°C下再溫育5分鐘后，在 25°C下進(jìn)行離心，從Triton XI14中分離上清液。重復(fù)提取操作，將上清液通過5ml的Q瓊 脂糖珠，在Q瓊脂糖流動液中添加6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaClpH 7.9。如上所 述，用M++螯合的層析柱純化蛋白質(zhì)，并用在緩沖液D中的0-500mM咪唑洗脫。僅特定的抗DC-ASGPR mAb具有DC激活特性-本發(fā)明公開了 DC激活不是抗 DC-ASGPR抗體的普遍特性，僅僅某些抗DC-ASGPR mAb具備該功能。圖5表明僅某些mAb通 過DC-ASGPR激活DC，這必須用真實(shí)DC篩選來表征。
對應(yīng)于抗DC-ASGPR mAb的L和H可變區(qū)的特定序列-本發(fā)明包括下文所示的對 應(yīng)于抗DC-ASGH 單克隆抗體的特定氨基酸序列，它們是治療性或保護(hù)性產(chǎn)品的期望成分 (在例如人源化重組抗體的情況下)。如下是嵌合小鼠V區(qū)-人C區(qū)重組抗體的序列。[m Anti-ASGPR_49Cll_7H-LV-hIgG4H-C]是 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSffHWIRQFP GNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASffGQGTLVTVSAAK
ttgpsvfplapc srstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgt
KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ IDNO. :5)。上述序列是在 mAb 49C11 的 H 鏈 V 區(qū)(以下
劃線顯示)和hIgG4的C區(qū)之間的嵌合體。[mAnti-ASGPR_49Cll_7K-LV-hIgGK-C]是相應(yīng)
的 L 鏈嵌合體-QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRfflYDTSRLASGVPARFSG
SGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQffSSHPffSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP
REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SE
Q ID NO. 6)。[mAnti-ASGPR_4G2. 2_Hv_V-hIgG4H_C]為 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGY
TFTNYGMNVVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRL
NYFDYffGQGTTLTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
PEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO. :7)。[mAnti_ASGPR_4G2. 2_
Kv-V-hlgGK-C]為 DIQMTQSSSSFSVSL⑶RVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSR
FSGSGSGKDYALSITSLQTEDLATYYCQQCffTSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(
SEQ ID NO. :8)。 「mAnti-ASGPR 5F10H-LV-hIgG4H_Cl 為EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTF
TDYYMKffVKQSHGKSLEfflGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDV
ffGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW
QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS(SEQ ID NO. :9)。[mAnti-ASGPR_5F10K-LV-hIgGK_C]
為 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAffYQQKPGQSPKLLIYffASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLT
INNVQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKV
DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.
10)。 [mAnti-ASGPRlHllH-V-hIgG4H-C]為 QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHG
KSLEfflGGINPINGGPTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARffDYGSRDVMDYffGQGTSVTVS
SAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS(SEQ ID NO. :11)。 「mAnti-ASGPRlHllK-LV-hlgGK-Cl 為 NIVMTQ SPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSffYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDL ADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKVDNALQSGNSQ ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO. :12)。本發(fā)明 包括這些V區(qū)序列以及相關(guān)序列，該相關(guān)序列由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員改造以用于例如增加 對DC-ASGPR的親和性，和/或被整合到人V區(qū)框架序列中，以被工程化到表達(dá)載體中來指 導(dǎo)能夠結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的DC-ASGPR的蛋白質(zhì)的表達(dá)。 工程化的重組抗DC-ASGPR重組抗體-抗原融合蛋白((rAb.抗原)是有效的體外 原型疫苗-用不同的蛋白質(zhì)編碼序列來構(gòu)建表達(dá)載體，例如在讀框內(nèi)與H鏈編碼序列融合。 例如，抗原，例如流感病毒HA5、流感病毒Ml、HIVgag或來自癌抗原的免疫顯性肽，或者細(xì)胞 因子，隨后被表達(dá)成rAb.抗原或者rAb.細(xì)胞因子融合蛋白，在本發(fā)明的情況下，其可具有 來自于使用抗DC-ASGPR V區(qū)序列將抗原或細(xì)胞因子(或毒素)直接攜帶到帶有DC-ASGPR 的抗原呈遞細(xì)胞的表面的應(yīng)用。這使得可以內(nèi)在化例如抗原_有時與受體的活化以及隨后 起始治療性或保護(hù)性作用(例如通過起始有效的免疫應(yīng)答，或者通過殺死靶向的細(xì)胞)相 關(guān)?；谠摌?gòu)思的示例性原型疫苗可以使用H鏈載體，例如[mAnti-ASGPR_5F10H-LV-hIgG 4H-C-Flex-FluHA5-l-6xHis]或者-EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEW IGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVffGAGTTVTVSSAKTKGPS VFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLGKAS
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ID NO. :13)。上述序列對應(yīng)于已顯示的嵌合H鏈，其通過彈性接頭序列(斜體顯示)融合 到禽Flu HA5HA-1結(jié)構(gòu)域(粗體顯示)。這可以與上面已顯示的相應(yīng)的L鏈嵌合序列共同 被表達(dá)。類似地，序列[mAnti-ASGPR_49Cll_7H-LV-hIgG4H-C-Dockerin]-DVQLQESGPDLVKP SQSLSLTCTVTGYSITSGYSffHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDT ATYFCARSNYGSFASffGQGTLVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
22SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYV LKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO. 14)可用于通過共轉(zhuǎn)染 上述已顯示的相應(yīng)L鏈序列表達(dá)rAb. Docker in融合蛋白。圖6表明在DC-ASGPR rAb的情況下，不同的抗原可被表達(dá)。這種抗DC-ASGPR 『八匕力況蛋白可簡單地與任何⑶?。、荿.融合蛋白混合，來組裝成穩(wěn)定的非共價的[rAb. Doc:Coh.融合]復(fù)合物，其作用正如rAb.融合蛋白。圖6表明這種[rAb. DocCoh.融合] 復(fù)合物將抗原集中到表達(dá)DC-ASGPR的細(xì)胞的表面上。該圖還表明，抗DC-ASGPR. Doc:Coh. Flu Ml復(fù)合物將Flu Ml遞送到轉(zhuǎn)染了 DC-ASGPR cDNA的293F細(xì)胞的表面。1 P g/ml (右 組)抗DC-ASGPR. Doc rAb (綠色所示)或者對照hIgG4. Doc rAb (藍(lán)色所示)在室溫下與 生物素化Coh. Flu Ml (2 u g/ml) 一起孵育1小時，加入被轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞，在冰上繼續(xù)孵 育20分鐘。然后洗滌細(xì)胞，并用PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素染色。然后分析細(xì)胞的PE熒光強(qiáng) 度。通過Dockerin:Cohesin相互作用，與Flu Ml復(fù)合的抗DC-ASGPR rAb將抗原靶向 人DC，導(dǎo)致Flu Ml特異性⑶8+T細(xì)胞的擴(kuò)增-抗DC-ASGPRrAb作為裝置將抗原遞送至例如 DC的可能用途在下圖中顯示。圖7表明FluMl特異性⑶8+細(xì)胞的顯著擴(kuò)增高度預(yù)測了該 活性劑作為引發(fā)針對Flu Ml的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗的可能性。圖8證明了不同抗體與猴ASGH 之間的交叉反應(yīng)性。通過將PCR產(chǎn)物插入到pIRES 載體的Nhel-NotI位點(diǎn)中來克隆pIRES_ASGPR-m0n(猴)。最終產(chǎn)物的序列是基于克隆 5S10。大部分其他克隆或者與其類似，僅僅差別1個氨基酸，或者與之相同。但是，一個克 隆5S1在接近3'端存在A缺失，產(chǎn)生截短且不同的C末端，可用作第二變體。為了克隆猴 ASGPR,使用如下寡核苷酸DC-ASGPR_MoN :gaattcgctagcCACCATGACATATGAAAACTTCCAAGAC TTGGAGAGTGAGGAGAAAGTCCAAGGGG(SEQ ID NO. 15)；和 DC_ASGPR_Mo :CGAATTCGCGGCCGCTCA GTGACTCTCCTGGCTGGCCTGGGTCAGACCAGCCTCGCAGACCC(SEQ ID NO. : 16)，其是 GGGTCTGCGAGGC TGGTCTGACCCAGGCCAGCCAGGAGAGTCACTGAGCGGCCGCGAATTCG(SEQ ID NO. : 17)的反向互補(bǔ)體。 序列比對表明了可能的重疊區(qū)，以及因此的本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的交叉反應(yīng)性。下表證明了DC-ASGPR 334998 200ug/ml 12. 05. 07cfg#558 抗人 IgG PE 的結(jié)合性
臺匕
AvgStDevSEM聚糖w/ow/ow/o絲名稱%CV數(shù)目MaxMaxMax&Min&Min&Min82GalNAca 1 -3(Fuca 1 -2)Gaip 1 -4GlcNAcP-Sp85293010265513219210Neu5Aca2-3(GalNAc|31-4)Gaipi-4GlcNAcP-Sp8499374969248410
權(quán)利要求
一種用于增加抗原呈遞效力的方法，所述方法包括分離和純化DC ASGPR特異性抗體或其片段的步驟，所述DC ASGPR特異性抗體或其片段與抗原結(jié)合形成抗體 抗原復(fù)合物，其中所述抗原由已與所述抗體 抗原復(fù)合物接觸的樹突細(xì)胞加工并呈遞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中DC-ASGI3R特異性抗體或其片段與Coherin/Dockerin對的——坐社入干？ 口 口 °
4.權(quán)利要求1的方法，其中DC-ASGI3R特異性抗體或其片段與Coherin/Dockerin對的 一半結(jié)合而抗原與Coherin/Dockerin對的互補(bǔ)性一半結(jié)合，形成復(fù)合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中抗原選自肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸及其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中抗原特異性結(jié)構(gòu)域特異于免疫細(xì)胞表面蛋白，所述免疫細(xì) 胞表面蛋白選自 MHC I類、MHC II類、CDl、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD19、 CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、 CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受體、Langerin、 DECTIN-UB7-UB7-2, IFN- γ受體和IL-2受體、ICAM_l、Fc γ受體或者由抗原呈遞細(xì)胞相 對特異性表達(dá)的其他受體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中抗原包括細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原生動物蛋白或 癌蛋白。
8.一種用于增加樹突細(xì)胞抗原呈遞效力的方法，所述方法包括結(jié)合DC-ASGPR特異性 抗體或其片段，所述DC-ASGPR特異性抗體或其片段與抗原結(jié)合形成抗體_抗原復(fù)合物，其 中該抗原由已與所述抗體_抗原復(fù)合物接觸的樹突細(xì)胞加工并呈遞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中樹突細(xì)胞的效力增加使用同種異體CD8+T細(xì)胞來確定。
10.針對DC-ASGPR的抗體或其它特異性結(jié)合分子用于遞送抗原至抗原呈遞細(xì)胞以引 起保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答的用途。
11.對DC-ASGPR特異的抗原靶向性試劑用于經(jīng)皮膚的疫苗接種的用途。
12.對DC-ASGra特異的抗原靶向性試劑與共給藥或連接的佐劑相結(jié)合用于疫苗接種 的用途。
13.能夠作為重組抗原-抗體融合蛋白表達(dá)的特異性抗原用于抗原靶向(疫苗接種) 目的的用途。
14.抗原特異性抗DC-ASGra免疫球蛋白或其片段，其由哺乳動物細(xì)胞分泌且該免疫球 蛋白與抗原結(jié)合。
15.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原是與免疫球蛋白構(gòu)成的融合蛋白。
16.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原 生動物蛋白或癌蛋白。
17.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白與cohesin/dockerin結(jié)構(gòu)域的一半社a？口口。
18.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其還包括與抗原結(jié)合的cohesin-dockerin結(jié)合對的互 補(bǔ)性一半，其中該抗原與模塊式rAb載體形成復(fù)合物。
19.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其還包括與抗原構(gòu)成融合蛋白的cohesin-dockerin結(jié) 合對的互補(bǔ)性一半。
20.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原特異性結(jié)構(gòu)域包括全長抗體、抗體可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域、Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc 結(jié)構(gòu)域的Fab片段。
21.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白與毒素結(jié)合，其中所述毒素選自 放射性同位素、金屬、酶、肉毒桿菌毒素、破傷風(fēng)、蓖麻毒素、霍亂、白喉、黃曲霉毒素、產(chǎn)氣莢 膜梭菌毒素、真菌毒素、志賀菌毒素、葡萄球菌腸毒素B、T2、seguitoxin、蛤蛘毒素、相思豆 毒素、cyanoginosin、α毒素、 可月豕毒素、aconotoxin、蛇毒禾口_蟲朱毒。
22.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原是與所述免疫球蛋白構(gòu)成的融合蛋白。
23.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括細(xì)菌蛋白、病毒蛋白、真菌蛋白、原 生動物蛋白或癌蛋白。
24.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中所述抗原包括選自以下的癌細(xì)胞或其部分T細(xì)胞 和B細(xì)胞淋巴增生性疾病、卵巢癌、胰腺癌、頭頸癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃腸癌、乳癌、前列腺癌或 非小細(xì)胞肺癌。
25.一種用于增加樹突細(xì)胞效力的方法，所述方法包括分離患者樹突細(xì)胞；使所述樹突細(xì)胞暴露于活化量的抗DC-ASGPR抗體或該抗體片段和抗原，形成負(fù)載了 抗原的活化樹突細(xì)胞；和將所述負(fù)載抗原的活化樹突細(xì)胞再引入所述患者中。
26.單獨(dú)或者與共激活劑一起結(jié)合DC-ASGPR以活化抗原呈遞細(xì)胞的活性劑用于治療 性或保護(hù)性應(yīng)用的用途。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述DC-ASGra結(jié)合性和/或活化性活性劑單獨(dú)地或者與 共激活劑一起與抗原連接用于保護(hù)性或治療性的疫苗接種。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述特異性抗體V區(qū)序列能夠結(jié)合并活化DC-ASGPR。
29.與毒性劑連接的抗DC-ASGPR活性劑用于在疾病的情況下治療性目的的用途，所述 疾病已知或者被懷疑是由于經(jīng)DC-ASGPR的免疫細(xì)胞的不適當(dāng)激活所引起。
30.一種疫苗，其包含DC-ASGPR特異性抗體或其片段，所述DC-ASGPR特異性抗體或其 片段與抗原結(jié)合形成抗體_抗原復(fù)合物，其中所述抗原由已與該抗體_抗原復(fù)合物接觸的 樹突細(xì)胞加工并呈遞。
全文摘要
本發(fā)明包括用于制備和使用抗DC-ASGPR抗體的組合物和方法，該抗體能夠例如活化DC和其他細(xì)胞。
文檔編號A61K39/00GK101952414SQ200880011349
公開日2011年1月19日 申請日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者G·祖拉夫斯基, J·F·班徹羅, S·吳, S·祖拉夫斯基, 李大鵬 申請人:貝勒研究院