重編程培養(yǎng)基、其制備方法及重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重編程培養(yǎng)基、其制備方法及重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法。其中，該重編程培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重編程添加劑1及重編程添加劑2；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；重編程添加劑1包括碳酸氫鈉、硒酸鈉、重組人胰島素、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗壞血酸以及氫化可的松；重編程添加劑2包括碳酸氫鈉，硒酸鈉，重組人胰島素，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，抗壞血酸，丙戊酸以及丁酸鈉。本發(fā)明的重編程培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定且重編程效率高，細(xì)胞譜系廣，可以重編程培養(yǎng)包括人皮膚成纖維，外周血單核細(xì)胞，羊膜上皮細(xì)胞等細(xì)胞。
【專利說明】重編程培養(yǎng)基、其制備方法及重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種重編程培養(yǎng)基、其制備方法及重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日本學(xué)者中山申彌(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通過導(dǎo)入四個轉(zhuǎn)錄因子(0ct4, Sox2, Klf4和c-Myc)的方法，分別成功將小鼠(Takahashi andYamanaka., 2006)和人(Takahashi et al., 2007)的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs),并因此獲得了 2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。hiPS細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)具備hES細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞)的所有分化能力，并且沒有倫理問題，在不久的將來會完全取代hES細(xì)胞，成為再生醫(yī)學(xué)的最主要細(xì)胞來源。
[0003]目前，世界范圍內(nèi)絕大部分科研人員使用人體細(xì)胞的重編程培養(yǎng)條件，都需要明膠包被和飼養(yǎng)層細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，mouse embryonic fibroblasts, MEF)的支持。此外，還采用成分復(fù)雜的敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement, K0SR)作為主要的培養(yǎng)基添加劑。這樣產(chǎn)生的hiPS細(xì)胞，因為長期暴露在富含動物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，不能作為合適的細(xì)胞來源。同時，由于血清替代品不同批次差異較大，所以很不穩(wěn)定，容易影響實驗進度和結(jié)果，造成損失。另外，還由于用于重編程的培養(yǎng)基還需要M EF做飼養(yǎng)層，不同批次MEF的質(zhì)量差異較大，嚴(yán)重影響重編程效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種重編程培養(yǎng)基、其制備方法及重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中hiPS細(xì)胞因為長期暴露在富含動物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)及現(xiàn)有技術(shù)中的重編程培養(yǎng)基嚴(yán)重影響細(xì)胞重編程效率的技術(shù)問題。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種重編程培養(yǎng)基。該重編程培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重編程添加劑I及重編程添加劑2 ;其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；重編程添加劑I包括碳酸氫鈉400~600ug/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素15~30ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子80~120ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白7~13ug/ml、抗壞血酸50~70ug/ml以及氫化可的松0.5~2uM ;重編程添加劑2包括碳酸氫鈉400~600ug/ml,硒酸鈉8~20ng/ml,重組人胰島素15~30ug/ml,重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子80~120ng/ml,重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白7~13ug/ml,抗壞血酸50~70ug/ml,丙戍酸0.5~2mM以及丁酸鈉80~200uM。
[0006]進一步地,重編程添加劑I包括碳酸氫鈉520~580ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及氫化可的松0.9~1.1uM ;重編程添加劑2包括碳酸氫鈉520~580ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及丙戊酸0.9~1.2mM以及丁酸鈉140~160uM。
[0007]進一步地，重編程添加劑I包括碳酸氫鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白I lug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及氫化可的松IuM ;重編程添加劑2包括碳酸鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白Ilug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及丙戍酸ImM以及丁酸鈉150uM。
[0008]進一步地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4~8 °C，重編程添加劑I及重編程添加劑2保存在-20~-80°C單獨冰凍保存。
[0009]進一步地，重編程培養(yǎng)基在使用前配制成重編程培養(yǎng)基I和重編程培養(yǎng)基2，具體包括以下步驟:在2~8°C化凍重編程添加劑I及重編程添加劑2 ;將重編程添加劑I與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成重編程培養(yǎng)基I ;將重編程添加劑2與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成重編程培養(yǎng)基2。
[0010]進一步地，重編程培養(yǎng)基I和重編程培養(yǎng)基2在使用前O~14天配制，并在2~8°C保存。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法采用上述任一種重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0012]進一步地，包括以下步驟:SI，將重編程細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中；S2，向培 養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基I，每隔一天換一次重編程培養(yǎng)基I，在重編程培養(yǎng)基I中培養(yǎng)重編程細(xì)胞3~5天；S3，去除重編程培養(yǎng)基1，向培養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基2，每隔一天換一次重編程培養(yǎng)基2，在重編程培養(yǎng)基2中培養(yǎng)重編程細(xì)胞10~30天。
[0013]本發(fā)明的重編程培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動物源成分，重編程過程中不需要動物源細(xì)胞做飼養(yǎng)層，使培養(yǎng)的重編程在移植后不容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且重編程效率高，細(xì)胞譜系廣，可以重編程培養(yǎng)包括人皮膚成纖維，外周血單核細(xì)胞，羊膜上皮細(xì)胞等細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0015]圖1示出了實驗一中實施例5的培養(yǎng)基培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞在重編程過程不同生長階段的圖像；
[0016]圖2示出了實驗一中AP染色陽性的iPS克隆數(shù)目；
[0017]圖3示出了實驗二中AP染色陽性的iPS克隆數(shù)目；
[0018]圖4示出了實驗三中AP染色陽性的iPS克隆數(shù)目。
【具體實施方式】
[0019]需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0020]現(xiàn)有技術(shù)中，hiPS細(xì)胞因為長期暴露在富含動物制品的培養(yǎng)環(huán)境中，在移植后容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且血清替代品不同批次差異較大，很不穩(wěn)定，容易影響實驗進度和結(jié)果O
[0021]針對上述技術(shù)問題，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供了一種重編程培養(yǎng)基。該重編程培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重編程添加劑I及重編程添加劑2 ;其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基；重編程添加劑I包括碳酸氫鈉400~600ug/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素(Insulin)15~30ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)80~120ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo-transferin) 7 ~13ug/ml、抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 50 ~70ug/ml以及氫化可的松0.5~2uM ;重編程添加劑2包括碳酸鈉400~600ug/ml，硒酸鈉(Sodium selenite)8~20ng/ml,重組人胰島素15~30ug/ml,重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子80~120ng/ml,重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白7~13ug/ml,抗壞血酸50~70ug/ml,丙戍酸0.5~2mM以及丁酸鈉80~200uM。 [0022]本發(fā)明的重編程培養(yǎng)基成分明確，品質(zhì)穩(wěn)定；不含動物源成分，重編程過程中不需要動物源細(xì)胞做飼養(yǎng)層，使培養(yǎng)的重編程在移植后不容易產(chǎn)生人體排斥反應(yīng)，且重編程效率，細(xì)胞譜系廣，可以培養(yǎng)包括人皮膚成纖維，外周血單核細(xì)胞，羊膜上皮細(xì)胞等細(xì)胞。
[0023]優(yōu)選的，重編程添加劑I包括碳酸氫鈉520~580ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及氫化可的松0.9-1.1uM ;重編程添加劑2包括碳酸鈉540~550ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及丙戊酸0.9~1.2mM以及丁酸鈉140~160uM。
[0024]進一步優(yōu)選的，重編程添加劑I包括碳酸氫鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白I lug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及氫化可的松IuM ;重編程添加劑2包括碳酸鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白llug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及丙戍酸ImM以及丁酸鈉150uM。
[0025]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4~8°C，重編程添加劑I及重編程添加劑2保存在-20~-80-°C單獨冰凍保存。重編程添加劑I及重編程添加劑2含有生長因子，在-20~-80-°C保存可以保持穩(wěn)定在一年以上。
[0026]優(yōu)選的，重編程培養(yǎng)基在使用前配制成重編程培養(yǎng)基I和重編程培養(yǎng)基2，其配置比例可以按照實際情況進行配比，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，具體包括以下步驟:在2~8°C化凍重編程添加劑I及重編程添加劑2 ;將重編程添加劑I與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成重編程培養(yǎng)基I ;將重編程添加劑2與基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成重編程培養(yǎng)基2。優(yōu)選的，重編程培養(yǎng)基I和重編程培養(yǎng)基2在使用前O~14天配制，并在2~8°C保存。
[0027]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法是采用上述重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0028]優(yōu)選的，包括以下步驟:S1，將重編程細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠(Matrigel)或玻璃粘連蛋白(Vitronectin)的培養(yǎng)皿中；S2，向培養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基1，每隔一天換一次重編程培養(yǎng)基1，在重編程培養(yǎng)基I中培養(yǎng)重編程細(xì)胞3~5天；S3，去除重編程培養(yǎng)基1，向培養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基2，每隔一天換一次重編程培養(yǎng)基2，在重編程培養(yǎng)基2中培養(yǎng)重編程細(xì)胞10~25天。在此種條件下培養(yǎng)細(xì)胞，更有利于細(xì)胞的生長。
[0029]下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0030]在下列實施例中，重編程添加劑I及重編程添加劑2通過以下步驟配置:
[0031]重編程添加劑1:
[0032]第一步:配制各種成分的儲備液:①碳酸氫鈉75mg/ml、②硒酸鈉70ug/ml、③重組人胰島素(Insulin) 4mg/ml、④重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 200ng/ul、⑤重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo-transferin) 50mg/ml、⑥抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 64mg/ml 以及⑦氫化可的松2mM。
[0033]第二步:在室溫下將以上各種成分的儲備液按照以上儲備液編號順序依次混合，成為終濃度為碳酸氫鈉400~600ug/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素(Insulin)15~301^/1111 、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子6?6?)80~120ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo-transferin) 7 ~13ug/ml、抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 50 ~70ug/ml 以及氫化可的松0.5-2uM的工作液。
[0034]重編程添加劑2:
[0035]第一步:配制各種成分的儲備液:①碳酸氫鈉75mg/ml、②硒酸鈉70ug/ml、③重組人胰島素(Insulin) 4mg/ml、④重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) 200ng/ul、⑤重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo-transferin) 50mg/ml、⑥抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 64mg/ml 以及⑦丙戊酸2M以及丁酸鈉200mM。
[0036]第二步:在室溫下將以上各種成分的儲備液按照以上儲備液編號順序依次混合，成為終濃度為碳酸鈉400~600ug/ml、硒酸氫鈉8~20ng/ml、重組人胰島素(Insulin)15~301^/1111、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子6?6?)80~120ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Holo-transferin) 7 ~13ug/ml、抗壞血酸(L-Ascorbic acid) 50 ~70ug/ml、丙戍酸0.5~2mM以及丁酸鈉80~200uM的工作液。
[0037]實施例1-5中的重編程培養(yǎng)基的組分如表1所示。
[0038]表1
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種重編程培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重編程添加劑I及重編程添加劑2 ； 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基； 所述重編程添加劑I包括碳酸氫鈉400~600ug/ml、硒酸鈉8~20ng/ml、重組人胰島素15~30ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子80~120ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白7~13ug/ml、抗壞血酸50~70ug/ml以及氫化可的松0.5~2uM ； 所述重編程添加劑2包括碳酸氫鈉400~600ug/ml，硒酸鈉8~20ng/ml，重組人胰島素15~30ug/ml,重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子80~120ng/ml,重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白7~13ug/ml，抗壞血酸50~70ug/ml，丙戊酸0.5~2mM以及丁酸鈉80~200uM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重編程培養(yǎng)基，其特征在于， 所述重編程添加劑I包括碳酸氫鈉520~580ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及氫化可的松0.9~1.1uM ； 所述重編程添加劑2包括碳酸氫鈉520~580ug/ml、硒酸鈉12~16ng/ml、重組人胰島素18~22ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子90~110ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10~12ug/ml、抗壞血酸63~66ug/ml以及丙戍酸0.9~1.2mM以及丁酸鈉140~160uM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重編程培養(yǎng)基，其特征在于， 所述重編程添加劑I包括碳酸氫鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞`生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白llug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及氫化可的松IuM ； 所述重編程添加劑2包括碳酸鈉543ug/ml、硒酸鈉14ng/ml、重組人胰島素20ug/ml、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子100ng/ml、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白llug/ml、抗壞血酸65ug/ml以及丙戊酸ImM以及丁酸鈉150uM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重編程培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基保存在4~8°C，所述重編程添加劑I及重編程添加劑2保存在-20~-80°C單獨冰凍保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重編程培養(yǎng)基，其特征在于，所述重編程培養(yǎng)基在使用前配制成重編程培養(yǎng)基I和重編程培養(yǎng)基2，具體包括以下步驟: 在2~8 °C化凍所述重編程添加劑I及重編程添加劑2 ； 將所述重編程添加劑I與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成所述重編程培養(yǎng)基I ; 將所述重編程添加劑2與所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以7:500的體積配混合后形成所述重編程培養(yǎng)基2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重編程培養(yǎng)基，其特征在于，所述重編程培養(yǎng)基I和所述重編程培養(yǎng)基2在使用前O~14天配制，并在2~8°C保存。
7.—種重編程細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1至6中任一項所述的重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，將重編程細(xì)胞接種到鋪有基質(zhì)膠或玻璃粘連蛋白的培養(yǎng)皿中； S2，向所述培養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基1，每隔一天換一次所述重編程培養(yǎng)基1，在所述重編程培養(yǎng)基I中培養(yǎng)所述重編程細(xì)胞3~5天； S3，去除所述重編程培養(yǎng)基1，向所述培養(yǎng)皿中加入重編程培養(yǎng)基2，每隔一天換一次所述重編程培養(yǎng)基2，在所述重編程培養(yǎng)基2中培養(yǎng)所述重編程細(xì)胞10~30天。
【文檔編號】C12N5/10GK103602635SQ201310585820
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】李揚, 蘭峰 申請人:北京賽貝生物技術(shù)有限公司