用于細胞培養(yǎng)基工程化的功能環(huán)境學方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于最優(yōu)化細胞培養(yǎng)基的組成的新方法。該新方法包括兩個主要階段。在第一階段中，通過執(zhí)行特定細胞培養(yǎng)方案和外代謝物組測定方案，聯(lián)合篩選細胞功能和介質(zhì)因子（medium?factor）來建立功能環(huán)境學圖譜。所述功能環(huán)境學圖譜由基本細胞功能的強度值相對于介質(zhì)因子的數(shù)據(jù)陣列組成。在第二階段，由所述功能環(huán)境學圖譜的列（columns）開發(fā)最優(yōu)化的細胞培養(yǎng)基制劑，所述培養(yǎng)基制劑增強或抑制靶標基本細胞功能。該方法的主要優(yōu)勢在于使得能夠通過培養(yǎng)基組成操縱進行代謝工程化，其中通過介質(zhì)因子的操縱來最優(yōu)化任意高數(shù)量的細胞功能，這與主要根據(jù)經(jīng)驗而非細胞功能導向的并且需要多得多的實驗次數(shù)的先前的方法相反。此外，該新方法基于有成本效益的外代謝物組測定且不需要花費巨大的細胞內(nèi)基因組或蛋白質(zhì)組學測定。
【專利說明】用于細胞培養(yǎng)基工程化的功能環(huán)境學方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于最優(yōu)化細胞培養(yǎng)基的組成的方法。描述了用于測定介質(zhì)因子的最佳值的方法，從而按照用戶需要增強或抑制靶標基本細胞功能。所述方法包括通過執(zhí)行細胞培養(yǎng)實驗和優(yōu)選外代謝物組(exometabolome)的高通量分析法構(gòu)建功能環(huán)境學圖譜,隨后基于介質(zhì)因子的所述功能進行介質(zhì)因子值調(diào)整。
[0002]發(fā)明背景
[0003]細胞生長制劑在水溶液中包含數(shù)百種單獨的成分。它們通常由下述組成:營養(yǎng)物例如蛋白胨、氨基酸、肉類提取物和酵母提取物；礦物質(zhì)和維生素、抑制劑和固化劑。這些成分中的某些對于細胞生長或生產(chǎn)率可能是至關(guān)重要的，其它成分在某種水平上可能是有毒性的，并且許多成分可在細胞內(nèi)的相同或競爭性途徑中參與復雜的相互作用。包含哺乳動物細胞生長所必需的生長因子的血清(胎小牛血清FCS和胎牛血清FBS)已被廣泛用作用于動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基補充物。然而血清的使用正被漸漸停止，因為監(jiān)管機構(gòu)對使用動物來源的材料生產(chǎn)活性藥物成分(API)施以了非常嚴格的限制。若干文獻(例如W02008009642、W02009149719、US2009061516)公開了能夠支持動物細胞的體外培養(yǎng)的無血清細胞培養(yǎng)基制劑。[0004]通過統(tǒng)計學實驗設(shè)計(design-of-experiments) (DoE)支持的密集實驗(Intensive experimentation)是用于確定細胞培養(yǎng)基的最佳組成的現(xiàn)有標準方法。然而該方法耗時且昂貴。單個地或在平行實驗中以小的組合的方式篩選培養(yǎng)基成分，這顯著限制了發(fā)現(xiàn)許多培養(yǎng)基成分之間的復雜相互作用的能力。已報導了眾多關(guān)于使用DoE對通過反應(yīng)器或搖瓶實驗支持的細菌、真菌、哺乳動物細胞和干細胞培養(yǎng)進行培養(yǎng)基最優(yōu)化的研究([2]、[5]、[6]、[8])。最常見的DoE法是利用兩個濃度水平的所謂的縮減因子設(shè)計(reduced factorial design),其允許在有限次數(shù)的實驗中初步篩選5至10種介質(zhì)因子([7]、[2])。例如，文獻號US2008248515公開了使用2-水平因子設(shè)計和最速上升法(deepest ascent method)確定無血清真核細胞培養(yǎng)基補充物的最佳組成的方法。通過使用DoE，同時比較數(shù)種介質(zhì)因子，測量它們的作用，并基于反應(yīng)變量的測量對其進行排序。反應(yīng)變量通常是代謝物的濃度、細胞和產(chǎn)物濃度。一旦確定了反應(yīng)變量，就可使用統(tǒng)計性能參數(shù)例如方差分析(ANOVA)來評估所測量的作用的相關(guān)性。相關(guān)于它們的影響力對介質(zhì)因子進行排序，隨后選擇最有效的因子，并在另外的實驗中進一步進行測試[2]。最后，建立回歸模型來確定介質(zhì)因子的最佳水平[2]。
[0005]統(tǒng)計學DoE法的主要劣勢是，由于其經(jīng)驗主義的性質(zhì)，當用于許多具有潛在相互作用的介質(zhì)因子時，其成本膨脹。為了加速對大量介質(zhì)因子的篩選，最近基于微生物生物反應(yīng)器技術(shù)開發(fā)了高成本的高通量培養(yǎng)基最優(yōu)化設(shè)備，目標是使得能夠并行篩選數(shù)千種營養(yǎng)物水平或其組合。減少工作量和加速培養(yǎng)基開發(fā)的另一個策略是將培養(yǎng)基成分分成濃縮的相容性制劑小組(如文獻號NZ243160中公開的)。也提出了較少經(jīng)驗性因而更快速且更便宜的方法。文獻號MX2009004974公開了用于細胞培養(yǎng)基設(shè)計的合理方法，其中基于培養(yǎng)的細胞的蛋白質(zhì)含量、所表達的重組蛋白質(zhì)的氨基酸組成和細胞維持需求來計算培養(yǎng)基中的氨基酸濃度。
[0006]如今存在可用于較少經(jīng)驗性和傾向(tendencially)機械性的培養(yǎng)基設(shè)計的更先進的系統(tǒng)生物學工具。Kell和同事顯示出在外代謝物組(所有細胞外代謝物的濃度)與細胞內(nèi)狀態(tài)之間存在緊密聯(lián)系[9]。他們顯示出外代謝物組動力學提供了細胞代謝活性以及間接地基因組和蛋白組狀態(tài)的信息性和準確的“足跡”。事實上，培養(yǎng)基不僅輸送關(guān)鍵的營養(yǎng)物而且還輸送參與基因表達調(diào)控的小分子和蛋白質(zhì)(例如[3])。然而先前從未描述過使用外代謝物組來改善培養(yǎng)基的組成。
[0007]在文獻號W02004101808中，描述了用于使用基因組學和/或蛋白質(zhì)組學來開發(fā)細胞培養(yǎng)基制劑的方法。其描述了用于配制細胞培養(yǎng)基的方法，包括檢測細胞中的序列，所述序列是核酸序列(例如關(guān)于基因組的信息)或所表達的氨基酸序列(例如關(guān)于蛋白質(zhì)組的信息)，以及配制包含調(diào)節(jié)所檢測的序列或其表達或調(diào)節(jié)受所檢測的序列或其表達影響的細胞過程的分子的細胞培養(yǎng)基，其中不比較所述分子對不同細胞系或不同培養(yǎng)條件的影響。然而，這樣的方法提出了 3個主要的問題:i)尋找單個分子相互作用已被證明昂貴且困難，ii)在基因表達、蛋白質(zhì)組與細胞表型之間存在公知的空缺，iii)基因表達或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性收集是困難且昂貴的。因此使用基因組學和/或蛋白質(zhì)組學來進行系統(tǒng)性培養(yǎng)基設(shè)計在許多情況下可能是不可行的。
[0008]調(diào)節(jié)特定生物化學轉(zhuǎn)化的備選方案是功能導向的工程化，其是本文中所探索的方法?？墒褂没磕Ｊ椒治?elementary flux modes analysis)或極端途徑分析(extreme pathways analysis) [35]將細胞的代謝分解成基本細胞功能。基元通量模式代表代謝反應(yīng)的獨特且不可分解的亞網(wǎng)絡(luò)，其以穩(wěn)定的狀態(tài)協(xié)調(diào)工作?；Ｊ降耐暾慕M代表細胞實現(xiàn)其功能的所有可運行的模式。具體地，細胞的表型，如通過其通量組(fluxome) v定義的,可被表達為基元通量模式的貢獻的權(quán)重和:
【權(quán)利要求】
1.用于確定最佳細胞培養(yǎng)基組成的方法，其特征在于下列步驟: a)選擇祀生物學結(jié)構(gòu)； b)建立K個基本細胞功能的組，其設(shè)置自主的和模塊化的生物學功能，其將結(jié)果一起組合成為靶標生物學結(jié)構(gòu)的功能； c)建立N種介質(zhì)因子的組，其決定靶標生物學結(jié)構(gòu)的環(huán)境； d)使用新鮮的和/或經(jīng)消耗的培養(yǎng)基樣品的上清液的外代謝物組的實驗數(shù)據(jù)建立功能環(huán)境學圖譜，其表示N種介質(zhì)因子的每一個對K個基本細胞功能的每一個的活化或抑制的強度； e)使用功能環(huán)境學圖譜最優(yōu)化定向為活化或抑制一個或多個基本細胞功能的細胞培養(yǎng)基的組成。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟d)中的功能環(huán)境學圖譜的構(gòu)建包括下列步驟: -進行第一輪培養(yǎng)實驗，其包括數(shù)目等于或高于介質(zhì)因子的數(shù)目+1(N+1)的培養(yǎng)，其中在不同的培養(yǎng)基組成中進行每一個培養(yǎng)，其中篩選了介質(zhì)因子的低和高水平的組合； -對于每一個所進行的培養(yǎng)實驗，獲得初始和終點生物質(zhì)、產(chǎn)物和外代謝物組數(shù)據(jù)或部分外代謝物組數(shù)據(jù)； -使用下列線性模型，通過外代謝物組數(shù)據(jù)或衍生的外代謝物組數(shù)據(jù)相對于培養(yǎng)基組成數(shù)據(jù)的回歸分析確定其相對權(quán)重因子λ j大于零的活性基本細胞功能的亞組，
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟e)中的培養(yǎng)基組成的最優(yōu)化包括下列步驟: -使用功能環(huán)境學數(shù)據(jù)矩陣配制基本細胞功能特異性培養(yǎng)基組成，其中根據(jù)下列公式，介質(zhì)因子值的變化Λ (FACj)引起基本細胞功能的相對權(quán)重的變化Λ (Ai) Δ (Ai) =.1.,X Δ (FACj)(5) -使用應(yīng)用于功能環(huán)境學數(shù)據(jù)陣列的第j列的公式(4)配制細胞培養(yǎng)基組成以增強或抑制單個基本細胞功能j ; -使用同時應(yīng)用于功能環(huán)境學數(shù)據(jù)陣列的多列的公式(4)來配制細胞培養(yǎng)基組成，以通過增強或抑制關(guān)鍵的基本細胞功能組來工程化細胞代謝。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述靶標生物學結(jié)構(gòu)是細胞組織、全細胞、細胞器或表示給定的細胞功能的協(xié)同的生物化學轉(zhuǎn)化組。
5.權(quán)利要求1-3中的任一項的方法，其中所述靶標生物學結(jié)構(gòu)被遺傳修飾，包括定向為活化或抑制基本細胞功能的遺傳修飾。
6.權(quán)利要求1-3中任一項的方法,其中介質(zhì)因子是必需營養(yǎng)物和/或微量營養(yǎng)物和/或生物功能性分子的固體和/或液體或/或氣體混合物的物理化學性質(zhì)，或所述化合物的釋放速度或所述化合物的進料速度。
7.權(quán)利要求1-3和6中任一項的方法，其中所述物理化學性質(zhì)包括溫度和/或壓力和/或pH和/或離子強度和/或濃度和/或活性和/或同滲重摩和/或摩爾滲透壓濃度和/或相關(guān)性質(zhì)。
8.權(quán)利要求1-3和6中任一項的方法,其中必需營養(yǎng)物和/或微量營養(yǎng)物和/或功能性分子包括無機和/或有機材料，包括鹽和/或維生素和/或代謝輔因子和/或抗生素和/或碳水化合物材料和/或脂質(zhì)材料和/或蛋白質(zhì)性質(zhì)材料和/或核苷酸材料和/或信號轉(zhuǎn)導蛋白和/或酶活性的抑制 分子和/或蛋白質(zhì)的激活分子和/或基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和/或干擾核糖核酸和/或具有已知或未知組成的所述材料的復雜混合物，包括血清或者純的或復雜的有機材料的水解產(chǎn)物。
9.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中使用下列公式通過N種介質(zhì)因子的值確定培養(yǎng)基制劑: 培養(yǎng)基制劑={FAC上j=l，…，N， FACj為介質(zhì)因子j的值。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中使用下列公式通過q個生物化學反應(yīng)和K個基本細胞功能確定所述靶生物學結(jié)構(gòu): 革巴標生物學結(jié)構(gòu)={ej，i=l,…，K, θ?為q個元素的向量,其值表示基本細胞功能i的每一個生物化學反應(yīng)的權(quán)重因子。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述基本細胞功能獲自所述靶標生物學結(jié)構(gòu)的生物化學網(wǎng)絡(luò)，其中所述生物化學網(wǎng)絡(luò)被細分為K個包含生物化學轉(zhuǎn)化的亞組的功能性亞網(wǎng)絡(luò)，其中手動地和/或自動地獲得此類亞網(wǎng)絡(luò)。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中基本細胞功能獲自所述靶標生物學結(jié)構(gòu)的生物化學網(wǎng)絡(luò)的基因組規(guī)模重構(gòu)，其中可使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和/或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和/或內(nèi)代謝物組數(shù)據(jù)和/或熱動力學數(shù)據(jù)來預減小K個基本細胞功能的工作組，如果可獲得這些數(shù)據(jù)的話。
13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中通過在搖瓶、T形瓶、反應(yīng)器、微量滴定板、微量生物反應(yīng)器或表型微陣列中進行的系列和/或平行培養(yǎng)實驗來確定所述功能環(huán)境學圖-1'TfeP曰。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中通過外代謝物組測定來確定所述功能環(huán)境學圖譜，所述測定包括通過下述來分析新鮮的或經(jīng)消耗的培養(yǎng)基樣品的上清液:色譜技術(shù)例如液相色譜(LC)或氣相色譜(GC)、NMR技術(shù)例如IH-NMR或13C-NMR、質(zhì)譜技術(shù)(MS)或與質(zhì)譜法聯(lián)合的色譜法例如GC-MS或LC-MS或所述測量技術(shù)的組合。
15.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中通過線性或非線性回歸分析來鑒定活性基本細胞功能的減小的組，其中使外代謝物組數(shù)據(jù)或衍生的外代謝物組數(shù)據(jù)的方差或協(xié)方差最大化，其中使外代謝物組數(shù)據(jù)或衍生的外代謝物組數(shù)據(jù)與介質(zhì)因子的值之間的相關(guān)性最大化，其中根據(jù)它們與介質(zhì)因子的值的相關(guān)性或?qū)λ鲋档拿舾行詫炯毎δ苓M行排序。
16.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中通過高通量自動化系統(tǒng)確定所述功能環(huán)境學圖譜，其中將培養(yǎng)裝置、分析外代謝物組裝置和計算機算法連接在物理設(shè)備中以產(chǎn)生高通量功能環(huán)境學圖譜。
17.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中與產(chǎn)物數(shù)量和/或產(chǎn)物質(zhì)量相關(guān)的靶基本細胞功能i使其相對權(quán)重Λ (λ J增加60至100%。
18.一種用于培養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母的化學上確定的培養(yǎng)基制劑，其特征在于使異源蛋白質(zhì)表達功能增強60至100%，其是通過權(quán)利要求1-17中描述的方法獲得的，其包含:
a)由CuSO4.5H20, 12.0g/L, NaI, 0.16g/L, MnSO4.H2O, 6.00g/L, Na2MoO4.2H20, 0.40g/L, H3BO3, 0.0Olg/L, CoCl2.6H20, 0.25g/L, ZnCl2, 40.0g/L, FeSO4.7H20, 3.25g/L,生物素，0.4g/L, H2SO4, 10.0mL/L構(gòu)成的痕量元素的水性溶液；和 b)溶液a)與由 H3P0485%, 26.70ml/L, CaSO4.2Η200.93g/L, K2S0418.20g/L, MgSO4.7H2014.90g/L, K0H4.13g/L構(gòu)成的補充性基礎(chǔ)水性溶液或其它補充性基礎(chǔ)水性溶液的混合物。
19.權(quán)利要求1-17中 描述的方法的用途，其用于在生物學生產(chǎn)過程中，例如在生物燃料生產(chǎn)中，或疫苗生產(chǎn)中，或藥物生產(chǎn)中，或生物聚合物生產(chǎn)中或所述產(chǎn)物的前體的生產(chǎn)中增加下述的數(shù)量和/或質(zhì)量:組織和/或細胞和/或病毒和/或細胞組分和/或蛋白質(zhì)性質(zhì)的材料和/或碳水化合物材料和/或核苷酸材料和/或脂質(zhì)材料和/或初級代謝產(chǎn)物和/或次級代謝產(chǎn)物或所述產(chǎn)物的混合物。
20.權(quán)利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最優(yōu)化植物界或動物界細胞系或其它真核單細胞或多細胞生物體例如酵母和真菌的細胞培養(yǎng)基的組成。
21.權(quán)利要求1-17中描述的方法的用途，其用于最優(yōu)化原核生物的細胞培養(yǎng)基的組成。
22.權(quán)利要求1-17中描述的方法用于最優(yōu)化干細胞的細胞培養(yǎng)基的組成的用途。
23.權(quán)利要求1-17中描述的方法用于鑒定細胞功能的生物標志物的用途。
24.權(quán)利要求1-17中描述的方法的用途，其用于設(shè)計藥物或用于最優(yōu)化定向為修飾與疾病狀況相關(guān)的細胞功能的藥物混合物。
25.一種生物標志物標識，其包括權(quán)利要求1-17中描述的方法。
26.—種藥物設(shè)計系統(tǒng),其包括權(quán)利要求1-17中描述的方法。
【文檔編號】C12N1/16GK103459584SQ201280011020
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月14日
【發(fā)明者】R·M·弗雷塔斯奧里貝拉, J·M·洛佩茲蒂亞茲, A·R·桑托斯費雷拉 申請人:科學與技術(shù)學院里斯本新大學