毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含移植用再生毛囊原基的組合物 ...的制作方法
【專利摘要】提供通過毛囊原基的移植使毛發(fā)再生的技術(shù)，其中再生毛發(fā)的顏色受控制。移植后生長(zhǎng)的毛發(fā)的顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述方法包括：制備包含間葉細(xì)胞的第1細(xì)胞集合體的步驟；制備包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體的步驟；制備包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的步驟；使所述第1細(xì)胞集合體和所述第2細(xì)胞集合體中的至少一方與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的步驟；以及，接下來使其中至少一方已與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的所述第1細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體彼此緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)這些細(xì)胞集合體的步驟。
【專利說明】毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含
移植用再生毛囊原基的組合物和再生毛囊原基的移植方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法、包含所述移植用再生毛囊原基的組合物，以及所述移植用再生毛囊原基的移植方法。
【背景技術(shù)】
[0002]再生醫(yī)療是將因各種疾病或外傷而變得功能不全的臟器或器官更換為再生的臟器或器官的技術(shù)，其有希望作為下一代醫(yī)療技術(shù)以對(duì)移植醫(yī)療進(jìn)行補(bǔ)充（非專利文獻(xiàn)I)。在目前的再生醫(yī)療研究中，在干細(xì)胞移植療法方面已取得進(jìn)展，該方法是在受傷的組織或部分功能障礙的器官移入干細(xì)胞或前體細(xì)胞而恢復(fù)其功能。
[0003]在由如皮膚或角膜上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等單一種類的細(xì)胞種所構(gòu)成的二維組織的再生方面，一種組織再生技術(shù)也已接近實(shí)際應(yīng)用階段，在該技術(shù)中通過使用細(xì)胞片層技術(shù)將細(xì)胞培養(yǎng)成片層形式來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行組織化。其中，通過使作為間葉細(xì)胞的成纖維細(xì)胞與皮膚表皮細(xì)胞分層化以人為地再現(xiàn)組織學(xué)上所適合的層狀構(gòu)造，能夠使功能性的皮膚組織再生，該技術(shù)已臨床應(yīng)用于重度燙傷的治療方面。
[0004]另一方面，已知的是，在器官中，多種功能細(xì)胞是呈三維配置的，以表現(xiàn)出獨(dú)特的功能。幾乎全部的器官都是通過胚胎期的上皮細(xì)胞與間葉細(xì)胞的相互作用所產(chǎn)生，從而展現(xiàn)特有的形態(tài)和器官功能。在目前的再生醫(yī)療技術(shù)中，難以將多種細(xì)胞以三維的形式進(jìn)行配置，能夠在活體外立即發(fā)揮功能的再生器官構(gòu)造目前還沒被開發(fā)出來。
[0005]最近，在如牙齒和唾液腺等外胚層附屬器官、和如毛囊等皮膚附屬器官方面正在進(jìn)行一種以器官再生為目標(biāo)的研究，通過使器官原基再生而再現(xiàn)出發(fā)育的過程。這些器官不直接關(guān)系到生命的維持，但已知它們會(huì)陷入器官喪失或功能不全的狀況。作為這樣的例子可列舉由齲齒、損傷或牙胚 發(fā)育不全造成的牙齒的喪失、或者隨著老齡化而發(fā)生的唾液分泌障礙、男性型脫發(fā)癥或毛囊發(fā)育不良造成毛發(fā)的喪失等。這樣的器官喪失或功能不全會(huì)對(duì)QOL (生活品質(zhì)）造成很大的影響，因此通過器官再生而進(jìn)行的功能恢復(fù)受到很高的期待。
[0006]一般而言，哺乳類或鳥類中，毛發(fā)、羽毛及爪等外胚層皮膚附屬器遍布于皮膚，具有生存或生殖等物種特異的功能。在哺乳類中，毛發(fā)具有保持體溫或者對(duì)外傷及紫外線的防御功能。進(jìn)一步，在靈長(zhǎng)類等高級(jí)哺乳類中，毛發(fā)在體表產(chǎn)生特征性的顏色和花樣，認(rèn)為這在生殖種群內(nèi)展現(xiàn)等級(jí)或生殖能力上是有用的。而且，當(dāng)毛發(fā)在特定部位大量存在時(shí)，它根據(jù)其在體表的區(qū)域或功能而在粗細(xì)、硬度、顏色等毛發(fā)質(zhì)量上產(chǎn)生差異，并展現(xiàn)審美上和功能上的價(jià)值。尤其是在人類中，頭發(fā)的顏色和質(zhì)量具有社會(huì)意義，認(rèn)為因年齡增長(zhǎng)或疾病所導(dǎo)致的其發(fā)生的變化對(duì)個(gè)人的QOL (生活品質(zhì)）造成很大的影響。
[0007]為了建立足以臨床應(yīng)用的毛囊再生醫(yī)療技術(shù)，必須使再生毛囊具有正常的組織構(gòu)造且具有適合于移植部位的毛干的毛發(fā)形成和伸長(zhǎng)。這種包含毛發(fā)等皮膚附屬器官的外胚層附屬器官通常是通過胎兒期時(shí)上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生。作為皮膚附屬器官，毛囊會(huì)在個(gè)體的整個(gè)生命期重復(fù)成長(zhǎng)與退化（毛發(fā)周期）。已知在成長(zhǎng)期的毛球部的再生，是由與毛囊器官新生期時(shí)的相似的分子機(jī)理所誘導(dǎo)出來。另外還認(rèn)為在這樣的毛發(fā)周期中，毛球部的再生是通過作為間葉細(xì)胞的毛乳頭細(xì)胞所誘導(dǎo)出來。此外，認(rèn)為在成長(zhǎng)期中，作為間葉細(xì)胞的毛乳頭細(xì)胞分化誘導(dǎo)毛囊上皮干細(xì)胞以再生出毛球。另外由于在隆突(bulge)區(qū)域及隆突區(qū)域下方的區(qū)域中，存在有來自神經(jīng)嵴的干細(xì)胞的龕（niche)，因此認(rèn)為毛囊會(huì)保持住多個(gè)干細(xì)胞龕并發(fā)揮干細(xì)胞庫的功能。
[0008]至目前為止，已進(jìn)行了一些關(guān)于毛囊再生的嘗試，如通過取代間葉細(xì)胞（毛乳頭細(xì)胞及真皮毛根鞘細(xì)胞）以進(jìn)行毛囊可變區(qū)域的再生、通過具有毛囊誘導(dǎo)能力的間葉細(xì)胞進(jìn)行毛囊新生、通過上皮/間葉細(xì)胞進(jìn)行毛囊的再構(gòu)建等。此外，最近本發(fā)明的發(fā)明人等證明了通過器官原基法（例如參考專利文獻(xiàn)I)，從來自成體小鼠胡須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠胡須的培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞再構(gòu)建的再生毛囊原基模仿了正常的發(fā)育，并能夠使毛囊與毛發(fā)再生。然而，使用來自成體小鼠胡須的再生毛囊原基進(jìn)行毛囊再生時(shí)，存在有幾乎所有的再生毛發(fā)成為白色毛發(fā)的問題。
[0009][文獻(xiàn)列表]
[0010][專利文獻(xiàn)]
[0011][專利文獻(xiàn)I]國(guó)際公開第2006/129672號(hào)冊(cè)子
[0012][非專利文獻(xiàn)]
[0013][非專利文獻(xiàn) I] Sharpe PT, Young CS. Test-tube teeth. Sc. Am. 293, 34-41, 2005
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014](本發(fā)明要解決的技術(shù)問題）
[0015]如上所述，至今還沒有足以臨床應(yīng)用的毛囊再生技術(shù)的任何報(bào)道，尤其是關(guān)于控制毛發(fā)顏色的毛囊再生技術(shù)的任 何報(bào)道。尤其是將毛發(fā)再生技術(shù)應(yīng)用于人類時(shí)，必需從來自成體的組織獲得毛發(fā)顏色受控制的再生毛發(fā)，因此強(qiáng)烈期望有控制來自成體組織的再生毛發(fā)的毛發(fā)顏色的方法。
[0016](解決問題的方法）
[0017]為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人等首先著眼于掌管毛發(fā)顏色的黑色素母細(xì)胞(melanoblasts)的分布與其分布區(qū)域，分析存在于每個(gè)分布區(qū)域的細(xì)胞功能。然后，本發(fā)明的發(fā)明人等通過應(yīng)用所述黑色素母細(xì)胞分布區(qū)域所含細(xì)胞的功能，而發(fā)現(xiàn)了毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法。
[0018]亦即，本發(fā)明是關(guān)于移植后生長(zhǎng)的再生毛發(fā)的顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述移植用再生毛囊原基的制造方法包括：制備包含間葉細(xì)胞的第I細(xì)胞集合體的步驟，制備包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體的步驟，制備包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體之步驟，使所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體與所述第I細(xì)胞集合體和所述第2細(xì)胞集合體中的至少一方結(jié)合的步驟，以及，接下來，使其中至少一方與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟。
[0019]在此，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第I細(xì)胞集合體實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞所構(gòu)成。[0020]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第2細(xì)胞集合體實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞所構(gòu)成。[0021]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體經(jīng)過單一化處理。[0022]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述色素干細(xì)胞是源自次級(jí)隆突（subbulge)區(qū)域的黑色素母細(xì)胞或源自毛母基底部（hair matrix base)的黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞。[0023]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)使所述細(xì)胞集合體結(jié)合在一起時(shí)，所述第I細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)或所述第2細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)， 與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)之比在O. I :1至100 :1的范圍內(nèi)。[0024]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述間葉細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞或真皮毛根鞘細(xì)胞。[0025]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述上皮細(xì)胞是隆突區(qū)域上皮細(xì)胞或毛母基底部上皮細(xì)胞。[0026]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞源自成體的毛囊。[0027]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含將導(dǎo)引器（guide)插入到所述再生毛囊原基中的步驟。[0028]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，移植所述再生毛囊原基時(shí)所再生的再生毛囊包含黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕。[0029]另外，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的制造方法的一個(gè)實(shí)施方案中，移植所述再生毛囊原基時(shí)所再生的再生毛囊能夠永久地形成有色毛發(fā)。[0030]本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包含毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的組合物，所述移植用再生毛囊原基是通過上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的。[0031]另外，本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述移植方法包括將通過上述移植用再生毛囊原基的制造方法而制作的移植用再生毛囊原基移植到作為對(duì)象的部位的步驟。[0032]而且，在本發(fā)明的移植用再生毛囊原基的移植方法的一個(gè)實(shí)施方案中，通過將所述導(dǎo)引器維持在突出于移植部位的狀態(tài)，使所移植的再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)的部分與所述對(duì)象的上皮細(xì)胞沿著所述導(dǎo)引器伸長(zhǎng)并連接。[0033](發(fā)明效果）[0034]根據(jù)本發(fā)明，通過使 用在制作再生毛囊原基時(shí)與上皮細(xì)胞或間葉細(xì)胞分開制備的色素干細(xì)胞，能夠制作移植后最初生長(zhǎng)的毛發(fā)為有色毛發(fā)的移植用再生毛囊原基。進(jìn)一步， 通過本發(fā)明所制作的移植用再生毛囊原基，能夠再生不僅具有毛發(fā)顏色并且具有正常毛干的毛發(fā)。[0035]另外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在再生毛囊中能夠形成黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕，其中所述再生毛囊是由本發(fā)明所制作的移植用再生毛囊原基的移植后所再生的。從而毛囊中的黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕能夠在維持黑色素母細(xì)胞的同時(shí)，適當(dāng)?shù)靥峁┖谏丶?xì)胞，因此經(jīng)過較長(zhǎng)的時(shí)間能夠形成有色毛發(fā)?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0036]圖I表示毛囊中的黑色素母細(xì)胞與黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞的分布的示意圖。在毛囊的次級(jí)隆突區(qū)域存在分布有黑色素母細(xì)胞的黑色素母細(xì)胞龕，在毛母基底部分布有黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞。圖I中，DP表示毛乳頭，SG表示皮脂腺。[0037]圖2表示移植通過下述三個(gè)條件制作的再生毛囊原基后，毛囊再生和毛發(fā)生長(zhǎng)的移植部位的立體顯微鏡的照片（圖2a_2c)。圖2a表示移植由來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基的毛發(fā)生長(zhǎng)部位（對(duì)照組）。另外，向來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞，進(jìn)一步添加來自成體小鼠頰須的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞，由此制作再生毛囊原基，移植該再生毛囊原基時(shí)的毛發(fā)生長(zhǎng)部位表示于圖2b(次級(jí)隆突添加區(qū)）。向來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞，進(jìn)一步添加來自成體小鼠頰須的采集自毛母基底部的細(xì)胞，由此制作再生毛囊原基，移植該再生毛囊原基時(shí)的毛發(fā)生長(zhǎng)部位表示于圖2c (毛母基底部添加區(qū)）。在對(duì)照組中獲得了白色毛發(fā)（圖2a)，而在次級(jí)隆突添加區(qū)及毛母基底部添加區(qū)能夠獲得黑色毛發(fā)（圖2b的黑色箭頭標(biāo)記和圖2c)。圖2b的白色箭頭表示白色的再生毛發(fā)。[0038]圖3表示在天然毛囊或通過移植再生毛囊原基而再生的毛囊的作為黑色素母細(xì)胞干細(xì)胞龕存在部位的次級(jí)隆突區(qū)域的外毛根鞘中，進(jìn)行作為黑色素母細(xì)胞的分化譜系標(biāo)記物的多巴色素互變異構(gòu)酶（dopachrome tautomerase:Dct)的原位雜交（in situ hybridization)時(shí)的結(jié)果。圖3的影像是原位雜交后用突光顯微鏡拍攝的。圖3A至3C分別為：(A)具有黑色毛發(fā)的天然毛囊；(B)來自再生毛囊原基的具有白色毛發(fā)的毛囊，該再生毛囊原基由來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞所制作；(C)來自再生毛囊原基的具有黑色毛發(fā)的毛囊，該再生毛囊原基通過向來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞中進(jìn)一步添加來自成體小鼠頰須的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞（次級(jí)隆突添加區(qū)）而制作。圖3中的箭頭標(biāo)記表示多巴色素互變異構(gòu)酶的檢出部位。[0039]圖4分別表示對(duì)由來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基（對(duì)照組），以及對(duì)通過向來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞中進(jìn)一步添加來自成體小鼠頰須的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞（次級(jí)隆突添加區(qū)）或采集自來自成體小鼠頰須的毛母基底部的細(xì)胞（毛母基底部添加區(qū)）而制作的再生毛囊原基進(jìn)行 移植后，最初生長(zhǎng)的毛發(fā)的有色毛發(fā)率。[0040]圖5表示用電子顯微鏡觀察由毛囊生長(zhǎng)的毛發(fā)的毛干的結(jié)果，該毛囊是通過將使用來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞、來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞和采集自來自成體小鼠頰須的毛母基底部的細(xì)胞所制作的再生毛囊原基移植至受體小鼠的皮內(nèi)而再生的。[0041 ] 圖6表示通過下述兩個(gè)條件制作的再生毛囊原基的移植后第36天和移植后第306 天，其生長(zhǎng)毛發(fā)的移植部位的由立體顯微鏡拍攝的照片。圖6的左圖和中間圖表示對(duì)于通過向來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞中進(jìn)一步添加采集自來自成體小鼠頰須的毛母基底部的細(xì)胞而制作再生毛囊原基，移植后第36天和第306天的毛發(fā)生長(zhǎng)部位（毛母基底部添加區(qū)）。另外，圖6中，右圖表示將由來自成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基移植后，第306天的毛發(fā)生長(zhǎng)部位（對(duì)照組）。
【具體實(shí)施方式】
[0042]根據(jù)本發(fā)明的制造方法的第一個(gè)實(shí)施方案，其為移植后生長(zhǎng)的毛發(fā)的毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的制造方法，所述制造方法包括：制備包含間葉細(xì)胞的第I細(xì)胞集合體的步驟，制備包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體的步驟，制備包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的步驟，使所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體與所述第I細(xì)胞集合體和所述第2細(xì)胞集合體中的至少一方結(jié)合的步驟；以及，接下來，使其中至少一方與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合了的所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟。
[0043]本說明書中，“間葉細(xì)胞”是指來自間葉組織的細(xì)胞和對(duì)這樣的來自間葉組織的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)所得到的細(xì)胞，“上皮細(xì)胞”是指來自上皮組織的細(xì)胞和對(duì)這樣的來自上皮組織的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)所得到的細(xì)胞。
[0044]色素細(xì)胞是指分布在皮膚的表皮層和真皮層內(nèi)以及毛囊的上皮層內(nèi)，并制作黑色素的細(xì)胞。色素細(xì)胞所制作的黑色素與毛發(fā)的顏色有深層次的關(guān)系。而且，已知的是，色素細(xì)胞是由色素干細(xì)胞或色素細(xì)胞的前體細(xì)胞而分化的。
[0045]另外，本說明書中，“色素干細(xì)胞”是指會(huì)分化成色素細(xì)胞（黑色素細(xì)胞）的黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞和黑色素母細(xì)胞（色素干細(xì)胞）。另外，當(dāng)包含色素干細(xì)胞時(shí)，可以使用上述細(xì)胞中的一種，也可以使用上述兩種類型細(xì)胞的混合物。另外，黑色素母細(xì)胞是指不具有色素且能夠分化成黑色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞的處于未分化狀態(tài)的干細(xì)胞。黑色素母細(xì)胞在毛囊中的特定的干細(xì)胞龕中，長(zhǎng)時(shí)間地被維持在未分化的狀態(tài)。進(jìn)一步，黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞是指不具有色素且能夠分化成黑色素細(xì)胞的處于未分化狀態(tài)的前體細(xì)胞。另外，色素細(xì)胞（黑色素細(xì)胞）是指 最終分化而成的具有色素的細(xì)胞。
[0046]另外，本說明書中，“包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體”包括含有例如上述色素干細(xì)胞等色素干細(xì)胞的組織或區(qū)域、處于這樣的組織或區(qū)域經(jīng)過酶處理或單一化處理等被分離成細(xì)胞單元的狀態(tài)下的細(xì)胞、或?qū)⒃摲蛛x的細(xì)胞經(jīng)過離心分離等而成為細(xì)胞凝集塊的狀態(tài)。進(jìn)一步，包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體，可以是實(shí)質(zhì)上由色素干細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體。
[0047]另外，本發(fā)明中，“隆突區(qū)域”是指在毛囊的皮脂腺附著部位下方，且在豎毛肌(arrector pili muscle)附著部位上方的毛囊恒定區(qū)域。另外，在不存在豎毛肌的小鼠頰須等情況下，在相當(dāng)于豎毛肌附著部位的區(qū)域存在有香腸環(huán)（Ringwurst)。Ringwurst是指附著于臉頰胡須毛囊不變區(qū)域的最下端部的由來自神經(jīng)脊的間葉細(xì)胞所構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是嚙齒類的臉頰胡須具有的特征。因此，本說明書中，不存在豎毛肌的臉頰胡須等的毛囊中的“隆突區(qū)域”是指在毛囊的皮脂腺附著部位的下方且在Ringwurst的上方的區(qū)域。另外，恒定區(qū)域（不變區(qū)域）是指沒有與毛囊的毛發(fā)周期相關(guān)的成長(zhǎng)或退化等毛囊的組織結(jié)構(gòu)上的變化的區(qū)域?！按渭?jí)隆突區(qū)域”是指鄰接于隆突區(qū)域下方的恒定區(qū)域的最下端部分。[0048]另外，本發(fā)明中，“毛母基底部”是指位于毛球的毛母中的Auber氏線的下方的，沒有分布產(chǎn)生黑色素的黑色素細(xì)胞的區(qū)域。
[0049]本說明書中，“再生毛囊原基”是指通過包括使包含間葉細(xì)胞的第I細(xì)胞集合體與包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟的方法而制作的毛囊原基。
[0050]“使包含間葉細(xì)胞的第I細(xì)胞集合體與包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟”記載在例如專利文獻(xiàn)I、日本特開2008-29756號(hào)公報(bào)、日本特開2008-206500號(hào)公報(bào)、日本特開2008-200033號(hào)公報(bào)以及日本特開2008-29757號(hào)公報(bào)中。將所有這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容的全部以引用的方式并入本說明書中。
[0051]使所述第I細(xì)胞集合體和第2細(xì)胞集合體中的至少一方與包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合。隨后，使該細(xì)胞集合體與另一細(xì)胞集合體一起在支持體內(nèi)部培養(yǎng)，以制作再生毛囊原基。其中，可以使所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體與所述第I細(xì)胞集合體和第2細(xì)胞集合體中任一方結(jié)合，或者也可以使所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體與所述第I細(xì)胞集合體和第2細(xì)胞集合體都結(jié)合。
[0052]另外，由于黑色素母細(xì)胞存在于毛囊的上皮層，因此當(dāng)使用黑色素母細(xì)胞作為色素干細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選地使包含黑色素母細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合至包含上皮細(xì)胞的細(xì)胞集合體，因?yàn)檫@樣能夠維持干細(xì)胞功能。
[0053]另外，本說明書中，“使第I或第2細(xì)胞集合體與包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合”包括使一細(xì)胞集合體以整體或一部分的方式與另一種細(xì)胞集合體混合，還包括使細(xì)胞集合體的表面彼此接觸或附著。因此，已與包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的第I或第2細(xì)胞集合體為在該細(xì)胞集合體中混合有或包含有色素干細(xì)胞的狀態(tài)。
[0054]當(dāng)使所述包含色素干細(xì)胞的 細(xì)胞集合體與所述第I細(xì)胞集合體和第2細(xì)胞集合體中的至少一方結(jié)合時(shí)，所述第I細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)或所述第2細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)與包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)之間的比例可根據(jù)將要使用的細(xì)胞等條件而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。然而，例如優(yōu)選地將所述比例調(diào)整為在O. I :1至100 ：1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地調(diào)整為在O. I :1至10 :1的范圍內(nèi)，且進(jìn)一步更優(yōu)選地調(diào)整為在O. 5 :1至2 :1的范圍內(nèi)。
[0055]然而，第I細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)或第2細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)與包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)的比例并不限定于上述范圍，只要能控制所制作的再生毛囊原基的毛發(fā)顏色即可。
[0056]當(dāng)所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體與第I細(xì)胞集合體和第2細(xì)胞集合體都結(jié)合時(shí)，可以以相對(duì)于第一和第二細(xì)胞集合體中的每一個(gè)細(xì)胞集合體都滿足上述范圍內(nèi)的方式，使包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體進(jìn)行結(jié)合。
[0057]進(jìn)一步，此時(shí)通過調(diào)整與第I細(xì)胞集合體或第2細(xì)胞集合體結(jié)合的色素干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例，能夠控制毛發(fā)顏色的濃淡。
[0058]另外，當(dāng)結(jié)合包含所述色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體之后，使所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)時(shí)，包含間葉細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)與包含上皮細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)的比例可以根據(jù)將要使用的細(xì)胞等條件而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。然而，例如優(yōu)選地調(diào)整在O. I :1至3 :1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地調(diào)整在O. 3 :1至I :I的范圍內(nèi)。此外，在培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選的是提高上皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例，因?yàn)檫@樣能夠提高再生毛發(fā)的產(chǎn)生率和毛發(fā)品質(zhì)。[0059]進(jìn)一步，當(dāng)在所述第I細(xì)胞集合體與第2細(xì)胞集合體中的一方中加入色素干細(xì)胞時(shí)，另一方細(xì)胞集合體可以實(shí)質(zhì)上僅由間葉細(xì)胞或?qū)嵸|(zhì)上僅由上皮細(xì)胞構(gòu)成。本發(fā)明中， “實(shí)質(zhì)上僅由間葉細(xì)胞構(gòu)成”是指該細(xì)胞集合體與僅由間葉細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞集合體發(fā)揮相同功能。優(yōu)選地是指所述細(xì)胞集合體除了包含作為間葉細(xì)胞的細(xì)胞外盡量不包含其他任何物質(zhì)的狀態(tài)。另外，所述細(xì)胞集合體可以含有不同種類的細(xì)胞，只要它們是間葉細(xì)胞即可。 “實(shí)質(zhì)上僅由上皮細(xì)胞所構(gòu)成”的情況也是同樣的。[0060]這里，細(xì)胞集合體是指細(xì)胞緊密接觸的狀態(tài)或不緊密接觸的狀態(tài)，可以是組織或從組織中采集后經(jīng)過單一化處理的細(xì)胞群，亦可為由分散的細(xì)胞所制備的細(xì)胞凝集塊。使用組織是有利的，因?yàn)檫@樣可以容易地得到細(xì)胞配置和形狀正確的器官，但能獲得的量可能是有限的。制備細(xì)胞凝集塊時(shí)也可以使用培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)使用培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)相對(duì)較容易獲得細(xì)胞凝集塊，使得培養(yǎng)細(xì)胞至少在這點(diǎn)上是優(yōu)選的。另外，為了制作再生毛囊原基，而將細(xì)胞集合體注入支持體內(nèi)部，使其緊密接觸然后培養(yǎng)它們時(shí)，所述細(xì)胞集合體優(yōu)選地為細(xì)胞是緊密接觸狀態(tài)的組織或細(xì)胞凝集塊。[0061]作為本發(fā)明所使用的色素干細(xì)胞，優(yōu)選的是使用來自毛囊的色素干細(xì)胞，因?yàn)檫@有助于定向毛囊再生的方向。例如當(dāng)使用黑色素母細(xì)胞作為色素干細(xì)胞時(shí)，可以使用存在于毛囊的次級(jí)隆突區(qū)域的黑色素母細(xì)胞，而當(dāng)使用黑色素細(xì)胞的前體細(xì)胞作為色素干細(xì)胞時(shí)，可以使用存在于毛囊的毛母基底部的黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞。[0062]另外，作為來自毛囊以外的色素干細(xì)胞，可以使用分布于皮膚內(nèi)的表皮層內(nèi)的細(xì)胞。[0063]本發(fā)明所使用的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的至少一方優(yōu)選地來自毛囊（包括構(gòu)成毛囊的器官、組織和細(xì)胞）。由此，利用已經(jīng)定向于毛囊的方向的細(xì)胞能夠容易地形成器官。 進(jìn)一步，為了更可靠地制造毛囊，最優(yōu)選的是，間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞都來自毛囊。[0064]換而言之，當(dāng)制作再生毛囊原基時(shí)，可以使用來自毛囊的間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞。更具體地，可以使用毛乳頭細(xì)胞、真皮毛根鞘細(xì)胞及發(fā)育期的皮膚間葉細(xì)胞等作為間葉細(xì)胞， 可以使用隆突區(qū)域的外毛根鞘最外層細(xì)胞及毛母基底部的上皮細(xì)胞等作為上皮細(xì)胞。此外，可以使用由iPS細(xì)胞或ES細(xì)胞所誘導(dǎo)的毛囊間葉細(xì)胞作為間葉細(xì)胞，可以使用由iPS 細(xì)胞或ES細(xì)胞所誘導(dǎo)的毛囊上皮細(xì)胞作為上皮細(xì)胞。[0065]此外，用于采集間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞和色素干細(xì)胞的毛囊優(yōu)選地為成長(zhǎng)期的毛囊。通過使用來自成長(zhǎng)期的毛囊的細(xì)胞，可以高頻率地誘導(dǎo)高質(zhì)量的再生毛發(fā)。另外， 所述毛囊可來自胚胎或成體。優(yōu)選地，從來自胚胎的毛囊采集細(xì)胞，因?yàn)檫@樣能夠有效率地采集毛囊器官發(fā)育期的毛囊細(xì)胞，并能夠獲得未分化的細(xì)胞。另一方面，優(yōu)選地，從來自成體的毛囊采集細(xì)胞，因?yàn)檫@樣利用器官內(nèi)的細(xì)胞分布的區(qū)域性，能夠分離或獲得有用的細(xì)胞。尤其是本發(fā)明在人的臨床應(yīng)用中，可以利用對(duì)象者的細(xì)胞，就避免免疫導(dǎo)致的移植排斥和避免使用ES細(xì)胞等倫理問題而言，這是優(yōu)選的。此外，已有報(bào)道移植后的毛囊是免疫耐受的（Reynolds et. al. , Trans-gender induction of hair follicles. Nature. 1999Nov4; 402 (67 57) :33-4)?；蛘撸绻ㄟ^其他方法而進(jìn)行免疫抑制是可能的， 則可利用來自通過美容整形手術(shù)等所產(chǎn)生的另一家族的成體的手術(shù)材料等，考慮到其在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上的極高的價(jià)值，這是優(yōu)選的。[0066]可以使用來活體內(nèi)其它間葉組織的細(xì)胞作為來自除了毛囊以外的間葉細(xì)胞。優(yōu)選地，這樣的細(xì)胞為不含血細(xì)胞的骨髓細(xì)胞或間葉細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選地，為口腔內(nèi)的間葉細(xì)胞或頜骨內(nèi)部的骨髓細(xì)胞、來自顱神經(jīng)嵴細(xì)胞的間葉細(xì)胞、可分化成這樣的間葉細(xì)胞的間葉前體細(xì)胞或其干細(xì)胞等。使用源自羊膜的細(xì)胞作為間葉細(xì)胞的例子被記載在日本特開2008-206500號(hào)公報(bào)，使用通過全能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)所得到的細(xì)胞作為間葉細(xì)胞的例子被記載在日本特開2008-200033號(hào)公報(bào)，將其全部的公開內(nèi)容以引用方式并入本說明書。
[0067]作為來自除了毛囊以外的上皮細(xì)胞，也可以使用來自活體內(nèi)其他上皮組織的細(xì)胞。優(yōu)選地，這樣的細(xì)胞為皮膚或口腔內(nèi)黏膜或牙齦的上皮細(xì)胞，更進(jìn)一步優(yōu)選地，為未成熟的上皮前體細(xì)胞，例如能夠分化成皮膚或黏膜等已分化的、例如角化或角化不全的上皮細(xì)胞的非角化上皮細(xì)胞或其干細(xì)胞等。使用口腔內(nèi)上皮細(xì)胞或其原代培養(yǎng)細(xì)胞作為上皮細(xì)胞的例子被記載于日本特開2008-29756號(hào)公報(bào)，將其全部的公開內(nèi)容以引用方式并入本說明書中。此外，從利用自體組織的角度來說，優(yōu)選的是使用來自移植對(duì)象的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞或含有這些細(xì)胞的組織。
[0068]用于制作再生毛囊原基的間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、色素干細(xì)胞、或者包含這些細(xì)胞的組織，可以從如靈長(zhǎng)類（例如人、猴子等）、有蹄類（例如豬、牛、馬等）、小型哺乳類如嚙齒類（例如小鼠、大鼠、兔子等）等哺乳動(dòng)物中進(jìn)行采集、也可以從犬和貓等各種其它哺乳動(dòng)物中進(jìn)行采集。間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、色素干細(xì)胞或含有這些細(xì)胞的組織的采集，應(yīng)當(dāng)直接使用通常采集組織所使用的條件，在無菌條件下提取并保存在合適的保存液即可。
[0069]通過例如根據(jù)已從周圍組織分離的毛囊的形狀，首先將其分離成間葉組織和上皮組織，來制備來自毛囊的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
[0070]進(jìn)一步，在制備來自毛囊的色素干細(xì)胞時(shí)，例如當(dāng)分離包含黑色素母細(xì)胞的次級(jí)隆突區(qū)域時(shí)，在顯微鏡觀察下，以皮脂腺和豎毛肌作為標(biāo)記物，可以將其作為鄰接隆突區(qū)域的恒定區(qū)域的最下端而分離。另外，當(dāng)分離包含黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞的毛母基底部時(shí)，在顯微鏡觀察下，以毛乳頭的毛球部作為標(biāo)記物，可以從Auber氏線下方的可變區(qū)域的最下端將它分離。此外，當(dāng)使用來自動(dòng)物的細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞作為材料時(shí)，其中在所述來自動(dòng)物的細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞中導(dǎo)入了在作為黑 色素母細(xì)胞的標(biāo)記物的Dct啟動(dòng)子（promoter)下并入GFP的基因，可以從經(jīng)由酶處理而單一化的細(xì)胞中，進(jìn)一步用細(xì)胞分類器（cell sorter)分離/取得黑色素母細(xì)胞。而且，當(dāng)從組織中分離間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、次級(jí)隆突區(qū)域和毛母基底部等時(shí)，可使用酶來促進(jìn)分離。作為所述酶，例如可以提及分散酶（Dispase)、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等已知的酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇使用適合的酶。。
[0071]進(jìn)一步，包含從毛囊分離的間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、或色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體，在被用于制作再生毛囊原基前，優(yōu)選地，通過細(xì)胞分離用過濾器，對(duì)其進(jìn)行單一化處理。單一化處理是指使細(xì)胞間的附著解離以賦予它們流動(dòng)性，優(yōu)選的是進(jìn)行這種處理，因?yàn)檫@種處理能夠使添加的細(xì)胞均勻混合，而且，在制作再生毛囊原基時(shí)能夠用微量移液管(micropipette)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作。所述細(xì)胞分離用過濾器并沒有特別限定，只要它能夠?qū)g葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、或色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體從其他組織和其他細(xì)胞分離開即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對(duì)待采集的每個(gè)細(xì)胞而適當(dāng)?shù)剡x擇細(xì)胞分離用過濾器的孔徑，例如可以使用具有40 μ m至100 μ m的孔徑的過濾器。
[0072]本發(fā)明的細(xì)胞凝集塊是指來自間葉組織或上皮組織的細(xì)胞的凝集、包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞群的凝集、或者包含來自間葉組織或上皮組織的細(xì)胞和色素干細(xì)胞的細(xì)胞群的凝集等?？梢酝ㄟ^例如凝集由將間葉組織、上皮組織、或包含色素干細(xì)胞的區(qū)域分散為離散細(xì)胞而得到的細(xì)胞，或者凝集由對(duì)這樣的細(xì)胞的原代培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)而得到的細(xì)胞，來制備這樣的細(xì)胞凝集塊。[0073]為了使細(xì)胞分散，可以使用如分散酶、膠原蛋白酶、胰蛋白酶等酶。為了得到足夠的細(xì)胞數(shù)，在制備細(xì)胞凝集塊之前，對(duì)分散的細(xì)胞進(jìn)行原代或繼代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基可使用通常動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM) 等。為了促進(jìn)細(xì)胞增殖可添加血清，或血清替代物，例如FGF、EGF、PDGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)鐵蛋白等已知的血清成分。此外，在添加血清時(shí)，可根據(jù)添加時(shí)的培養(yǎng)狀態(tài)而適當(dāng)?shù)馗淖儩舛?，通?？稍O(shè)定為10%左右。細(xì)胞的培養(yǎng)可采用通常的培養(yǎng)條件，例如在溫度約為37°C， CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步，還可以適當(dāng)?shù)靥砑渔溍顾氐瓤股?。[0074]為了使細(xì)胞凝集，例如可以將細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心處理。在間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊中，為了確保二者在緊密地接觸時(shí)，細(xì)胞彼此確實(shí)發(fā)生相互作用，優(yōu)選所述細(xì)胞各自為高密度的狀態(tài)。高密度的狀態(tài)是指具有與構(gòu)成組織時(shí)相同密度的程度，例如為 5X IO7個(gè)細(xì)胞/ml-I X IO9個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選的是I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml-I X IO9個(gè)細(xì)胞/ml，最優(yōu)選的是2X IO8個(gè)細(xì)胞/ml-8X IO8個(gè)細(xì)胞/ml。獲得高密度的細(xì)胞凝集塊的方法并未受到特別限定，例如可以通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心處理，然后使其凝集沉淀的方法來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的是進(jìn)行離心處理，因?yàn)樗粫?huì)損及細(xì)胞的活性，并且能夠容易地實(shí)現(xiàn)高密度。離心處理可以在提供300Xg-1200Xg的離心力的轉(zhuǎn)速下，優(yōu)選的是在提供500Xg-1000Xg的離心力的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行3分鐘-10分鐘。在低于300Xg的離心處理中，會(huì)有無法使細(xì)胞密度達(dá)到足夠高的傾向，另一方面，在高于1200Xg的離心處理中，則細(xì)胞可能會(huì)受到損傷。[0075]通過離心分離制備高密度細(xì)胞凝集塊時(shí)，通常先在用作細(xì)胞離心分離的試管等容器內(nèi)配制好細(xì)胞懸浮液，然后再進(jìn)行離心。離心分離之后，將細(xì)胞以沉淀物的形式留下，并將上清液盡量除去。此時(shí)，優(yōu)選地，目標(biāo)細(xì)胞以外的成分（例如培養(yǎng)液、緩沖液等）小于等于細(xì)胞的量，最優(yōu)選的是不含目標(biāo)細(xì)胞以外的成分。這樣的高密度的細(xì)胞集合體只要通過后述方法在支持載體內(nèi)進(jìn)行緊密地接觸，即可使細(xì)胞彼此緊密接觸并有效地發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用。[0076]進(jìn)一步，包含間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞、與色素干細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊，可以通過例如如上述的離心分離處理來制備，具體地，制備包含分別以優(yōu)選比例被含有的間葉細(xì)胞或上皮細(xì)胞與色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體，并將該細(xì)胞集合體并入將要用于離心分離的細(xì)胞懸浮液中，然后對(duì)該細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心分離處理，以制造混入色素干細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊。[0077]以培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞集合體為目的所使用的所述支持載體并未受到特別限定， 只要可以在其內(nèi)部進(jìn)行所述細(xì)胞培養(yǎng)即可，例如優(yōu)選的是凝膠狀、纖維狀、固體狀的支持載體。通過使用該支持載體，可進(jìn)一步防止對(duì)活體內(nèi)的再生毛囊原基施加過度的壓力。[0078]本發(fā)明所使用的支持載體可以是例如膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、Cell Matrix (商品名)、Mebiol Ge l (商品名)、Matrigel (商品名)、彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)混合物、聚羥基乙酸（PGA)、聚乳酸（PLA)、乳酸 /羥基乙酸共聚物（PLGA)等。其中，優(yōu)選的是具有適當(dāng)硬度和保持力的膠原蛋白、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素、明膠、瓊脂、水凝膠、Ce 11 Matr i x、Meb i ο I Gel、Matr i ge I、細(xì)胞外基質(zhì)混合物、彈性蛋白、纖維蛋白、層粘連蛋白。
[0079]例如，可使用液態(tài)的支持載體，于其中配置由第I和第2細(xì)胞集合體所構(gòu)成的再生毛囊原基后再將其固化。例如通過在培養(yǎng)皿上制備膠原蛋白凝膠液滴，并將所述再生毛囊原基置于所述膠原蛋白液滴內(nèi)，然后在37°C的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，可使膠原蛋白凝膠化。
[0080]以培養(yǎng)第I和第2細(xì)胞集合體為目的所使用的支持載體，優(yōu)選具有不使細(xì)胞分散，而能夠保持細(xì)胞集合體緊密接觸狀態(tài)的保持力。緊密接觸狀態(tài)是指上述高密度的間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞集合體，即使是在間葉細(xì)胞與上皮細(xì)胞的接觸面附近也維持相同程度的高密度的狀態(tài)。能夠保持緊密接觸狀態(tài)的支持載體，可以是例如在使用膠原蛋白時(shí)，通過使用最終濃度為2mg/ml-3mg/ml的膠原蛋白，來提供適當(dāng)?shù)挠捕?亦即通過以JIS-K6503-1996為基準(zhǔn)的方法（用12. 7mm直徑的柱塞壓下4mm所需要的荷重來進(jìn)行測(cè)定）測(cè)得的凝膠強(qiáng)度為120g-250g的濃度。其他種類的支持載體，只要通過同樣的評(píng)估方法測(cè)得具有相似的強(qiáng)度，也可作為本發(fā)明的支持載體優(yōu)選使用。另外，通過將I種或多種支持載體混合，也可得到硬度相當(dāng)于目標(biāo)凝膠強(qiáng)度的支持載體。
[0081]將第I和第2細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)的方法并未受到特別限定，當(dāng)細(xì)胞集合體為細(xì)胞凝集塊時(shí)，例如可將上述離心分離所得到的沉淀物用微量注射器等插入支持載體內(nèi)進(jìn)行配置。當(dāng)細(xì)胞集合體為組織時(shí)，可使用注射器的針尖等將其配置于支持載體內(nèi)的任意位置上。
[0082]在本發(fā)明中，使第I與第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)緊密接觸地進(jìn)行配置的方法并未受到特別限定。例如可通過先將其中一種細(xì)胞集合體配置于支持載體內(nèi)，然后以對(duì)其按壓的方式配置另一種細(xì)胞集合體，從而使兩者緊密接觸(密著)。具體地，在支持載體中，通過適當(dāng)?shù)馗淖兩鲜鲎⑸淦鞯尼樇馕恢?，可以將其中一種細(xì)胞集合體按壓至另一種細(xì)胞集合體上。此外，當(dāng)所述細(xì)胞集合體采用上皮組織或間葉組織時(shí)，優(yōu)選地，通過使該組織在原本的器官（包括屬于該器官的組織）中分別與間葉組織或上皮組織接觸的面與另一方細(xì)胞集合體接觸的方式進(jìn)行配置。
[0083]另外，優(yōu)選的是，在配置所述細(xì)胞集合體后，包括固化支持載體的步驟。這樣能夠使細(xì)胞進(jìn)一步凝集而達(dá)到更高密度的狀態(tài)。例如在使用膠原蛋白凝膠時(shí)，可通過在培養(yǎng)溫度下靜置數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘進(jìn)行固化。此時(shí)在細(xì)胞集合體內(nèi)，細(xì)胞以外的成分越少，則越能夠?qū)崿F(xiàn)高密度的狀態(tài)。
[0084]培養(yǎng)時(shí)間隨著配置于支持載體內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞集合體的狀態(tài)、培養(yǎng)的條件、動(dòng)物種類等而有所不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。
[0085]通過延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可進(jìn)一步促進(jìn)再生器官原基的形成。為了得到所期望的狀態(tài)，例如可以培養(yǎng)I天以上、2天以上、6天以上、30天以上、50天以上、100天以上、或300天以上，可以在培養(yǎng)過程中改變培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。
[0086]例如在移植再生毛囊原基時(shí)，為了得到功能性的毛發(fā)，對(duì)所述再生毛囊原基，優(yōu)選地，培養(yǎng)至少I天，更優(yōu)選地，培養(yǎng)2天以上。
[0087]對(duì)于支持載體內(nèi)部的培養(yǎng)步驟，可對(duì)內(nèi)部包含第I和第2細(xì)胞集合體的支持載體單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)，也可在其他動(dòng)物細(xì)胞等的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0088]當(dāng)單獨(dú)培養(yǎng)支持載體時(shí)，培養(yǎng)條件可以使用通常用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的條件。另外，在培養(yǎng)中還可添加來自哺乳動(dòng)物的血清，此外還可添加已知對(duì)這些細(xì)胞的增殖或分化有效的各種細(xì)胞因子。這樣的細(xì)胞因子的例子包括FGF、BMP等。[0089]從對(duì)細(xì)胞集合體進(jìn)行氣體交換或營(yíng)養(yǎng)供給的角度來看，以及不與其它動(dòng)物細(xì)胞接觸或混合、且全部的步驟都能夠在活體外進(jìn)行這樣的角度來看，優(yōu)選地，在支持載體內(nèi)部進(jìn)行培養(yǎng)是器官培養(yǎng)。器官培養(yǎng)一般是使多孔性的膜浮在適合使動(dòng)物細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基上， 再將內(nèi)含第I和第2細(xì)胞集合體的支持載體裝載在該膜上進(jìn)行培養(yǎng)。此處所使用的多孔性的膜優(yōu)選具有多個(gè)約O. 3-5μηι的孔,例如可以為Cell Culture Insert(商品名）或 Isopore Filter (商品名）。[0090]另外，根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，在將所述第I和第2細(xì)胞集合體在支持載體內(nèi)以緊密接觸的方式配置后或在培養(yǎng)后，可以將導(dǎo)引器插入所述第I與第2細(xì)胞集合體所構(gòu)成的再生毛囊原基。[0091]將本發(fā)明中可使用的“導(dǎo)引器”插入至由器官培養(yǎng)所構(gòu)筑的培養(yǎng)中的再生毛囊原基，從而在再生毛囊原基移植后，促進(jìn)再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)部分與受體側(cè)的上皮細(xì)胞之間的連接。所述可使用的導(dǎo)引器并未受到特別限制，只要具有上述效果即可。例如可以為由尼龍等聚合物或合成的或天然的生物可吸收的聚合物所制造出的纖維、不銹鋼等金屬纖維、碳纖維、玻璃纖維等化學(xué)纖維、以及天然的動(dòng)物纖維或植物纖維等。更具體地，例如可以為尼龍線或不銹鋼線等。尤其是在再生毛囊原基中，可以將來自活體的毛發(fā)作為導(dǎo)引器使用。進(jìn)一步，本發(fā)明所使用的導(dǎo)引器可以具有中空絲線的形狀。所述導(dǎo)引器的直徑可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如所述直徑優(yōu)選為5-100 μ m，更優(yōu)選為20-50 μ m。此外， 用于再生毛囊原基的導(dǎo)引器長(zhǎng)度亦可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。例如所述長(zhǎng)度優(yōu)選為 I-IOmm,更優(yōu)選為 4_6mm。[0092]所述導(dǎo)引器的插入，是以不破壞再生毛囊原基的結(jié)構(gòu)，尤其是不破壞第I細(xì)胞集合體與第2細(xì)胞集合體的接觸面，且以垂直貫穿第I細(xì)胞集合體與第2細(xì)胞集合體的方式， 從成為再生毛囊原基的細(xì)胞集合體的上皮細(xì)胞側(cè)插入。[0093]另外，導(dǎo)引器可在器官培養(yǎng)開始后立即插入至成為再生毛囊原基的細(xì)胞集合體中，亦即將上皮細(xì)胞與間葉細(xì)胞配置于培養(yǎng)基內(nèi)之后立即插入。當(dāng)開始培養(yǎng)一段時(shí)間后將導(dǎo)引器插入時(shí)，由于再生毛囊原基的上皮細(xì)胞的強(qiáng)度因器官培養(yǎng)的細(xì)胞附著而增加，因此可以通過使用強(qiáng)度大的材料的導(dǎo)引器（例如使用不銹鋼線等）以及將導(dǎo)引器的前端變銳利等來增加導(dǎo)引器穿透力，使其可在培養(yǎng)開始后第1-2天插入。優(yōu)選地，在制造好器官原基后立即將導(dǎo)引器插入，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候能夠使用尼龍線等對(duì)活體造成的異物應(yīng)答性低的柔韌材料。進(jìn)一步，培養(yǎng)開始一段時(shí)間后再插入導(dǎo)引器也是優(yōu)選的，因?yàn)檫@時(shí)第I細(xì)胞集合體與第 2細(xì)胞集合體之間的接觸面更為堅(jiān)固地附著，不會(huì)因?qū)б鞯牟迦攵茐慕佑|面。[0094]進(jìn)一步，在再生毛囊原基中插入導(dǎo)引器之后，可在插入導(dǎo)引器的狀態(tài)下培養(yǎng)再生毛囊原基。導(dǎo)引器插入后的培養(yǎng)時(shí)間，例如優(yōu)選為1-4天，更優(yōu)選為I. 5-2天。導(dǎo)引器插入后，通過進(jìn)行2天的培養(yǎng)，導(dǎo)引器與再生毛囊原基之間的附著變強(qiáng)，從而有助于防止在移植時(shí)容易發(fā)生的偏差。另外，優(yōu)選地，在導(dǎo)引器插入后進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)檫@樣可以使再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)的部分沿著導(dǎo)引器伸長(zhǎng)。在進(jìn)行再生毛囊原基移植后，這樣的伸長(zhǎng)能夠提高再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)的部分與受體的上皮細(xì)胞之間的自 主附著效率和穩(wěn)定性。[0095]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的制造方法所制作的移植用再生毛囊原基是能夠在移植后再生的毛囊內(nèi)形成功能性黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕的再生毛囊原基。與天然毛囊相似，該黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕是在次級(jí)隆突區(qū)域的外毛根鞘中形成。在此，功能性黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕是指在構(gòu)成該龕的部分中，具有維持黑色素母細(xì)胞的功能且具有分化/提供黑色素細(xì)胞的功能的干細(xì)胞龕。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述移植用再生毛囊原基，能夠再生包含功能性黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕的毛囊，因此所述毛囊能夠永久地形成有色毛發(fā)。
[0096]另外，根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，提供了將由本發(fā)明的制造方法所制作的毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基移植到作為對(duì)象的部位的方法。
[0097]通過移植由本發(fā)明的制造方法所制作的毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基，能夠在移植部位得到毛發(fā)顏色受控制的毛發(fā)的生長(zhǎng)。尤其是即使由來自成體的毛囊再構(gòu)建再生毛囊原基時(shí)，通過再生毛囊原基的移植，也可以在移植部位得到有色毛發(fā)。
[0098]可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，將毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基移植至對(duì)象部位。例如可使用Shapiro毛發(fā)移植術(shù)或Choi式毛發(fā)移植設(shè)備的毛發(fā)移植，或利用空氣壓力的植入機(jī)等進(jìn)行移植。Shapiro毛發(fā)移植術(shù)是一種在移植部位用微手術(shù)刀等制造出移植創(chuàng)口之后，使用鑷子鉗進(jìn)行移植的方法。在應(yīng)用這種毛發(fā)移植術(shù)時(shí)，由于移植用再生毛囊原基具有導(dǎo)引器，因此可以不需要直接接觸再生毛囊原基來進(jìn)行操作，所以能夠很容易地進(jìn)行所述操作。
[0099]再生毛囊原基的移植深度，例如優(yōu)選地為0.05-5mm,更優(yōu)選地為O. I-Imm,最優(yōu)選地為O. 3-0. 5mm。當(dāng)向受體內(nèi)移植再生毛囊原基時(shí)，優(yōu)選的是將其移植至真皮層內(nèi)，更優(yōu)選的是移植至真皮和皮下組織的交界面的上方，在該處毛囊的形成以及隨后的毛發(fā)生長(zhǎng)效率更優(yōu)異。移植時(shí)，優(yōu)選以使再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)面向受體的體表面?zhèn)?，且使再生毛囊原基的間葉細(xì)胞側(cè)面向受體的體內(nèi)側(cè)的方式，對(duì)再生毛囊原基進(jìn)行移植，因?yàn)檫@樣能夠控制毛發(fā)生長(zhǎng)方向朝向體表面?zhèn)取Ａ硗?，?yōu)選地，調(diào)節(jié)移植深度以使再生毛囊原基的上皮細(xì)胞部分的上端部露出于移植創(chuàng)口的上端，因?yàn)檫@樣能夠進(jìn)一步提高與受體的上皮細(xì)胞的連續(xù)性。
[0100]此外，將具有導(dǎo)引器的再生毛囊原基移植后，利用皮膚接合用的膠帶或帶子等將導(dǎo)引器固定到對(duì)象部位，從而使所述導(dǎo)引器不會(huì)脫落。
[0101]移植再生毛囊原基后，所述導(dǎo)引器在確保受體側(cè)的上皮細(xì)胞與來自再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)的連續(xù)性一段時(shí)間后，可從移植部位拔除。拔除導(dǎo)引器的時(shí)機(jī)可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，例如優(yōu)選地，在移植后3天-7天將所述導(dǎo)引器從移植部位拔除。或者可放置到導(dǎo)引器自然地從移植部位脫落為止?？梢詫⒂缮锟晌招圆牧蠘?gòu)成的導(dǎo)引器放置到從移植部位自然脫落、或直到分解或被吸收為止。
[0102]用這樣的方式，通過對(duì)移植用再生毛囊原基配備以導(dǎo)引器，使受體側(cè)側(cè)的上皮細(xì)胞沿著導(dǎo)引器往移植部位的內(nèi)側(cè)延伸從而排除異物，另一方面，可使來自再生毛囊原基的上皮細(xì)胞的細(xì)胞沿著導(dǎo)引器伸長(zhǎng)。從而，可提高移植后的受體側(cè)的上皮細(xì)胞與再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)之間的連續(xù)性。另外，優(yōu)選的是插入導(dǎo)引器，因?yàn)檫@樣在培養(yǎng)時(shí)，在再生毛囊原基中，可以提升上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞的極性維持。因此，可以提高毛囊形成的效率，而且能夠促進(jìn)移植時(shí)的方向的定位。尤其是在再生毛囊原基中使用導(dǎo)引器時(shí)，由于能夠確保再生毛囊原基與受體側(cè)的上皮細(xì)胞的連續(xù)性，可以向預(yù)期的方向促進(jìn)毛囊的形成。結(jié)果可以提高再生毛囊原基的毛發(fā)生長(zhǎng)率，而且還可控制毛發(fā)生長(zhǎng)的方向。[0103]此外，在本說明書中所使用的述語，是為了說明這里所描述的特定的實(shí)施方案，而并沒有試圖限制本發(fā)明。[0104]另外，在本說明書之中所使用的“包含/包括/含有”這一術(shù)語，除了根據(jù)上下文應(yīng)該作明顯不同的理解的情況以外，是指存在所記載的事項(xiàng)（部件、步驟、要素、數(shù)字等）， 且不排除存在其它的事項(xiàng)（部件、步驟、要素、數(shù)字等）。[0105]除非提供不同的定義，這里所使用的全部的術(shù)語（包括技術(shù)術(shù)語及科學(xué)術(shù)語）都與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員所廣泛理解的意思是一樣的。這里所使用的術(shù)語，只要沒有明示出不同的定義，應(yīng)解釋為與本說明書及相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】中一致的意思，不應(yīng)該被理想化，或者解釋為過度形式化的意思。[0106]本發(fā)明的實(shí)施方案會(huì)有參照示意圖而同時(shí)說明的情形，在這種情況下，為了能清楚地進(jìn)行說明，示意圖可能會(huì)被夸張地描繪。[0107]使用第一、第二等術(shù)語是為了描述各種要素，應(yīng)該理解這些要素并不被這些術(shù)語所限定。使用這些術(shù)語僅是為了將一種要素與其他要素區(qū)別開，例如由第一要素標(biāo)識(shí)的要素也可以記作第二要素，同樣的，可將第二要素記作第一要素，這樣也未超出本發(fā)明的范圍。[0108]此外，本說明書中，關(guān)于在毛囊中的“上方（上)”或“下方/下面/底部”的表達(dá)， 為了方便起見，在毛囊的結(jié)構(gòu)中，“下方/下面/底部”是指其中存在毛乳頭的部分，而“上方”是指毛囊中毛乳頭的相反側(cè)，亦即毛發(fā)生長(zhǎng)/伸長(zhǎng)的方向。[0109]以下參照實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。然而，本發(fā)明可以通過各個(gè)方面而具體化，不應(yīng)被理解為被限定于這里所記載的實(shí)施例。[0110]實(shí)施例[0111]I.材料與方法[0112](I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[0113]從7-8 周齡的 C57BL/6 小鼠（日本 CLEA)及 C57BL/6 6-TgN(act_EGFP)小鼠中采集毛囊。另外，通過下述實(shí)驗(yàn)方法，將所制作的再生毛囊原基移植至6-8周齡的Balb/c nu/ nu小鼠（SLC)。動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)遵守相關(guān)法規(guī)、行政法規(guī)和規(guī)章，在東京理科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行實(shí)施。[0114](2)毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)[0115]通過頸椎脫白使7-8周齡的C57BL/6小鼠安樂死后，以不傷及毛球部的方式采集頰部皮膚全層及皮下組織。在除去頰須周圍的皮下組織后，將毛囊分離。從分離的毛囊中選擇出成長(zhǎng)期為I-IV期的頰須毛囊，使用25G注射針從所選的頰須毛囊中去除膠原蛋白鞘，使毛囊露出。接著，從露出的毛囊中分離出毛球以摘出毛乳頭。在操作過程中，作為用于保存分離的毛囊和摘出的毛乳頭的 保存溶液，使用含有IOmM的HEPES、10%胎牛血清、和 I %青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基（DMEMlO)。分離的毛乳頭接種至3. 5cm塑料培養(yǎng)皿（日本Becton Dickinson公司)在5%C02、37°C、濕度為％%的環(huán)境下，在含有10ng/ml 的FGF2(和光純藥公司）的DMEMlO中進(jìn)行原代培養(yǎng)。在原代培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞的第4天和第8天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)9天后，將原代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞用于制作再生毛囊原基。培養(yǎng)9 天后的原代培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞用PBS (-)洗凈3次后，用含有0.05%胰蛋白酶的IOmM EDTA溶液（GIBCO)剝離，以DMEMlO中和胰蛋白酶，在充分洗滌之后，在冰溫下保存至使用時(shí)。
[0116](3)毛囊隆突上皮細(xì)胞的獲得
[0117]使用25G注射針從上述（2)中分離的頰須組織的毛囊中去除膠原蛋白鞘，以分離隆突區(qū)域。在37°C使隆突區(qū)域組織在最終濃度4. 8U/ml的分散酶II (Becton Dickson)和100U/ml的膠原蛋白酶（Worthington, Lakewood, NJ)溶液中反應(yīng)4分鐘,然后使用25G注射針以外科方式將所述隆突區(qū)域組織分離成隆突區(qū)域上皮組織和隆突周圍的間葉組織。對(duì)于所分離的隆突區(qū)域上皮組織在培養(yǎng)箱用0.05%胰蛋白酶（Invitrogen, Carlsbad, US)進(jìn)行I小時(shí)酶處理，并使其通過35 μ m孔的細(xì)胞過濾器，以獲得單一化的細(xì)胞。
[0118]進(jìn)一步，在制作再生毛囊原基之前，將培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞用0.05% T蛋白酶(Invitrogen, Carlsbad, US)進(jìn)行采集,然后使其通過35 μ m孔的細(xì)胞過濾器，以獲得單一化的細(xì)胞。
[0119](4)再生毛囊原基的制作
[0120]再生毛囊原基是依照器官原基法而制作。詳細(xì)的步驟如下：將上述所獲得的單一化的隆突區(qū)域細(xì)胞和單一化的培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，分別移到涂布有硅脂（siliconegrease)的L 5ml微型離心管（Eppendorf)，然后進(jìn)行進(jìn)離心分離。為了采集因離心分離而淀的單一化的隆突區(qū)域細(xì)胞或單一化的培養(yǎng)的乳頭細(xì)胞，使用O. 5ml-20ml的GELoaderTip (Eppendorf)將離心后的培養(yǎng)液中的上清液完全除去。接下來，通過在涂布娃脂(Dow Corning Toray)的培養(yǎng)皿上滴入 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka,Japan) 30ml,來制造膠原蛋白凝膠液滴。使用O. Ι-lOml的微量移液器（Quality Scientificplastics)將約O. 2ml的上述制備出的培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞注入膠原蛋白凝膠液滴，來制造細(xì)胞凝集塊。接下來，使用O. Iml-IOml的微量移液器(Quality Scientific plastics)將約O. 2ml的上述制備出的隆突區(qū)域細(xì)胞注入到相同的凝膠液滴內(nèi)，從而使其與培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞的凝集塊緊密接觸，以制造培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞和隆突區(qū)域細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊。進(jìn)一步，從細(xì)胞凝集塊的隆突區(qū)域細(xì) 胞插入全長(zhǎng)5mm的尼龍線（松田醫(yī)科工業(yè)）。隨后將所述凝膠液滴在37°C靜置5分鐘以使其固化，從而使隆突區(qū)域細(xì)胞與培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞的結(jié)合更加堅(jiān)固，以制作再生毛囊原基。
[0121]如以下（5)和（6)所述，制備次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞和毛母基底細(xì)胞，以用于制作再生
毛囊原基。
[0122](5)次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞的制備
[0123]使用與上述（3)中獲得隆突區(qū)域相同的步驟，從7-8周齡的C57BL/6小鼠頰須的毛囊中分離出香腸環(huán)（ringwurst)附著部位上方的恒定區(qū)域,將鄰接隆突區(qū)域的恒定部最下端作為次級(jí)隆突區(qū)域進(jìn)行分離。隨后通過酶處理和使用細(xì)胞分離用過濾器，獲得了單一化的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞。
[0124](6)毛母基底部細(xì)胞的制備
[0125]從上述（2)中分離的7至8周齡的C57BL/6小鼠頰須組織的毛囊的毛球中除去膠原蛋白鞘與真皮毛根鞘，從而使用25G注射針將鄰接于毛乳頭的底部的毛母基底部組織分離。將分離的毛母基底部組織用O. 25%胰蛋白酶在37°C處理10分鐘，用DMEMlO洗滌，然后使其通過35 μ m孔的細(xì)胞過濾器，以獲得單一化的毛母基底部細(xì)胞。
[0126]在以上（4)所述的再生毛囊原基的制作法中，將單一化的隆突區(qū)域細(xì)胞通過離心分離進(jìn)行濃縮時(shí)，將上述（5)或（6)所得的約400個(gè)單一化的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞或約400 個(gè)單一化的毛母基底部細(xì)胞與約10，000個(gè)隆突區(qū)域上皮細(xì)胞混合，然后進(jìn)行離心分離，從而制作包含單一化的次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞或單一化的毛母基底部細(xì)胞和單一化的隆突區(qū)域細(xì)胞的細(xì)胞凝集塊。將用這種方法得到的細(xì)胞凝集塊代替隆突區(qū)域細(xì)胞，以使其與在凝膠滴內(nèi)的培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞的凝集塊上部緊密接觸的方式注入凝膠液滴。從而獲得作為次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞添加組或毛母基底部細(xì)胞添加組的再生毛囊原基。[0127]將通過上述之方法在凝膠中制作的各再生毛囊原基連同膠原蛋白凝膠一起移至 O. 4ml 孔大小的 Cell Culture Insert (Becton Dickinson 公司）上，該 Cell Culture Insert設(shè)置有6孔板（Becton Dickinson公司),將Iml DMEMlO加入該6孔板中，然后在 37°C、5%C02和95%的濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)2天。[0128](8)再生毛囊原基的裸小鼠皮內(nèi)移植[0129]依照常規(guī)的方法對(duì)裸小鼠進(jìn)行戊巴比妥麻醉，對(duì)背部進(jìn)行聚碘（isodine)消毒之后，使其成自然橫躺的姿勢(shì)。使用V字矛型微手術(shù)刀（日本Alcon)對(duì)小鼠進(jìn)行穿刺，以形成由皮膚表皮層至真皮層下層部的移植創(chuàng)口。移植創(chuàng)口在垂直方向從體表面伸至約400 μ m 的深度，在水平方向?yàn)榧s1_。從插入了由尼龍線制造的導(dǎo)引器的再生毛囊原基將膠原蛋白凝膠除去，以上皮細(xì)胞成分朝向移植創(chuàng)口的體表側(cè)的方式，將再生毛囊原基插入。調(diào)節(jié)移植深度，以使再生毛囊原基的上皮細(xì)胞成分的上端部露出移植創(chuàng)口上端部，并以使由尼龍線制造的導(dǎo)引器露出體表的方式放置再生毛囊原基。用免縫膠帶（Steritest Strip;3M)將尼龍線導(dǎo)引器固定在接近移植創(chuàng)口的皮膚表面，然后用保護(hù)絆創(chuàng)膏（Nurseban)和手術(shù)膠帶（Surgical Tape) (3M)保護(hù)移植創(chuàng)口。在移植后5_7天將保護(hù)膠帶除去，以肉眼或熒光立體顯微鏡確定移植體的附著后，觀察移植位點(diǎn)隨時(shí)間的變化。[0130](9)毛發(fā)生長(zhǎng)過程的觀察和組織學(xué)的分析[0131]用肉眼和熒光立體顯微鏡觀察再生毛囊原基的移植部位，并評(píng)估毛發(fā)生長(zhǎng)狀況。[0132]2.結(jié)果[0133](I)通過再生毛囊原基的皮內(nèi)移植而再生的體毛與胡須的毛發(fā)顏色[0134]通過來自有色小鼠的成體小鼠頰須的隆突區(qū)域和來自有色小鼠的成體小鼠頰須的的毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基的移植而再生的胡須有95. 5%的頻率為白色（圖 2a)。如圖I所示，已知通過在毛干中的黑色素沉積來控制毛發(fā)顏色的色素干細(xì)胞分布在隆突區(qū)域下方的次級(jí)隆突區(qū)域。此外，黑色素細(xì)胞的前體細(xì)胞也分布在毛球的毛母基底部，并在毛母中分化成黑色素細(xì)胞以使毛干有色。來自成體頰須的再生毛囊原基局限于用不含黑色素母細(xì)胞的隆突區(qū)域，來構(gòu)筑再生毛囊原基，因此再生毛囊原基不具有黑色素母細(xì)胞，這表明因再生毛囊的毛母不含有分化而成的黑色素細(xì)胞，再生毛發(fā)可能變成白色。[0135](2)通過添加色素干細(xì)胞控制毛發(fā)顏色[0136]在小鼠成體頰須毛囊 中，從有色毛發(fā)黑色素母細(xì)胞存在的次級(jí)隆突區(qū)域以及分布有黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞的毛母基底部區(qū)域分別獲得單一化的細(xì)胞，然后將所述單一化的細(xì)胞添加到構(gòu)成再生毛囊原基的細(xì)胞集合體，以檢驗(yàn)是否對(duì)再生毛發(fā)的毛發(fā)顏色造成影響。 將再生毛囊原基進(jìn)行皮內(nèi)移植后3周后，分析生長(zhǎng)的毛發(fā)的毛干的顏色與性狀，在次級(jí)隆突添加區(qū)域或毛母基底部細(xì)胞的兩個(gè)區(qū)中，都成功得到了黑色的再生毛發(fā)（圖2b的黑色箭頭標(biāo)記和圖2c)。[0137]在此，為了確認(rèn)在由再生毛囊原基再生的形成黑色毛發(fā)的毛囊中，是否與天然毛囊類似地形成了黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕，進(jìn)行了作為黑色素母細(xì)胞的分化譜系標(biāo)記物的多巴色素互變異構(gòu)酶（dopachrome tautomerase ：Dct)的原位雜交。結(jié)果，在來自再生毛囊原基的形成黑色毛發(fā)的毛囊中，其中所述再生毛囊原基是通過向來自有色成體小鼠頰須的隆突區(qū)域和毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞集合體中添加次級(jí)隆突區(qū)域的單一化細(xì)胞而制作的，與天然毛囊類似地，在作為黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕應(yīng)該存在的位置的次級(jí)隆突區(qū)域的外毛根鞘檢測(cè)出黑色素母細(xì)胞。這證明了由通過添加次級(jí)隆突區(qū)域的單一化細(xì)胞所制作的再生毛囊原基所再生的毛囊，形成了黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕且適當(dāng)?shù)氐乇４媪撕谏啬讣?xì)胞。另一方面，在由來自有色成體小鼠頰須的隆突區(qū)域和毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基所再生的形成白色毛發(fā)的毛囊中，在應(yīng)該存在黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕的位置沒有檢測(cè)出黑色素母細(xì)胞（圖3)。
[0138]另外，對(duì)取決于是否添加次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞或毛母基底部細(xì)胞的毛發(fā)顏色變化的頻率進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果，在次級(jí)隆突區(qū)域細(xì)胞添加組中，65. 4%的毛發(fā)是有色的，黑色毛發(fā)的比率比單獨(dú)使用隆突區(qū)域細(xì)胞作為上皮細(xì)胞的對(duì)照組高14. 5倍（圖4)。類似地，在毛母基底部細(xì)胞添加組中，31. 6%毛發(fā)為黑色，黑色毛發(fā)的比率比單獨(dú)使用隆突區(qū)域細(xì)胞的對(duì)照組高7. O倍（圖4)。此外，當(dāng)對(duì)通過添加毛母基底部細(xì)胞所制作的再生毛囊原基所生長(zhǎng)的毛發(fā)進(jìn)行采集，然后在掃描電子顯微鏡下分析毛干的表面形態(tài)時(shí)，觀察到與天然毛發(fā)類似，其角質(zhì)層結(jié)構(gòu)已發(fā)育（圖5)。
[0139]在此，為了確認(rèn)在產(chǎn)生黑色毛發(fā)的再生的毛囊中，黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕是否能再現(xiàn)干細(xì)胞的維持功能，從而使毛囊可永久地形成黑色毛發(fā)，觀察了移植了很長(zhǎng)時(shí)間后的再生的毛囊中的黑色毛發(fā)形成能力。作為用于觀察的再生毛囊原基，使用通過向來自有色成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞，添加來自毛母基底部區(qū)域的單一化細(xì)胞所制作的再生毛囊原基（毛母基底部添加區(qū)）。另外，作為對(duì)照區(qū)，觀察了通過移植由來自有色成體小鼠頰須的隆突區(qū)域上皮細(xì)胞與來自成體小鼠頰須的毛乳頭細(xì)胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊。
[0140]結(jié)果，在毛母基底部 添加區(qū)中，在再生毛囊原基移植后第36天和第306天，確認(rèn)了黑色毛發(fā)的形成（圖6)。本試驗(yàn)中，在由再生毛囊原基所形成的毛囊中，一個(gè)毛發(fā)周期平均持續(xù)約15天，因此確認(rèn)平均約20次重復(fù)形成黑色毛發(fā)。另一方面，對(duì)照區(qū)中，即使在移植后第306天，仍只確認(rèn)到白色毛發(fā)的形成。
[0141]由上述結(jié)果證明了，通過向于再生毛囊原基中添加包含黑色素母細(xì)胞或黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞的區(qū)域的細(xì)胞，可以控制毛發(fā)顏色。另外，還證明了由通過添加色素干細(xì)胞所制作的再生毛囊原基而產(chǎn)生的有色毛發(fā)具有正常形態(tài)的毛干。
[0142]進(jìn)一步，證明了由通過添加色素干細(xì)胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊，能夠在該毛囊內(nèi)再生黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕。此外，證明了由通過添加色素干細(xì)胞所制作的再生毛囊原基而再生的毛囊能夠永久地維持有色毛發(fā)的形成。這證明了在再生毛囊內(nèi)的黑色素母細(xì)胞的干細(xì)胞龕中，能夠長(zhǎng)時(shí)間地維持黑色素母細(xì)胞，以及證明了能夠再現(xiàn)毛囊的生理功能，從而向毛母基提供黑色素細(xì)胞毛母。
【權(quán)利要求】
1.移植用再生毛囊原基的制造方法，其中，移植后生長(zhǎng)的毛發(fā)的顏色受控制，所述方法包括：制備包含間葉細(xì)胞的第I細(xì)胞集合體的步驟；制備包含上皮細(xì)胞的第2細(xì)胞集合體的步驟；制備包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的步驟；使所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體中的至少一方與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的步驟；以及接下來，使其中至少一方已與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體結(jié)合的所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第I細(xì)胞集合體實(shí)質(zhì)上由間葉細(xì)胞構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述第2細(xì)胞集合體實(shí)質(zhì)上由上皮細(xì)胞構(gòu)成。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體經(jīng)過單一化處理。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述色素干細(xì)胞是來自次級(jí)隆突區(qū)域的黑色素母細(xì)胞或來自毛母基底部的黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述色素干細(xì)胞是來自毛母基底部的黑色素細(xì)胞前體細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在使所述細(xì)胞集合體彼此結(jié)合的步驟中，所述第I細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)或所述第2細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)，與所述包含色素干細(xì)胞的細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)的比例在O. I :1至100 :1的范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在使所述第I細(xì)胞集合體與所述第2細(xì)胞集合體緊密接觸，并在支持體內(nèi)部培養(yǎng)它們的步驟中，所述第I細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)與所述第2細(xì)胞集合體的細(xì)胞數(shù)的比例在O. 3 :1至I :1的范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間葉細(xì)胞為毛乳頭細(xì)胞或真皮毛根鞘細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述上皮細(xì)胞為隆突區(qū)域上皮細(xì)胞或毛母基底部上皮細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間葉細(xì)胞或所述上皮細(xì)胞來自成體的毛囊。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法進(jìn)一步包括在所述再生毛囊原基中插入導(dǎo)引器的步驟。
13.包含毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的組合物，所述毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基由權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法所制作。
14.毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述方法包括將由權(quán)利要求 1-12中任一項(xiàng)所述的方法所制作的移植用再生毛囊原基移植到作為對(duì)象的部位的步驟。
15.毛發(fā)顏色受控制的移植用再生毛囊原基的移植方法，所述方法包括將由權(quán)利要求 12所述的方法所制作的移植用再生毛囊原基移植到作為對(duì)象的部位的步驟，其中，通過使所述導(dǎo)引器維持在突出于移植部位的狀態(tài)，使移植的再生毛囊原基的上皮細(xì)胞側(cè)的部分與所述對(duì)象的上皮細(xì)胞沿著所述導(dǎo)引器伸長(zhǎng)并連接。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103502440SQ201280010080
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月24日
【發(fā)明者】豊島公榮, 辻孝 申請(qǐng)人:株式會(huì)社器官再生工學(xué)