使用內(nèi)部對(duì)照定量人類dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的一種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中，（i）對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座（MCL），其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ?ID?NO.1的序列具有至少80%的序列同一性，并且所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同染色體上具有拷貝，（ii）也對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照（IC）添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以及（iii）測(cè)定來自于所述第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
【專利說明】使用內(nèi)部對(duì)照定量人類DNA的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、診斷學(xué)領(lǐng)域，更具體來說屬于分析和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明還屬于核酸擴(kuò)增和定量領(lǐng)域，更具體來說屬于DNA定量領(lǐng)域。
[0002]此外，DNA污跡中不同貢獻(xiàn)者的存在的早期評(píng)估，通常是調(diào)查期間非常重要的信息部分。在這種情況下，由于多個(gè)貢獻(xiàn)者的干擾，STR分析將引起困難。
[0003]混合樣品的具體實(shí)例是含有女性和男性DNA混合物的性侵犯污跡。男性:女性DNA比例的準(zhǔn)確測(cè)定幫助選擇最適的下游STR分析。在可獲得的罪犯DNA的量非常低的情形中，可以執(zhí)行針對(duì)專一存在于Y染色體上的遺傳元件的特定類型的STR分析，從而排除女性貢獻(xiàn)物的干擾。
【背景技術(shù)】
[0004]從法醫(yī)樣品以及其他樣品回收的DNA的量的測(cè)定，不僅在總體DNA分型方法中，而且在各種其他科學(xué)領(lǐng)域中的DNA檢測(cè)中，都是關(guān)鍵的步驟。為了使用例如多重DNA分型試劑盒產(chǎn)生最優(yōu)結(jié)果，通常需要0.5至2ng的狹窄的輸入DNA范圍。因此，為了確保陽性結(jié)果確實(shí)是陽性結(jié)果，和/或陰性結(jié)果確實(shí)是由不存在DNA造成的陰性結(jié)果，DNA的定量是絕對(duì)重要的。此外，用于法醫(yī)DNA測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，需要人類特異性DNA定量。這是由于分離技術(shù)可能回收人類DNA以及細(xì)菌和其他外源DNA。為了對(duì)人類特異性DNA進(jìn)行定量，已經(jīng)開發(fā)了許多程序步驟，包括起始印跡(start-blot)技術(shù)、基于液體的雜交測(cè)定法和實(shí)時(shí)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))。目前，實(shí)時(shí)PCR由于其寬的動(dòng)態(tài)范圍并易于自動(dòng)化，是主導(dǎo)技術(shù)。
[0005]現(xiàn)代STR試劑盒已變得越來越靈敏，即使在使用少量DNA時(shí)也能獲得良好結(jié)果。因此，對(duì)于即使在低度濃縮的`樣品中也允許精確和準(zhǔn)確定量人類DNA的方法、試劑盒和核酸區(qū)域，存在著需求。已經(jīng)有ー些定量和檢測(cè)試劑盒可用，然而它們具有嚴(yán)重缺點(diǎn)。一種這樣的試劑盒是Quantifiler Human試劑盒(Applied Biosystems),另ー種試劑盒是Quantifiler Duo 試劑盒(Applied Biosystems),另一種試劑盒是 Plexor HY 實(shí)時(shí) PCR 定量試劑盒(Promega)。Quantifiler Duo試劑盒和Plexor HY試劑盒兩者祀向基因組上的常染色體和性染色體(Y染色體)靶點(diǎn)。
[0006]試劑盒的缺點(diǎn):根據(jù)LaSalle 等，(Forensic ScienceInternational:Genetics, “通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析，，(Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNA Quantification byReal-Time Polymerase Chain Reaction)), Quantifiler 試劑盒在定量上更準(zhǔn)確，但是與Plexor HY相比具有較低的動(dòng)態(tài)范圍。Plexor HY由于擴(kuò)增多拷貝靶而提供更高的動(dòng)態(tài)范圍，但是具有較低準(zhǔn)確性。這種較低的準(zhǔn)確性可以歸因于多拷貝靶。如果對(duì)基因組上全套少于20個(gè)拷貝進(jìn)行擴(kuò)増，由于例如靶拷貝數(shù)的不穩(wěn)定性，則常染色體與性染色體(Y)靶的擴(kuò)增之間的比率可能變化。Plexor HY試劑盒的動(dòng)態(tài)范圍略好于另ー試劑盒(LaSalle等，F(xiàn)orensic Science International:Genetics, “通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行DNA定量的單拷貝和多拷貝方法的分析”(Analysis of Single and Mult1-copy Methods for DNAQuantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction))。在統(tǒng)計(jì)學(xué)I:匕較中，LaSalle等證實(shí)了這兩種試劑盒之間的顯著差異。
[0007]法醫(yī)學(xué)中的另ー個(gè)重要參數(shù)是必須進(jìn)行分析的DNA的降解等級(jí)。由于Quantifiler Human和Plexor HY試劑盒的擴(kuò)增子大小在62至133個(gè)堿基對(duì)(bp)之間變化，因此當(dāng)將試劑盒應(yīng)用于降解的DNA時(shí)，預(yù)計(jì)可能出現(xiàn)顯著差異。此外，抑制劑必須被考慮在內(nèi)。有可能反應(yīng)中存在DNA，但由于抑制性物質(zhì)的存在而沒有獲得結(jié)果。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明解決了上面認(rèn)識(shí)到的問題，并提供了下面概述的解決方案。
[0010]本發(fā)明涉及用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的ー種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中，(a)對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座(MCL)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.1的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同染色體上具有拷貝，(b)也對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以及(c)測(cè)定來自于所述第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。[0011]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增所述第一核酸(MCL)的引物和引物對(duì)。
[0012]此外，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增所述第二核酸(IC)的引物和引物對(duì)。
[0013]此外，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增所述第三核酸(MCL-Y)的引物和引物對(duì)。
[0014]它們可以在試劑盒中。因此，本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和/或定量人類核酸的試劑盒。
[0015]在本文中，所述第一核酸是在下面更詳細(xì)概述的多拷貝基因座，并且通常被稱為“MCL”。
[0016]在本文中，所述第二核酸是在下面更詳細(xì)概述的內(nèi)部對(duì)照，并且通常被稱為“1C”。
[0017]在本文中，所述第三核酸是在下面更詳細(xì)概述的Y染色體上的多拷貝基因座，并且通常被稱為“MCL-Y”。
[0018]發(fā)明詳述
[0019]正如上面概述的，人類DNA的定量和檢測(cè)是困難的。通常，抑制性物質(zhì)產(chǎn)生PCR陰性結(jié)果，即使在樣品中實(shí)際存在足夠量的用于擴(kuò)增的DNA。
[0020]本發(fā)明解決了這個(gè)問題。它涉及一種用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的ー種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中，Ca)對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座(MCL)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.1的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同染色體上具有拷貝，(b)也對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)増，以及(C)測(cè)定來自于所述第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
[0021]令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于核酸檢測(cè)和/或定量時(shí)，不是重復(fù)元件的多拷貝基因座優(yōu)于其他基因座。眾所周知，重復(fù)元件的拷貝數(shù)在不同個(gè)體之間可能不同。一般來說，這些核酸可以具有任何來源，原核或真核等。優(yōu)選地，它們是哺乳類動(dòng)物的，更優(yōu)選地為人類的。這是因?yàn)楸景l(fā)明的ー個(gè)極大優(yōu)點(diǎn)是它在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0022]一種這樣的序列標(biāo)出在SEQ ID N0.1中。本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，這ー序列和/或與其具有序列相似性的序列可以在人類基因組中被多次發(fā)現(xiàn)。
[0023]分布在整個(gè)基因組中的序列不都是完全同一的。重要的是所選引物也結(jié)合于幾乎同一的序列。因此，理想情況下，基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上與SEQ ID N0.1的序列具有至少60%、70%、80%、90%或甚至95%或98%的序列同一性。
[0024]兩個(gè)序列之間的同一‘丨生百分?jǐn)?shù)的確定使用Karlin和Altschul的數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1993)90:5873-5877)。這樣的算法是 Altschul 等(J.Mol.Biol.(1990)215:403-410)的 BLASTN 和 BLASTP 程序的基礎(chǔ)。使用 BLASTN 程序，分值=100，字長=12來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與SEQ ID N0.1同源的核苷酸序列。為了獲得用于比較目的的帶間隙的比對(duì),如 Altschul 等(Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)所述使用帶間隙的BLAST。當(dāng)使用BLAST和帶間隙的BLAST程序吋，使用相應(yīng)程序的缺省參數(shù)。
[0025]本發(fā)明的ー個(gè)方面是對(duì)多個(gè)拷貝進(jìn)行擴(kuò)増。理想情況下，擴(kuò)增各個(gè)染色體上的至少 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 個(gè)拷貝。SEQ ID N0.1或與其非常相似的序列在人類基因組中出現(xiàn)29次。這不僅是令人吃驚地，而且為本發(fā)明的方法提供了能力。此外，拷貝可以在各個(gè)染色體例如1、4、5、7、11、16號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)。
[0026]重要的是應(yīng)該指出，如本文所定義的類似于SEQ ID N0.1的序列和/或如本文所定義的類似于SEQ ID N0.15的序列可用于本發(fā)明的方法。下面為使用SEQ ID N0.1序列的方法所概述的優(yōu)選實(shí)施方式，全都同樣適用于SEQ ID N0.15序列。優(yōu)選情況下,它們ー起使用在ー種方法中。
[0027]Y染色體上的多拷貝基因座:
[0028]令人吃驚的是，本發(fā)明人還已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于核酸檢測(cè)和/或定量吋，由于可以提高反應(yīng)的靈敏度，因此Y染色體上的多 拷貝基因座優(yōu)于其他基因座。這是因?yàn)楸景l(fā)明的ー個(gè)極大優(yōu)點(diǎn)是它在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0029]一種這樣的序列確定在SEQ ID N0.15中。本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，該序列和/或與其具有序列相似性的序列可以在Y染色體上被多次發(fā)現(xiàn)。
[0030]本發(fā)明還涉及用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的ー種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中，
[0031]a.對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中Y染色體上的多拷貝基因座(MCL)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.15的序列具有至少80%的序列同一,I"生，
[0032]b.也對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照(IC)添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)增，
[0033]c.測(cè)定來自于第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
[0034]分布在整個(gè)Y染色體中的序列不都是完全同一的。重要的是所選引物也結(jié)合于幾乎同一的序列。因此，理想情況下，基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段上與SEQ ID N0.15的序列具有至少60%、70%、80%、90%或甚至95%或98%的序列同一性。
[0035]性侵犯樣品的法醫(yī)學(xué)工作流程建議在進(jìn)行STR反應(yīng)之前對(duì)男性DNA進(jìn)行定量。這樣做首先是為了幫助決定必須使用何種STR試劑盒進(jìn)行遺傳分析，然后是為了確定從例如犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集的樣品獲得多少DNA，以及在STR反應(yīng)中應(yīng)該使用多少這樣的DNA。有不同的STR試劑盒可用，典型的STR試劑盒檢測(cè)不同常染色體上的遺傳長度多態(tài)性，但是在某些情況下，例如使用性侵犯樣品時(shí)，專門在Y染色體上進(jìn)行長度多態(tài)性分析可能是有利的，因?yàn)榕訢NA不具有Y染色體。
[0036]典型的STR反應(yīng)在一定的模板DNA范圍內(nèi)工作最佳，并且整個(gè)分析勞動(dòng)密集性非常高，因此需要在STR分析中確保非常高的成功率的方法學(xué)。因此，如果定量試劑盒能夠使用戶不僅明確鑒定存在的DNA的量，而且能夠評(píng)估抑制劑的不存在，將是真正的優(yōu)勢(shì)，其中所述抑制劑可能損害STR反應(yīng)的結(jié)果，可能引起有價(jià)值的樣品材料的失效或損失，所述有價(jià)值的樣品材料在觀察到嚴(yán)重抑制的情況下可以被進(jìn)ー步純化。
[0037]理想情況下，第三核酸(MCL-Y)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在60個(gè)堿基對(duì)至200個(gè)堿基對(duì)之間、80至300個(gè)堿基對(duì)之間、100至200個(gè)堿基對(duì)之間或120至180個(gè)堿基對(duì)之間。
[0038]在優(yōu)選實(shí)施方式中，第三核酸(MCL-Y)的長度約為130個(gè)堿基對(duì)(+/_20%)。
[0039]本發(fā)明的ー個(gè)特點(diǎn)是用于檢測(cè)PCR抑制劑的新的內(nèi)部對(duì)照(1C)。IC與一種或多種特定靶在同一反應(yīng)管中平行地共同擴(kuò)增。IC被用于檢測(cè)反應(yīng)中的PCR抑制劑。因此，可以通過實(shí)時(shí)PCR中循環(huán)閾值的遷移來檢測(cè)的IC抑制，是反應(yīng)中存在一定量PCR抑制劑的標(biāo)
[0040]法醫(yī)學(xué)工作流程建議在進(jìn)行STR反應(yīng)之前對(duì)DNA進(jìn)行定量。這樣做是為了確定從例如犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集的樣品獲得多少DNA，以及在STR反應(yīng)中應(yīng)該使用多少這樣的DNA。典型的STR反應(yīng)在一定的模板DNA范圍內(nèi)工作最佳，并且整個(gè)分析勞動(dòng)密集性非常高，因此需要在STR分析中確保非常高的成功率的方法學(xué)。因此，如果定量試劑盒能夠使用戶不僅明確鑒定存在的DNA的量，而且能夠評(píng)估抑制劑的不存在，將是真正的優(yōu)勢(shì)，其中所述抑制劑可能損害STR反應(yīng)的結(jié)果，可能引起有價(jià)值的樣品材料的失效或損失，所述有價(jià)值的樣品材料在觀察到嚴(yán)重抑制的情況下可以被進(jìn)ー步純化。
[0041]在本發(fā)明中，所述IC的性質(zhì)是令人吃驚地，以至于使其適合于最新的法醫(yī)學(xué)流程，它不僅報(bào)告抑制劑的存在，而且還給出良好的定量結(jié)果，當(dāng)抑制劑以不重要的水平存在時(shí)在全部DNA濃度范圍內(nèi)提供穩(wěn)定的內(nèi)部對(duì)照Ct值，并且對(duì)于嚴(yán)重影響STR反應(yīng)的抑制劑具有高的關(guān)聯(lián)性水平。最近引入市場(chǎng)的ー些新一代STR試劑盒與以前引入的試劑盒相比表現(xiàn)出提高的抑制劑耐受性。通過提供1C，所述IC僅報(bào)告對(duì)隨后的STR反應(yīng)的成功來說重要的抑制水平，已對(duì)這些新的STR試劑盒進(jìn)行了進(jìn)ー步開發(fā)以提供對(duì)PCR抑制劑的更高的耐受性，其還提供了對(duì)DNA定量方法學(xué)的新要求。
[0042]本發(fā)明的IC帶有在樣品核酸中不存在的對(duì)照DNA序列，允許選擇僅僅特異性檢測(cè)IC的寡核苷酸引物和/或探針。
[0043]在優(yōu)選實(shí)施方式中，IC是帶有對(duì)照DNA序列的PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒?；蛘?，IC也可以是合成的長寡核苷酸(1ngmer)或質(zhì)粒或任何其他類型的載體。
[0044]在優(yōu)選實(shí)施方式中，也測(cè)定第二核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
[0045]擴(kuò)增方法是非等溫法或等溫法。
[0046]非等溫?cái)U(kuò)增方法可以選自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) (Saiki等(1985)Science230:1350)、定量實(shí)時(shí) PCR (rtPCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR) (Landegren 等(1988)Science241:1077-1080)。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增是優(yōu)選的。
[0047]等溫?cái)U(kuò)增方法可以選自解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA) (Vincent等(2004) EMBO rep5(8):795-800)、熱穩(wěn)定 HDA (tHDA) (An 等(2005) J Biol Chem280 (32): 28952-28958)、鏈置換擴(kuò)增(SDA) (Walker 等(1992) Nucleic Acids Res20 (7): 1691-6)、多重置換擴(kuò)增(MDA) (Dean 等(2002) Proc Natl Acad Sci USA99 (8): 5261-5266)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA) (Liu 等(1996) J Am Chem Socll8:1587-1594)、限制輔助的 RCA (Wang 等(2004)Genome Resl4:2357 - 2366)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA) (Dafforn 等(2004)Biotechniques37(5):854-7)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)(Vuorinen等(1995)J Clin Microbiol33:1856-1859)、切 ロ酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR) (Maples 等 US2009017453)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR) (Van Ness 等(2003)Proc Natl Acad Sci USA100(8): 4504-4509)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)(Notomi 等(2000)Nucleic Acids Res28 (12): e63)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA) (Pi印enburg 等(2006)PloS Biol4 (7): 1115-1120)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA) (Kievits 等(1991) J VirolMethods35:273-286),smart 擴(kuò)增法(SMAP) (Mitani 等(2007)Nat Methods4 (3):257_62)。
[0048]在本發(fā)明的文本中，“等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)”是指在反應(yīng)期間溫度不明顯變化。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在發(fā)生擴(kuò)增的主要酶反應(yīng)步驟期間，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度偏差不超過10°c，優(yōu)選不超過5°C，甚至更優(yōu)選不超過2V。
[0049]取決于核酸等溫?cái)U(kuò)增的方法，需要不同的酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用于核酸擴(kuò)增的已知等溫法是上面所提到的，其中用于在等溫條件下擴(kuò)增核酸的至少ー種嗜中溫酶選自解旋酶、嗜中溫聚合酶、具有鏈置換活性的嗜中溫聚合酶、切ロ酶、重組蛋白、連接酶、糖基化酶和/或核酸酶。
[0050]“解旋酶”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。它們是沿著核酸磷酸二酷骨架定向移動(dòng)，使用源自于NTP或dNTP水解的能量分離兩條退火的核酸鏈(例如DNA、RNA或RNA-DNA雜合體)的蛋白質(zhì)?；诖_定的解旋酶基序的存在，有可能將解旋酶活性歸于給定蛋白。專業(yè)技術(shù)人員能夠選擇適合于在本發(fā)明的方法中使用的具有解旋酶活性的酶。在優(yōu)選實(shí)施方式中，解旋酶選自來自于不同家族的解旋酶:解旋酶超家族I (例如dda、pcrA、F_質(zhì)粒tral蛋白解旋酶、uvrD)，解旋酶超家族II (例如recQ、NS3-解旋酶)，解旋酶超家族III (例如AAVrep解旋酶)，來自于DnaB樣超家族的解旋酶(例如17噬菌體解旋酶)或來自于Rho樣超家族的解旋酶。`
[0051]除了所需的酶之外，擴(kuò)增方法包含緩沖劑、dNTP或NTP。
[0052]當(dāng)在本文中使用吋，術(shù)語“dNTP”是指脫氧核糖核苷三磷酸。這樣的dNTP的非限制性實(shí)例是dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其也可以以標(biāo)記的衍生物，例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物的衍生物的形式存在。還涵蓋了具有修飾的核苷酸堿基的dNTP，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤核苷、7-甲基鳥苷、5，6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。此外，上面描述的分子的ddNTP也涵蓋在本發(fā)明中。
[0053]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“NTP”是指核糖核苷三磷酸。這樣的NTP的非限制性實(shí)例是ATP、GTP、CTP、TTP、UTP,其也可以以標(biāo)記的衍生物，例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物的衍生物的形式存在。
[0054]在優(yōu)選實(shí)施方式中，擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)，并且所測(cè)定的核酸的量，在擴(kuò)增過程期間測(cè)定或在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)作為終點(diǎn)測(cè)量值測(cè)定。
[0055]寡核苷酸引物可以使用任何適合的方法來制備，例如磷酸三酯和磷酸二酯法或其自動(dòng)化實(shí)施方式。在一種這樣的自動(dòng)化實(shí)施方式中，使用二乙基亞磷酰胺作為起始材料，其可以如 Beaucage 等(1981) Tetrahedron Letters22:1859-1862 所述來合成。用于在修飾的固相支持物上合成寡核苷酸的ー種方法描述在美國專利號(hào)4，458，006中。也可以使用從生物來源(例如限制性內(nèi)切酶消化物)分離的引物。優(yōu)選的引物具有約6-100個(gè)堿基、更優(yōu)選地約20-50個(gè)堿基、最優(yōu)選地約20-40個(gè)堿基的長度。
[0056]使用實(shí)時(shí)PCR的DNA定量
[0057]在PCR期間，DNA的量理論上隨著每個(gè)循環(huán)加倍。在每個(gè)循環(huán)之后，DNA的量是之前的兩倍。
[0058]未知樣品中DNA的絕對(duì)量?jī)?yōu)選地使用IC來確定。
[0059]使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，在實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀中檢測(cè)并測(cè)量熒光，并使用它對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物的指數(shù)增加的幾何增加來確定每個(gè)反應(yīng)中的循環(huán)閾值(CT )。
[0060]使用不同的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(CT值/交叉點(diǎn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品量的對(duì)數(shù)的圖)。將未知樣品的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，允許計(jì)算靶的初始量。重要的是為待定量核酸的類型選擇適合的標(biāo)準(zhǔn)品。為了產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)該對(duì)至少5種不同量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，并且未知靶的量應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。因此，在一種實(shí)施方式中，也執(zhí)行上述定量步驟。
[0061 ] 理想情況下，第一核酸(MCL)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在60個(gè)堿基對(duì)至200個(gè)堿基對(duì)之間，80至300個(gè)堿基對(duì)之間，100至200個(gè)堿基對(duì)之間，或120至180個(gè)堿基對(duì)之間。
[0062]此外，理想情況下，第二核酸(IC)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在60至400個(gè)堿基對(duì)之間，100至400個(gè)堿基對(duì)之間，80至300個(gè)堿基對(duì)之間或150至250個(gè)堿基對(duì)之間。
[0063]令人吃驚的是，已證 明，如果第二核酸(IC)的擴(kuò)增產(chǎn)物長于第一核酸(MCL)的擴(kuò)增產(chǎn)物，可能獲得更好的結(jié)果。
[0064]在優(yōu)選實(shí)施方式中，第一核酸(MCL)的長度約為140個(gè)堿基對(duì)(+/-20%)，第二核酸(IC)的長度約為200個(gè)堿基對(duì)(+/-20%)。
[0065]在優(yōu)選實(shí)施方式中，第三核酸(MCL-Y)的長度約為130個(gè)堿基對(duì)(+/_20%)。
[0066]理想情況下，擴(kuò)增反應(yīng)包含(i )pH在8至8.8之間(在20°C下)的Tris-HCl，和/或
(ii)選自氯化鉀和硫酸鉀的鉀鹽，和/或(iii)銨鹽，優(yōu)選為氯化銨或硫酸銨，和/或(vi)氯化鎂，和/或(V)熱啟動(dòng)聚合酶。
[0067]優(yōu)選地，Tris-HCl的濃度在10至IOOmM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地在20至70mM的范圍內(nèi)，K+的濃度在l_25mM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地在2.5至20mM的范圍內(nèi)，NH4+的濃度在I至40mM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地在2.5至30mM的范圍內(nèi)，Mg2+的濃度在比四種dNTP的濃度高0.5mM至8mM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地Mg2+的濃度比四種dNTP的濃度高0.7mM至5mM，熱啟動(dòng)聚合酶，其在優(yōu)先情況下為允許熱啟動(dòng)時(shí)間短于5分鐘，最優(yōu)選地短于2分鐘的熱啟動(dòng)聚合酶。
[0068]重要的是正確地選擇第二核酸的量。這種IC能夠確定反應(yīng)中是否存在DNA或者是否可能由于反應(yīng)中存在抑制劑這一事實(shí)而造成沒有獲得反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)通常具有5至100 ill之間，更優(yōu)選地7iil至75iil范圍內(nèi)，最優(yōu)選地10 ill至50 ill范圍內(nèi)，理想地15iil至25iil范圍內(nèi)的體積。
[0069]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，100至5000個(gè)之間的第二核酸(IC)拷貝是理想的。優(yōu)選地存在200至2000個(gè)之間的拷貝，更優(yōu)選地500至1500個(gè)之間的拷貝，最優(yōu)選地1000個(gè)拷貝(+/-20%)。以y g/ 為單位的量取決于核酸的大小/長度。優(yōu)選地，核酸是PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA。[0070]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增第一核酸(MCL)的引物，其選自:
[0071]a.5' -CCGGGAAGCAGAAGGTGG-3' (SEQ ID N0.12/4N-S1C Pr)
[0072]b.5 ' -Fam-CGAGCTCAGTTGTGCCTGTAGAGCTCG-dabcy1-C18-ACCTCTTCCTCTTGGCTGGG-3' (SEQIDN0.1l/4N-SlC)
[0073]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增第一核酸(MCL)的引物對(duì)，其由下列引物構(gòu)成:
[0074]c.5' -CCGGGAAGCAGAAGGTGG-3' (SEQ ID N0.12/4N-S1C Pr)
[0075]d.5 ' -Fam-CGAGCTCAGTTGTGCCTGTAGAGCTCG-dabcy1-C18-ACCTCTTCCTCTTGGCTGGG-3' (SEQIDN0.1l/4N-SlC)
[0076]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增第二核酸(IC)的引物，其選自:
[0077]e.5' -GCTATCCAGTGTGCCTAGGCAA-3' (SEQ ID N0.13/AT-1C_Rev.)
[0078]f.5' -YAK-TGGCGTAGTCGTTCAACGCCA/Dabcyl/HEG/CCACGAGCGTACTTCGACTGAA-3'(SEQ ID N0.14/AT-1C_Yak)
[0079]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增第二核酸(IC)的引物對(duì)，其由下列引物構(gòu)成:
[0080]g.5' -GCTATCCAGTGTGCCTAGGCAA-3' (SEQ ID N0.13/AT-1C_Rev.)
[0081]h.5' -YAK-TGGCGTAGTCGTTCAACGCCA/Dabcyl/HEG/CCACGAGCGTACTTCGACTGAA-3'(SEQ ID N0.14/AT-1C_Yak)
[0082]本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增第三核酸(MCL-Y)的引物，其選自:
[0083]a.5' -TGGCTGAGTTCCTCCACCTG-3' (SEQ ID N0.37 ；MCL-YPr)
[0084]b.5 ' -Quasar670-cgaccgtgaagcatgcgtttcggtcg-BHQ2-C18-agtgggagagctgggaa-3' (SEQ ID N0.38/MCL-Y Scorp)
[0085]注意，在本文中如上SEQ ID N0.38中描述蝎型引物(Scorp)的所有情形中，引物的引發(fā)部分是3’ -引發(fā)部分，并且在這樣的情形中，本發(fā)明優(yōu)選涉及該部分而不是探針部分kagtgggagagctgggaa-3')。
[0086]此外，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含在嚴(yán)緊條件下與在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.1的序列具有至少80%的序列同一性的序列結(jié)合的ー種或多種引物，以及嚴(yán)緊地結(jié)合第二核酸(IC)的至少ー種引物或探針，或包含上面概述的引物或引物對(duì)。
[0087]理想情況下，試劑盒具有至少ー種引物，其具有在18個(gè)核苷酸的區(qū)段內(nèi)與SEQ IDN0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12和/或SEQ ID N0.37和/或38的差異不超過5個(gè)核苷酸的核苷酸序列。理想情況下，試劑盒具有在18個(gè)核苷酸的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.2、3、5、6、
8、9、10、11和/或12和/或SEQ ID N0.37和/或38的差異不超過5個(gè)核苷酸的核苷酸序列?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0088]圖1
[0089]圖1通過最小化了的反應(yīng)時(shí)間證實(shí)了本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)?！?Qiagen InvestigatorQuantiplex”表示本發(fā)明范圍內(nèi)的方法的特定實(shí)施方式。第I列(從左起)示出了在Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí) PCR 儀器(Qiagen)上“Qiagen Investigator Quantiplex” 方法的運(yùn)行時(shí)間。第2列示出了在來自于Applied Biosystems的7500快速PCR系統(tǒng)上“QiagenInvestigator Quantiplex”方法的運(yùn)行時(shí)間。作為對(duì)比,第3列示出了在來自于AppliedBiosystems 的 7500 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于 Applied Biosystems 的 QuantifilerHuman試劑盒的運(yùn)行時(shí)間，第4列示出了在來自于Applied Biosystems的7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于Applied Biosystems的Quantifiler Duo試劑盒的運(yùn)行時(shí)間，第5列示出了在來自于Applied Biosystems的7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于Promega的Plexor HY試劑盒的運(yùn)行時(shí)間。
[0090]圖 2
[0091 ] 圖2示出了不同定量方法相對(duì)于理論濃度的準(zhǔn)確性的比較?！癚uantiplexInvestigator”表示本發(fā)明范圍內(nèi)的方法的特定實(shí)施方式。準(zhǔn)備可商購的定量試劑盒,并按照適合的手冊(cè)中所述進(jìn)行分析。使用濃度已知的人類參比DNA (從美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology, USA)獲得)的連續(xù)稀釋液作為所有三種試劑盒的模板?！癚uantiplex Investigator”方法對(duì)于將所有使用的模板量定量在其正確濃度來說，提供了最大誤差為20%的高準(zhǔn)確度，特別是對(duì)6.25pg/u I及以下的濃度來說，與使用單拷貝祀的Quantifiler Human方法(基于來自于Applied Biosystems的Quantifiler Human試劑盒)和使用以幾個(gè)拷貝存在的祀的Plexor HY方法(基于來自于Promega的Plexor HY試劑盒)相比，所述濃度能夠被更充分地定量，參考在描述中給出。Quantifiler Human方法(基于來自于Applied Biosystems 的 Quantifiler Human試劑盒，其使用單拷貝靶)對(duì)于等于和低于12.5pg/ u I的人類DNA顯示出高的波動(dòng)，或甚至不能產(chǎn)生定量結(jié)果。Plexor HY顯示出與理論定量結(jié)果的高的偏差。在每個(gè)反應(yīng)中使用2 iU人類參比DNA的給定稀釋液。濃度是指模板溶液中的濃度。NTC:無模板對(duì)照。
[0092]圖3
[0093]圖3示出了在來自于不同種族組的供體的基因組DNA樣品中，通過SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12檢測(cè)到的人類標(biāo)`志物的拷貝數(shù)沒有變化。運(yùn)行定量實(shí)時(shí)PCR以用來比較人類特異性單拷貝革G和Investigator Quantiplex多拷貝祀。對(duì)于不同人群示出了兩個(gè)革巴之間的ACT?？梢钥闯觯谒腥后w中ACT是恒定的，證實(shí)了通過SEQ ID N0.11和SEQIDN0.12檢測(cè)的區(qū)域具有恒定拷貝數(shù)。
[0094]圖4
[0095]圖4利用定量反應(yīng)后的STR分析示出了高靈敏度和正確定量(圖2中所示)的重要性。在圖4中，使用來自于圖2的人類DNA的連續(xù)稀釋液,按照Investigator ESSplex試劑盒(Qiagen)的流程來產(chǎn)生所示的STR分布圖。它演示了從甚至是圖2中使用的最低濃度獲得完整STR分布圖的可能性，演示了即使是在低模板量下仍可進(jìn)行高度準(zhǔn)確定量的有用性。
[0096]圖5
[0097]圖5示出了來自于文獻(xiàn)的關(guān)于AmpFlSTR Identiler反應(yīng)被高鐵血紅素抑制的數(shù)
據(jù)集。使用Identifiler (從下面指明的來源獲取-Quantifiler Human,第137頁)時(shí)，
DNA指紋反應(yīng)可以進(jìn)行直至高鐵血紅素濃度高達(dá)20 u M0
[0098]來源:http://www3.appliedbiosystems, com/cms/groups/applied marketssuDDort/documents/genera丄documents/cms 041395.pdf
[0099]圖6[0100]圖6示出了來自于文獻(xiàn)的關(guān)于AmpFlSTR NGM試劑盒的抑制的數(shù)據(jù)集。這是所謂的“下一代STR試劑盒”，其對(duì)抑制劑的存在具有高得多的耐受性，在下面的實(shí)施例中為高達(dá)75 ii M的高鐵血紅素。
[0101]來源:http://marketing, appliedbiosystems, com/images/All Newsletters/Forensic 0710/pdfs/Customer-Corner/nextGeneration.pdf
[0102]圖7
[0103]圖7示出了定量反應(yīng)中抑制劑靈敏度的實(shí)例。數(shù)據(jù)從商品化試劑盒QuantifilerHuman和Y的開發(fā)驗(yàn)證報(bào)告獲取。
[0104]數(shù)據(jù)可以在試劑盒供應(yīng)商的驗(yàn)證報(bào)告中獲得，其位于:
[0105]Quantifiler Human
[0106]http: //www3.appl iedbiosystems.com/cms / groups/appl ied_markets_support/documents/generaldocuments/cms_04l395.pdf
[0107]Quantifiler Duo
[0108]http://www.appliedbiosystems.com.br/site/material/5q7aqqbm.pdf
[0109]法醫(yī)學(xué)工作流程建 議在進(jìn)行STR反應(yīng)之前對(duì)DNA進(jìn)行定量。這樣做是為了確定從例如犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集的樣品獲得多少DNA，以及在STR反應(yīng)中應(yīng)該使用多少這樣的DNA。典型的STR反應(yīng)在一定的模板DNA范圍內(nèi)工作最佳，并且整個(gè)分析勞動(dòng)密集性非常高，因此需要在STR分析中確保非常高的成功率的方法學(xué)。因此，如果定量試劑盒能夠使用戶不僅明確鑒定存在的DNA的量，而且能夠評(píng)估抑制劑的不存在，將是真正的優(yōu)勢(shì)，其中所述抑制劑可能損害STR反應(yīng)的結(jié)果，可能引起有價(jià)值的樣品材料的失效或損失，所述有價(jià)值的樣品材料在觀察到嚴(yán)重抑制的情況下可以被進(jìn)ー步純化。
[0110]數(shù)據(jù)顯示,只有合并的Quantifiler Human和Y試劑盒顯示出內(nèi)部對(duì)照祀與人類靶相比略微更低的穩(wěn)定性。在這種情形中，當(dāng)DNA樣品中包含抑制劑時(shí)IC的Ct值向更高值遷移，而Human試劑盒和Y試劑盒的Ct值保持穩(wěn)定，至少對(duì)于較少量的高鐵血紅素來說如此。在Quantifiler Human和Y試劑盒的情形中，對(duì)抑制劑例如高鐵血紅素的耐受性相當(dāng)?shù)?在反應(yīng)中在1611|1至2011|1高鐵血紅素之間)。因此，缺少下一代STR試劑盒所需的與較高量抑制劑的耐受性相兼容的方法學(xué)。
[0111]圖8
[0112]圖8示出了定量反應(yīng)中抑制劑靈敏度的實(shí)例。數(shù)據(jù)從商品化試劑盒QuantifilerDuo的開發(fā)驗(yàn)證報(bào)告獲取。
[0113]數(shù)據(jù)可以在試劑盒供應(yīng)商的驗(yàn)證報(bào)告中獲得，其位于:
[0114]Quantifiler Duo
[0115]http://www.appliedbiosystems.com.br/site/material/5q/aqqbm.pdf
[0116]在抑制劑存在下，Quantifiler Duo試劑盒中的內(nèi)部對(duì)照系統(tǒng)比人類特異性革巴更穩(wěn)定。由于當(dāng)DNA定量已經(jīng)受損時(shí)內(nèi)部對(duì)照系統(tǒng)不給出樣品中抑制劑存在的任何指示，因此在這種情形中內(nèi)部對(duì)照系統(tǒng)的用處當(dāng)然較低。事實(shí)上，即使在少量抑制劑下，RPPHl和SRY系統(tǒng)的Ct值也向更高值遷移。在12.5 ii M高鐵血紅素存在下RPPHl系統(tǒng)的Ct值急劇増加至>40，使得人類DNA的定量變得不可能。
[0117]與新一代STR試劑盒相比，對(duì)樣品中抑制劑的存在的耐受性非常低(即10 PM高鐵血紅素和3.75ng/ u I腐殖酸)。
[0118]圖9
[0119]圖9示出了定量反應(yīng)中抑制劑靈敏度的實(shí)例。數(shù)據(jù)從商品化試劑盒Plexor HY的開發(fā)驗(yàn)證報(bào)告獲取。數(shù)據(jù)可以在試劑盒供應(yīng)商的驗(yàn)證報(bào)告中獲得，其位于:
[0120]Plexor HY
[0121]http://www.promega.com/p I exorhy/an 11) /.pdf
[0122]Plexor HY試劑盒顯示出內(nèi)部對(duì)照靶與人類靶相比十分相同的穩(wěn)定性，正如可以通過常染色體靶(上圖)和下圖中示出的內(nèi)部對(duì)照(IPC)的Ct向更高值的、可比的遷移所看出的。在這種情形中，當(dāng)DNA樣品中含有抑制劑吋，IC的Ct值向更高值遷移。當(dāng)樣品中含有抑制劑時(shí)，即使是人類特異性靶的Ct值也向更高值遷移，因此損害DNA定量。在Plexor HY的情形中，對(duì)抑制劑例如高鐵血紅素的耐受性相當(dāng)?shù)?在反應(yīng)中約為25 ii M高鐵血紅素)。
[0123]圖10
[0124]圖10示出了在給定濃度的PCR抑制劑腐殖酸和高鐵血紅素存在下，本發(fā)明范圍內(nèi)的反應(yīng)的結(jié)果。
[0125]通過使用本發(fā)明，可以獲得內(nèi)部對(duì)照對(duì)較高抑制劑濃度的高穩(wěn)定性、以及人類特異性靶的更高的穩(wěn)定性。這在即使是內(nèi)部對(duì)照被完全抑制時(shí)仍給出準(zhǔn)確定量。人類特異性靶的抑制開始于80至100 y M之間的高鉄血紅素濃度，其完美地適合于下一代STR試劑盒例如來自于 Applied Biosystems 的 AmpFlSTR NGM 或來自于 Qiagen 的 InvestigatorESSplex的抑制劑耐受性。
[0126]圖11
[0127]示出了序列表。
[0128]圖12
[0129]圖12示出了不同定量方法相對(duì)于理論濃度的準(zhǔn)確性的比較?！癚uantiplexInvestigator HYres”表示本發(fā)明范圍內(nèi)的方法的特定實(shí)施方式。準(zhǔn)備可商購的定量試劑盒，并按照適合的手冊(cè)中所述進(jìn)行分析。使用濃度已知的人類DNA (使用QIAampInvestigator從來自于匿名供體的人類血液分離)及其混合物的連續(xù)稀釋液，作為所有三種試劑盒的模板?！癚uantiplex Investigator HYres”方法對(duì)于將所有使用的模板量定量在其正確濃度來說提供了高準(zhǔn)確度，特別是對(duì)6.25pg/u I及以下的濃度來說，與使用單拷貝革巴的 Quantif iler DUO 方法(基于來自于 Applied Biosystems 的 Quantifiler DUO 試劑盒)和使用以幾個(gè)拷貝存在的革G的Plexor HY方法(基于來自于Promega的Plexor HY試劑盒)相比，所述濃度能夠被更充分地定量，參考在描述中給出。Quantifiler DUO方法(基于來自于Applied Biosystems的Quantifiler DUO試劑盒,其使用單拷貝革E)在等于和低于1.5pg/ u I人類DNA時(shí)顯示出高波動(dòng)或甚至不能產(chǎn)生定量結(jié)果，并且在女性DNA背景存在下不能定量低于1.5pg/ u I的男性DNA濃度。在背景女性DNA存在或不存在下，PlexorHY不能定量低于3pg/ u I的男性DNA級(jí)分。在每個(gè)反應(yīng)中使用2 U I人類參比DNA的給定稀釋液。濃度是指模板溶液中的濃度。
[0130]圖13 [0131]圖13利用定量反應(yīng)后的STR分析示出了高靈敏度和正確定量(圖12中所示)的重要性。在圖13中，使用來自于圖12的人類DNA的連續(xù)稀釋液,按照Investigator ESSplexPlus試劑盒(Qiagen)的流程來產(chǎn)生所示的STR分布圖。它演示了從甚至是圖12中使用的最低濃度獲得完整STR分布圖的可能性，演示了即使是在低模板量下仍可進(jìn)行高度準(zhǔn)確定量的有用性。
[0132]圖14
[0133]圖14通過最小化了的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)ー步證實(shí)了本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)?！癚iagenInvestigator Quantiplex HYres”表示本發(fā)明范圍內(nèi)的方法的特定實(shí)施方式。第I列(從左起)不出了在 Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí) PCR 儀器(QIAGEN)上“Qiagen Investigator QuantiplexHYres”方法的運(yùn)行時(shí)間。第2列示出了在來自于Applied Biosystems的7500PCR系統(tǒng)上“QIAGEN Investigator Quantiplex HYres”方法的運(yùn)行時(shí)間。作為對(duì)比，第3列示出了在Rotor-Gene Q 實(shí)時(shí) PCR 儀器(QIAGEN)上運(yùn)行的來自于 QIAGEN 的 QIAGEN InvestigatorQuantiplex試劑盒的運(yùn)行時(shí)間,第4列示出了在來自于Applied Biosystems的7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于QIAGEN的QIAGEN Investigator Quantiplex試劑盒的運(yùn)行時(shí)間，第5列示出了在來自于Applied Biosystems的7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于AppliedBiosystems的Quantifiler Human試劑盒的運(yùn)行時(shí)間，第6列示出了在來自于AppliedBiosystems 的 7500 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于 Applied Biosystems 的 QuantifilerDuo試劑盒的運(yùn)行時(shí)間，第7列示出了在來自于Applied Biosystems的7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上運(yùn)行的來自于Promega的Plexor HY試劑盒的運(yùn)行時(shí)間。[0134]圖15
[0135]圖15示出了使用本發(fā)明方法的結(jié)果。在存在給定濃度的PCR抑制劑腐殖酸和高鐵血紅素的情形下，應(yīng)用所述方法。
[0136]使用本發(fā)明可以獲得內(nèi)部對(duì)照對(duì)較高抑制劑濃度的高穩(wěn)定性、以及人類特異性靶的更高的穩(wěn)定性。這在即使是內(nèi)部對(duì)照被完全抑制的情況下也給出準(zhǔn)確定量。人類特異性靶的抑制開始于90至110 PM之間的高鉄血紅素濃度，其完美地適合于下一代STR試劑盒例如來自于 Applied Biosystems 的 AmpFlSTR NGM 或來自于 QIAGEN 的 InvestigatorESSplex的抑制劑耐受性。
[0137]圖16
[0138]圖16示出了 Y-MC序列，即Y染色體多拷貝序列。SEQ ID N0.15僅僅用作參比序列。也可以使用SEQ ID N0.15至35。正如上面概述的，所述方法也可以僅僅使用Y染色體序列。
實(shí)施例
[0139]人類DNA的定量是在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中建立STR反應(yīng)的必不可少的步驟。目前在市場(chǎng)上有許多不同試劑盒可用于定量 DNA (Quantifiler Human> Quantifiler Y、QuantifilerDuo、Plexor HY)，但是所有這些試劑盒具有不同缺點(diǎn)，例如在人類DNA上擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物短，對(duì)于降解的DNA不具有代表性，反應(yīng)耗時(shí)，所選的靶在不同群體或個(gè)體中不穩(wěn)定。
[0140]第一核酸的PCR產(chǎn)物為146bp。實(shí)現(xiàn)了 48分鐘的反應(yīng)時(shí)間。這不僅部分由于在8至9之間的pH范圍內(nèi)、含有NH4+、K+和Mg2+離子以及存在使用非化學(xué)熱啟動(dòng)方法例如抗體、適體或親合體(affibody)的快速熱啟動(dòng)酶時(shí)，PCR反應(yīng)化學(xué)迅速，而且特別是由于穩(wěn)定的多拷貝靶提供了更高的靈敏度和可靠性，又還組合使用不僅報(bào)告抑制劑存在還能給出良好的定量結(jié)果的內(nèi)部対照。該內(nèi)部對(duì)照在整個(gè)DNA濃度范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的Ct值。
[0141]首要的而且是最令人吃驚的結(jié)果是由本發(fā)明的組分造成的高反應(yīng)速度。以下因素的組合引起了該結(jié)果:由例如抗體、適體或親合體造成的快速非化學(xué)熱啟動(dòng)DNA聚合酶，含有NH4+、K+和Mg2+離子的反應(yīng)緩沖劑，以及優(yōu)選地也使用蝎型引物來檢測(cè)多拷貝靶。反應(yīng)在含有pH為8.0至8.8之間的Tris-HCl、優(yōu)選為氯化鉀或硫酸鉀的鉀鹽、優(yōu)選為氯化銨或硫酸銨的銨鹽、氯化鎂、每種dNTP、2.5U的指定熱穩(wěn)定DNA聚合酶和0.1 y M表1中給出的每種正向和反向引物的反應(yīng)緩沖劑中進(jìn)行。
[0142]表1序列
[0143]
【權(quán)利要求】
1.用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的ー種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中， a.對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中的多拷貝基因座(MCL)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.1的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述多拷貝基因座在至少兩個(gè)不同染色體上具有拷貝， b.還對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照(IC)添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)増， c.測(cè)定來自于所述第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中另外對(duì)第三核酸進(jìn)行擴(kuò)增，所述基因座是人類Y染色體上的多拷貝基因座(MCL-Y)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.15的序列具有至少80%的序列同一性， a.對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照添加的所述第三核酸進(jìn)行擴(kuò)増，以及 b.測(cè)定來自于所述第一核酸和第三核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中還測(cè)定所述第二核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
4.權(quán)利要求1至3的方法，其中擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)，并且所測(cè)定的核酸的量，在擴(kuò)增過程期間測(cè)定或在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)作為終點(diǎn)測(cè)量值測(cè)定。
5.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，其中所述第一核酸(MCL)和/或第三核酸(MCL-Y)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在60個(gè)堿基對(duì)至200個(gè)堿基對(duì)之間。
6.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，其中所述第二核酸(IC)的擴(kuò)增產(chǎn)物在60至400個(gè)堿基對(duì)之間。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第二核酸(IC)的擴(kuò)增產(chǎn)物在100至400個(gè)堿基對(duì)之間。
8.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，其中所述第二核酸(IC)的擴(kuò)增產(chǎn)物長于所述第一核酸(MCL)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求1至7的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含: a.pH 在 8 至 8.8 之間的 Tris-HCl, / 或， b.選自氯化鉀和硫酸鉀的鉀鹽，和/或， c.銨鹽，優(yōu)選為氯化銨或硫酸銨，和/或 d.氯化鎂，和/或 e.熱啟動(dòng)聚合酶。
10.前述權(quán)利要求任ー項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包含所述第二核酸(IC)的100至5000個(gè)之間的拷貝。
11.用于擴(kuò)增第一核酸(MCL)的引物，其選自
a.5' -CCGGGAAGCAGAAGGTGG-3' (SEQ ID N0.12/4N-S1C Pr)
b.5' -Fam-CGAGCTCAGTTGTGCCTGTAGAGCTCG-dabcy1-C18-ACCTCTTCCTCTTGGCTGGG-3'(SEQ ID N0.11/4N-S1C)。
12.用于擴(kuò)增第三核酸(Y-MCL)的引物，其選自
a.5' -TGGCTGAGTTCCTCCACCTG-3' (SEQ ID N0.37/MCL-Y Pr)
b.5 -Quasar6(0-cgaccgtgaagcatgcgtttcggtcg-BHQ2-C18-agtgggagagctgggaa-3'(SEQ ID N0.38/MCL-Y Scorp)。
13.用于擴(kuò)增第一核酸(MCL)的引物對(duì)，其由權(quán)利要求11的引物構(gòu)成。
14.用于擴(kuò)增第三核酸(Y-MCL)的引物對(duì)，其由權(quán)利要求12的引物構(gòu)成。
15.用于擴(kuò)增第二核酸(IC)的引物，其選自
a.5' -GCTATCCAGTGTGCCTAGGCAA-3 (SEQ ID N0.13/AT-1C_Rev.)
b.5 ' -YAK-TGGCGTAGTCGTTCAACGCCA/Dabcyl/HEG/CCACGAGCGTACTTCGACTGAA-3 (SEQID N0.14/AT-1C_Yak)。
16.用于擴(kuò)增第二核酸(IC)的引物對(duì)，其由權(quán)利要求15的引物構(gòu)成。
17.用于檢測(cè)和/或定量人類核酸的試劑盒，其中所述試劑盒包含在嚴(yán)緊條件下與在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.1的序列具有至少80%的序列同一性的序列結(jié)合的ー種或多種引物，以及嚴(yán)緊地結(jié)合所述第二核酸(IC)的至少ー種引物或探針，或包含權(quán)利要求11至16的引物或引物對(duì)，并任選地另外包含與SEQ ID N0.15 (MCL-Y)的序列嚴(yán)緊地結(jié)合的引物、引物對(duì)和/或探針。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述試劑盒中的至少ー種引物具有在18個(gè)核苷酸的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.2、3、5、6、8、9、10、11和/或12的差異不超過5個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
19.用于定量和/或檢測(cè)樣品中基因組的ー種或多種核酸的方法，其中在擴(kuò)增反應(yīng)中， a.對(duì)第一核酸進(jìn)行擴(kuò)增，被擴(kuò)增的基因座是基因組中Y染色體上的多拷貝基因座(MCL)，其中所述基因座在80個(gè)堿基對(duì)的區(qū)段內(nèi)與SEQ ID N0.15的序列具有至少80%的序列同一,I"生， b.還對(duì)作為內(nèi)部對(duì)照(IC)添加的第二核酸進(jìn)行擴(kuò)増，` c.測(cè)定來自于所述第一核酸的擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103534356SQ201280009884
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月21日
【發(fā)明者】弗蘭切斯卡·迪帕斯奎爾, 霍爾格·恩蓋爾, 薩沙·斯特勞布, 尼古拉·喬·瑟爾維爾 申請(qǐng)人:凱杰有限公司, 凱杰曼徹斯特有限公司