專利名稱：組織工程擬生態(tài)毛發(fā)毛囊移植物的制作方法
前言男性型禿發(fā)為常見的疾病狀態(tài)，其常常通過毛發(fā)移植手術(shù)治療。在此過程中，切下來自于不在禿發(fā)區(qū)域內(nèi)的頭皮區(qū)域的毛發(fā)毛囊并將其重新植入禿發(fā)區(qū)域內(nèi)以產(chǎn)生滿頭毛發(fā)的假象。此過程中無新的毛發(fā)產(chǎn)生。它的成功受可收獲的及重新植入禿發(fā)區(qū)域的毛發(fā)毛囊的數(shù)目的限制。此外，由于不是所有的移出毛發(fā)毛囊均可成功被移植，此技術(shù)，雖然是很普遍，但具有顯著的缺點(diǎn)。
眾所周知，在毛發(fā)毛囊內(nèi)亞結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞特異類型具有誘導(dǎo)形成完整的、正常功能的毛發(fā)毛囊的能力。這些細(xì)胞被稱為毛囊干細(xì)胞或者稱為毛囊祖細(xì)胞?？紤]到有效的毛發(fā)恢復(fù)治療的巨大市場，為了毛發(fā)增殖進(jìn)行了許多嘗試以探索這些細(xì)胞的毛囊誘導(dǎo)能力。盡管表面上科學(xué)可行，但在現(xiàn)有技術(shù)所公開的所有方案都被證實(shí)不能滿足對于禿頭提供臨床上及美容上可接受的新的治療的目的。例如，將來源于大鼠胡須(whisker)的培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞植入大鼠耳皮下，引起從植入位點(diǎn)生長出胡須。參見R.F. Oliver和C.A.B.Jahoda，1990年4月24日的美國專利4,919,664，“Stimulation of hair growth(毛發(fā)生長刺激)”，此處引入這些教導(dǎo)作為參考。在未公布的Andrew Messenger博士對5名人類志愿者的臨床研究中，毛發(fā)毛囊真皮乳頭細(xì)胞從志愿者的頭皮活組織中切下培養(yǎng)。細(xì)胞增殖并覆蓋培養(yǎng)瓶表面，通過從瓶表面刮除移去細(xì)胞，并植入在從中獲得細(xì)胞的每個受試者的前臂下面的皮膚的淺切口中。在細(xì)胞植入位點(diǎn)未觀察到新的毛發(fā)生長。6個月后活組織檢查所有的位點(diǎn)并且組織學(xué)發(fā)現(xiàn)為正常，無頭皮毛發(fā)毛囊形成的跡象。
最近，T.H.Barrows在2002年2月28日公開的國際公開WO02/15952，“Scaffolds for Tissue Engineered Hair(用于組織工程毛發(fā)的支架)”描述了在以生物可吸收的材料制成的多孔”支架”上植入同型培養(yǎng)細(xì)胞的方法，本文引入該公開的教導(dǎo)。在這案例的后續(xù)臨床研究產(chǎn)生了來自于培養(yǎng)細(xì)胞植入的在人類受試者皮膚中誘導(dǎo)新毛發(fā)毛囊和毛發(fā)生長的首個有文件記載的實(shí)例(見T.H.Barrows，S.A.Cochran，E.I.Griffin，和A.R.Solomon，″Tissue Engineered Human HairPreliminary ClinicalResults(組織工程人類毛發(fā)初步臨床結(jié)果)″，TE2002InternationalWorkshop on Tissue Engineering(組織工程國際研討會)，St.Gallen，Switzerland，24-27，2002，2月，此處引入該文獻(xiàn)的教導(dǎo)作為參考)。無固體支架結(jié)構(gòu)存在下注入細(xì)胞未表現(xiàn)出毛囊新生的跡象。但是，與支架結(jié)合的16個細(xì)胞移植中僅1個引起美容上有用的毛干的生長。盡管在大量細(xì)胞加支架的植入位點(diǎn)中，組織學(xué)上被注意到毛囊新生的不明確跡象，但是那里也有對部分降解的支架碎片殘留物的持續(xù)的炎癥反應(yīng)。此異體反應(yīng)類型被推定可產(chǎn)生毛發(fā)毛囊形成的有害環(huán)境(見K.S.Stenn，2002年4月17提交的美國專利申請10/123,984，"Compositions andmethods for inducing new hair follicle formation and hair growth in adesired orientation(朝所需方向誘導(dǎo)新毛發(fā)毛囊形成和毛發(fā)生長的組合物和方法)"，在此引入該申請的教導(dǎo))。
因此，仍需要可靠的及可重現(xiàn)的方法用于培養(yǎng)毛囊祖細(xì)胞并且植入培養(yǎng)細(xì)胞到皮膚中以產(chǎn)生新的、美容上有活力的毛發(fā)毛囊。
發(fā)明概述簡言之，本發(fā)明一方面是構(gòu)造成模仿天然毛發(fā)毛囊結(jié)構(gòu)的并設(shè)計(jì)用于經(jīng)皮植入的改進(jìn)支架。該植入物的一些部分可作為特異類型細(xì)胞接種的支持結(jié)構(gòu)，其它部分與表皮接觸或突出穿過表皮作為表皮向下生長的位點(diǎn)。這種向下生長對產(chǎn)生與被植入細(xì)胞聯(lián)系的漏斗是有益的，繼而對于控制新形成毛干的出口角度有幫助。
另一方面，本發(fā)明為特異的組合物的用途，及生產(chǎn)生物相容性與需要的生物可吸收的速率相結(jié)合的支架的制造方法。這些支架類型的性能特征在成功的毛囊誘導(dǎo)植入物的構(gòu)成中是非常重要的，便于或加強(qiáng)毛囊新生過程。
又一方面，本發(fā)明為培養(yǎng)的細(xì)胞的特異組合，其提供可靠的及可重現(xiàn)的毛囊新生的起始。單獨(dú)植入培養(yǎng)的真皮乳頭(也稱為毛囊乳頭)細(xì)胞得到不可預(yù)知的及非重復(fù)性的結(jié)果。已發(fā)現(xiàn)角質(zhì)化細(xì)胞，從新生皮膚(如嬰兒包皮組織)獲得的適當(dāng)?shù)慕琴|(zhì)化細(xì)胞，也必須與真皮乳頭細(xì)胞聯(lián)合植入。其它的細(xì)胞類型可任選與真皮乳頭/角質(zhì)化細(xì)胞組合聯(lián)合以提高毛囊新生的成功率。任選其它的細(xì)胞可選自已知存在于人胚胎、胎或嬰兒頭皮皮膚、嬰兒包皮、臍帶血液、成人的骨髓、肌肉、脂肪組織和皮膚中的干細(xì)胞群。
本發(fā)明又一方面為令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即軟骨素-6-硫酸酯可作為對毛囊新生過程提供有益效果或能加強(qiáng)毛囊新生過程的物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明為制造擬生態(tài)毛發(fā)毛囊移植物的方法，以及對其用細(xì)胞接種并將其植入需要有新毛干生長的皮膚的方法。
本發(fā)明一方面還是毛發(fā)增殖的方法，其中從收獲的毛囊處的細(xì)胞在培養(yǎng)中增殖，與培養(yǎng)的角質(zhì)化細(xì)胞或其它異源細(xì)胞聯(lián)合等分為大量生物可吸收的支架。產(chǎn)生的細(xì)胞接種的擬生態(tài)植入物的植入比現(xiàn)有技術(shù)的方法所可能達(dá)到的程度提供了較高程度的毛發(fā)恢復(fù)。因而，本發(fā)明的方法減少、抑制或治愈了脫發(fā)，特別包括但不限于男性或女性型禿發(fā)和其它脫發(fā)狀態(tài)。
附圖簡述

圖1為本發(fā)明的中空細(xì)絲的橫截面代表性的示意圖，顯示了生物可吸收的聚合物固體外部細(xì)絲(1)，相同或不同的生物可吸收的聚合物的多孔內(nèi)部細(xì)絲(2)及中間的管腔(3)。
圖2為圖1的中空細(xì)絲的橫截面代表性的示意圖，顯示細(xì)胞(4)(如角質(zhì)化細(xì)胞)，其通過芯吸細(xì)胞混懸液進(jìn)入所述細(xì)絲的管腔被接種到細(xì)絲的多孔內(nèi)層，及細(xì)胞團(tuán)(5)(如培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞或毛發(fā)毛囊斷片)，通過機(jī)械力使其進(jìn)入所述細(xì)絲的開口端被接種到細(xì)絲的管腔。
圖3為圖2的細(xì)絲植入皮膚后不久的橫截面代表性的示意圖，近側(cè)端(6)在真皮(7)中，遠(yuǎn)側(cè)端(8)被朝下生長的表皮所包圍。
圖4為由多孔的d，l-丙交酯和乙交酯(PLGA)共聚物制成的本發(fā)明的中空細(xì)絲的掃描電子顯微照片(SEM)。
圖5為通過切開小管顯露的圖4的中空細(xì)絲的多孔內(nèi)表面的SEM。
圖6為光學(xué)顯微照片，表示具有圖1所示構(gòu)成的細(xì)絲(10)，其中外部細(xì)絲(1)由固體PLGA制成，多孔內(nèi)部細(xì)絲由交聯(lián)透明質(zhì)酸(HAX)制成。圖6還表示了由不含HAX的PLGA制成的細(xì)絲(11)。兩種細(xì)絲均被放置于以食用色素染料染為紅色的水(12)滴上。僅有PLGA的纖維(11)浮于水(12)的頂部，并且沒有芯吸任何水進(jìn)入該纖維的管腔，相反，含有HAX的PLGA纖維(10)迅速芯吸所述水進(jìn)入管腔，使該纖維變?yōu)榧t色。
圖7(A)為小鼠鬣(胡須)毛囊(13)和具有足夠的內(nèi)部直徑尺寸容納切下的毛囊的PLGA中空細(xì)絲(14)的照片。
圖7(B)為在圖7(A)的PLGA中空細(xì)絲管腔中插入了毛囊(13)的照片。
圖8為小鼠胡須(15)的照片，觀察到植入含有PLGA中空細(xì)絲的鬣毛囊后30天，相對于再生長的剃過的鼠毛(16)，小鼠胡須生長于小鼠背部。
圖9為在植入來自新生小鼠皮膚的含有PLGA中空細(xì)絲(19)的細(xì)胞混合物后30天，生長于小鼠皮膚下的毛囊球(17)和毛干(18)的顯微照片。
圖10為并列的兩張相同放大倍數(shù)的切自裸鼠的皮膚下對比顯微照片，此裸鼠13天前被注射取自于新生黑小鼠表皮與真皮的細(xì)胞。插圖A顯示對照注射位，插圖B顯示含有同樣數(shù)目細(xì)胞的注射位置，除細(xì)胞之外注射液還含有5％(w/v)的軟骨素-6-硫酸酯，與對照相比產(chǎn)生較大且較多數(shù)量的新生毛發(fā)毛囊。
圖11也為并列的兩張相同放大倍數(shù)切自裸鼠的皮膚下的對比顯微照片，此裸鼠13天前被注射取自于新生黑小鼠表皮與真皮的細(xì)胞。插圖A顯示與圖10相同的對照注射位，插圖C顯示在同一只小鼠上含有同樣數(shù)目細(xì)胞的注射位置，除細(xì)胞之外注射液還含有20％(w/v)的PluronicTMF-127表面活性劑(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)，產(chǎn)生大于對照的新生毛發(fā)毛囊。
圖12為本發(fā)明的中空細(xì)絲的橫截面代表性的示意圖，其中管腔(20)輕微地逐漸變細(xì)至附著在多孔的填料(22)的閉合端(21)。
圖13為本發(fā)明的中空細(xì)絲的橫截面代表性的示意圖，顯示盛有細(xì)胞(24)和液體(25)的細(xì)移液管吸頭(23)被插入到逐漸變細(xì)的管腔(20)。
圖14為本發(fā)明的中空細(xì)絲的橫截面代表性的示意圖，顯示液體(25)和細(xì)胞(24)的混懸液經(jīng)從移液管吸頭(23)放出，該細(xì)胞積聚于管腔閉合端(21)并且液體(25)被多孔填料(22)充分吸收。
圖15為實(shí)施例10的中空細(xì)絲支架和10微升的移液管吸頭(26)的照片，此移液管吸頭與在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案的方法中用作心軸的移液管吸頭相同。鞘(27)由PLGA制成，包含在球端(29)的纖維塊(28)由交聯(lián)明膠/軟骨素-6-硫酸酯細(xì)絲制成。通過將移液管吸頭插入到支架鞘中將活性碳顆粒與水的漿注射入該支架，活性碳顆粒(30)集于纖維支架的近側(cè)部分。
定義本發(fā)明所用列于下面的術(shù)語具有下列意義“組織工程”定義為產(chǎn)生細(xì)胞聯(lián)合、生物相容性支架的領(lǐng)域，此生物相容性支架通常為生物可吸收支架，具有代替、修復(fù)或增加人體組織和器官的效用。
“毛囊新生”定義為在先前不存在毛囊或者在以前存在的毛囊之外和毛囊之間的皮膚區(qū)域新的毛發(fā)毛囊形成的現(xiàn)象。
“生物可吸收的”定義為材料的特性，使材料在機(jī)體內(nèi)降解為無毒的副產(chǎn)物，從機(jī)體排出或在機(jī)體中代謝。
“支架”定義為無細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)，可包含活細(xì)胞及將它們維持在特定的結(jié)構(gòu)中。
“細(xì)絲”定義為長度遠(yuǎn)大于其直徑的圓筒狀結(jié)構(gòu)。
“纖維”定義為具有物理完整性的細(xì)絲。
“PLGA”定義為丙交酯與乙交酯的共聚物。
“VEGF”定義為血管內(nèi)皮生長因子。
“EDC”定義為N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。
“TFE”定義為2，2，2-三氟乙醇。
“HAX”定義為交聯(lián)的透明質(zhì)酸。
“心軸”定義為圓筒狀的、逐漸變細(xì)的或圓錐形物體，用于維持應(yīng)用于其外表面的材料的形狀并且在產(chǎn)生中空細(xì)絲的過程中從所述應(yīng)用材料移除。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的實(shí)施方案中，擬生態(tài)毛發(fā)毛囊移植物支架組件為包含一種或多種生物可吸收的聚合物的中空細(xì)絲，此生物可吸收的聚合物限定出通常從支架的一端延伸至另一端的內(nèi)部管腔。根據(jù)需要的用途中空細(xì)絲的內(nèi)壁或外壁可為光滑的或多孔的。例如，具有相對光滑表面的中空細(xì)絲可用于將一種類型的細(xì)胞(如人包皮角質(zhì)化細(xì)胞)保持在管腔表面，并將另一類型的細(xì)胞(如培養(yǎng)的成人毛發(fā)毛囊乳頭細(xì)胞，適于細(xì)胞聚積團(tuán)的形式)安置于管腔中與環(huán)繞的表面附著細(xì)胞接觸。中空細(xì)絲借助高度多孔、親水的內(nèi)部能夠用于芯吸一種或多種類型的細(xì)胞混懸液進(jìn)入細(xì)絲，而細(xì)絲本身可能相對疏水，因而不能芯吸水溶液。
多孔的親水內(nèi)部比中空細(xì)絲外部具有較快的生物吸收(bioabsorption)或液化速率，便于在細(xì)絲管腔中重新組織接種的細(xì)胞，而且使細(xì)胞繼續(xù)被更緩慢的生物可吸收的細(xì)絲壁包含。另外，支架聚合物從管腔內(nèi)部到支架外部可具有可變的或梯度生物吸收(bioabsorptive)速率。因而，內(nèi)部，即指管腔，它的生物吸收或生物可吸收速率高于外部或外部放置的聚合物生物吸收速率。
生物可吸收的、生物相容性材料適于中空細(xì)絲的制造和用作填充中空細(xì)絲內(nèi)部，可選自通常用于臨床實(shí)踐和生物醫(yī)學(xué)研究的任何廣泛的多種生物相容性的、合成的、天然的和半合成的材料。中空細(xì)絲可包含包括以下的聚合物聚(乳酸)、聚(乙二醇酸)、聚(環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(二甲基環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(對-二噁烷酮)、聚(酯)、聚(酯-酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、膠原、明膠、血清白蛋白、蛋白質(zhì)、多糖、粘多糖、碳水化合物、葡萄糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丙烯酸酯)、聚(異丁烯酸酯)、聚(乙烯醇)和所述聚合物的共聚物、摻合物及混合物，還有包含阻斷與另外的非降解聚合物共聚的生物可吸收的鍵的低聚物，此低聚物通過所述的生物可吸收的鍵的降解或水解作用被釋放從而被代謝或排出。本發(fā)明生物可吸收的材料利用生長因子、細(xì)胞附著結(jié)合位點(diǎn)部分、細(xì)胞信號分子的表面修飾、移植物聚合、共聚或摻合可有利于提高細(xì)胞附著和/或提高細(xì)胞的功能、聚積、或毛囊新生過程的起始。
適于用作中空細(xì)絲或用作填充中空細(xì)絲的材料的天然發(fā)生的聚合物(或生物多聚物或生物材料)包括膠原、明膠、纖維素衍生物、淀粉、糊精、殼聚糖、脂蛋白、重組形式的人膠原和明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、白蛋白，其它血清蛋白、多糖、粘多糖和在人機(jī)體產(chǎn)生的其它生物多聚物。適宜的生物多聚物可以天然形式或以被修飾的形式被使用，諸如與毒理學(xué)上可接受的交聯(lián)試劑交聯(lián)，例如為了降低溶解性。填充材料可以包括纖維、凝膠和多孔結(jié)構(gòu)的多種物理形式被利用。例如，細(xì)胞可與纖維蛋白原溶液聯(lián)合，它們暴露于凝血酶時可被轉(zhuǎn)變?yōu)樯锟晌盏哪z。
另一方法包括被稱為PluronicTMF-127的乙烯氧化物和丙烯氧化物共聚物的使用，它由BASF Corp.，Mount Olive，NJ的商業(yè)化提供。此表面活性劑與活細(xì)胞相容，并且當(dāng)從較低溫度升至體溫時其高于臨界濃度形成凝膠。因而，中空細(xì)絲能夠，例如，首先被PluronicTMF-127的乙醇溶液處理，接著蒸發(fā)乙醇在管腔表面得到親水涂層。含有細(xì)胞混懸液的PluronicTMF-127冷溶液可被芯吸或注射入細(xì)絲管腔并放置于溫暖的環(huán)境中使PluronicTMF-127膠化并且防止細(xì)胞從細(xì)絲中移出。其它生物相容性膠成形材料包括具有末端基團(tuán)的共價反應(yīng)形成膠網(wǎng)的膠原、明膠、血清白蛋白、MatrigelTM基底膜基質(zhì)(BDBiosciences，San Jose，CA)及各種聚乙二醇分子。
預(yù)見到本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的其它用途。例如，在加入或不加入其它成分下，簡單地將大量中空細(xì)絲束在一起，可能獲得具有連續(xù)的孔貫通它的三維物體的終產(chǎn)品。這樣的結(jié)構(gòu)可用于在組織工程軟骨領(lǐng)域中。因?yàn)檐浌腔旧鲜菬o血管的，用于組織工程軟骨的支架適于具有容易接受營養(yǎng)的內(nèi)部。此外，這樣的支架的接種便于經(jīng)過孔直接通過所述裝置流動。另外，通過沿生物機(jī)械負(fù)荷的軸定向孔，接種的軟骨細(xì)胞將被刺激適當(dāng)反應(yīng)并組織起來進(jìn)入天然關(guān)節(jié)軟骨的柱狀結(jié)構(gòu)。
透明質(zhì)酸被認(rèn)為是對于組織工程應(yīng)用有用的生物材料，并且適用于以上提及的用于組織工程軟骨的支架。通過利用冷凝劑自我交聯(lián)透明質(zhì)酸獲得適宜的材料，適宜的EDC，如K.Tomihata and Y.Ikada“Crosslinking of hyaluronic acid with water-solublecarbodiimide(利用水溶性碳化二亞胺的透明質(zhì)酸交聯(lián))J.Biomed.Mater.Res.，37，243-251(1997)所描述，此處引入其教導(dǎo)作為參考?？蛇x擇地，透明質(zhì)酸可通過多種其它方法交聯(lián)，包括Y.Luo，K.R.Kirker，and G.D.Prestwich在“Modification of Natural PolymersHyaluronic Acid(天然聚合物修飾透明質(zhì)酸)”Chapter 45 in Methodsof Tissue Engineering(在《組織工程方法》的第45章)，A.Atala and R.P.Lanza，eds.，Academic Press，2002，pp.539-553所描述的方法，此處引入其教導(dǎo)作為參考。
可選擇地，可通過酯化作用轉(zhuǎn)換透明質(zhì)酸成用于本發(fā)明的不溶性材料，如美國專利4,851,521，″Esters of Hyaluronic Acid(透明質(zhì)酸的酯)"，由Francesco delta Valle和Aurelio Romeo(July 25，1989)所描述的，此處引入其教導(dǎo)作為參考。此類型的適合材料為透明質(zhì)酸的芐基酯。因?yàn)橐揽旷ユI的水解作用，數(shù)天之內(nèi)合成產(chǎn)物在體內(nèi)轉(zhuǎn)變回可溶性透明質(zhì)酸，所以轉(zhuǎn)酯基作用為交聯(lián)適宜的方法，同時也可使用其它的交聯(lián)試劑及添加的交聯(lián)成形分子。胺末端的交聯(lián)分子也是適宜的，其包括但不限于脂肪族二氨、諸如賴氨酸烷基酯的二氨基酸酯和胺末端基聚(乙二醇)。
也可采用許多透明質(zhì)酸的化學(xué)交聯(lián)方法來促進(jìn)生物活性分子共價附著于透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)以加強(qiáng)所產(chǎn)生支架的性能。例如，包含氨基酸Arg-Gly-Asp(RGD)的細(xì)胞附著區(qū)域序列的肽可用于加強(qiáng)細(xì)胞對交聯(lián)的透明質(zhì)酸支架的附著。
在使用透明質(zhì)酸制造用于組織工程毛發(fā)毛囊的支架中，可期望將生長因子和血管發(fā)生因子附著于支架，這樣的方法可將這些因子在支架降解期間釋放，用于促進(jìn)血管生長到新形成的毛囊或是其它有益的目的。除小分子共價附著于支架之外，諸如蛋白質(zhì)、糖蛋白的較高分子量的分子和諸如膠原、層粘連蛋白、纖維結(jié)合素等等的其它生物聚合物，可被物理地或靜電地結(jié)合到結(jié)構(gòu)上以提供更大的物理完整性、細(xì)胞附著能力或生物活性。其它包括硫酸軟骨素、肝素、硫酸皮膚素、多能聚糖的葡萄糖胺聚糖等等在本發(fā)明中可替代透明質(zhì)酸被有利利用。
制造用于組織工程毛發(fā)毛囊的支架的適宜的材料為軟骨素-6-硫酸酯。在實(shí)施例6中示例性說明了軟骨素-6-硫酸酯對于毛囊新生過程的令人驚奇的有益效果。適宜的組合為軟骨素-6-硫酸酯和明膠的混合物，它們利用EDC交聯(lián)，并如實(shí)施例9示例描述的使用癸二酸顆粒作為多孔試劑賦予多微孔性，或通過如實(shí)施例10所示例描述的轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維團(tuán)。
毛發(fā)毛囊的形成需要表皮細(xì)胞(即角質(zhì)化細(xì)胞)與真皮細(xì)胞(即真皮成纖維細(xì)胞或真皮/毛囊乳頭細(xì)胞)間的相互作用。用于治療燒傷患者的用于制造組織工程活皮膚等同物的真皮和表皮細(xì)胞真皮和表皮細(xì)胞，它們目前通常是從人嬰兒包皮組織中取得，因?yàn)樗菀撰@得。這些皮膚等同物，盡管具有巨大的臨床價值，但是缺少毛發(fā)毛囊。因而，角質(zhì)化細(xì)胞或來自于那些來源的角質(zhì)化細(xì)胞通常被認(rèn)為在需要誘導(dǎo)新毛發(fā)毛囊的形成的組織工程植入物構(gòu)造中不具有任何特別的價值。這在Cooley和Vogel(WO99/01034)的公開“preferably theepidermal cells are from the same patient being treated...(優(yōu)選表皮細(xì)胞來自于接受治療的相同患者...)”中有陳述，此處引入其教導(dǎo)。
令人驚奇的是，在這里發(fā)現(xiàn)來自成人頭皮的角質(zhì)化細(xì)胞并不特別可靠，事實(shí)上，來自于嬰兒包皮的角質(zhì)化細(xì)胞在它們與真皮乳頭細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)毛囊新生的能力上更有效。但是這一發(fā)現(xiàn)的原因未知(并且不希望被任何特別的理論束縛)，表皮干細(xì)胞為表皮角質(zhì)化細(xì)胞的非常少的亞群，我們相信它們在起始毛囊新生中是需要的，并且嬰兒表皮與成人表皮相比是這些細(xì)胞的更豐富的來源。因而，來自嬰兒的其它干細(xì)胞來源也可是有用的。例如，由臍帶取得的血液可為有用的干細(xì)胞的來源，還有取自胚胎的或已建立的胚胎干細(xì)胞系，或取自已建立的器官捐贈程序中的嬰兒頭皮皮膚。
本發(fā)明的表皮/真皮細(xì)胞構(gòu)造的真皮組分可從取自接受毛發(fā)恢復(fù)治療的受試者的切下的毛囊獲得。但是，另一可能為從適宜為嬰兒的捐贈器官的頭皮獲得細(xì)胞。欲接種到支架里的細(xì)胞可從毛囊斷片培養(yǎng)物獲得，其中毛囊斷片選自包含真皮乳頭、真皮鞘、基質(zhì)以及內(nèi)根鞘和外根鞘的斷片。可選擇地，細(xì)胞可簡單地培養(yǎng)自細(xì)胞混合物，該細(xì)胞混合物由完整的頭皮真皮制備或者由傳統(tǒng)毛發(fā)恢復(fù)手術(shù)過程中供體位點(diǎn)組織的毛囊單位切除后保留的真皮和毛囊組織殘余物(scrap)制備，其中供體也是所述細(xì)胞的受體。
表皮細(xì)胞不論起源均適于容納于中空細(xì)絲管腔內(nèi)，附著于或毗連于管腔內(nèi)壁或另外容納于其中的多孔結(jié)構(gòu)中。從接受擬生態(tài)移植物的人的有頭皮的毛發(fā)活組織檢測獲得的并且培養(yǎng)增殖的毛囊祖細(xì)胞，適于首先容納于細(xì)絲管腔的近側(cè)室，此近側(cè)室對應(yīng)毛囊球。因而，所述移植物為齊備的，其中真皮和表皮組件彼此間有著恰當(dāng)?shù)年P(guān)系的存在著，避免了植入細(xì)胞與完整的表皮或向移植的植入物下面生長的表皮細(xì)胞的相互作用的需要。這繼而提供了可靠的及可重現(xiàn)性的新毛發(fā)毛囊的形成。
可選擇地，真皮和表皮細(xì)胞可聯(lián)合作為混合物，與任選的附加干細(xì)胞一起，并且在植入前被接種到支架中。在此情況下細(xì)胞就原位聯(lián)系和改組。對于此細(xì)胞傳遞的方法適宜的支架構(gòu)造如圖12至14所示。在此實(shí)施方案中，該支架被制造為一端閉合的形成多孔的、作為吸收液體的貯器的海綿樣的結(jié)構(gòu)的中空細(xì)絲。因而，在中空細(xì)絲的管腔中注射細(xì)胞和液體的混懸液，液體被芯吸入貯器末端引起細(xì)胞集聚到細(xì)絲閉合末端的濃縮區(qū)域。然后將該含有細(xì)胞的支架以與在傳統(tǒng)毛發(fā)恢復(fù)手術(shù)過程中植入毛囊移植物相同的方式立即植入皮膚刺傷處。此實(shí)施方案的制造支架的方法如實(shí)施例9中示例性的描述，并且包括以下步驟1.提供逐漸變細(xì)的心軸，其與移液管吸頭或其它適宜的液體轉(zhuǎn)移工具的遠(yuǎn)側(cè)部分具有相同維數(shù)。
2.提供兩端開口，能容納步驟1的心軸的模型腔，心軸作為該腔的插入物，此腔長于心軸，此超出的長度產(chǎn)生的空隙體積約等于心軸自身體積。
3.提供生物可吸收的材料A和孔生試劑顆粒C的混合物，A溶解于溶劑B中，C可溶于溶劑D但不溶于溶劑B。
4.用步驟3的混合物填充步驟2的腔并插入步驟1的心軸。
5.移除溶劑B，從模型腔中取出模制部分。
6.將步驟5的模制部分放置于溶劑D中以除去孔生試劑顆粒。
7.將步驟6的模制部分放置于溶于溶劑F的交聯(lián)劑E中。
8.以新的溶劑F或其它適宜的溶劑沖洗產(chǎn)生的支架并使其干燥。
9.任選地以水-可溶性物質(zhì)G的水溶液再水化步驟8的支架并使水分蒸發(fā)產(chǎn)生保護(hù)涂層。
10.制備溶于溶劑I中的生物可吸收的材料H的溶液。
11.以步驟10的溶液包被步驟9的支架并使溶劑I蒸發(fā)。
12.通過在水中浸泡支架移去材料G的保護(hù)涂層，以新的水沖洗，并使水蒸發(fā)。
在包括以上步驟的適宜的方法中，A為軟骨素-6-硫酸酯和明膠的混合物，B為水，C為小于63微米的癸二酸顆粒，D為丙酮，E為EDC，F(xiàn)為體積比為9∶1的丙酮∶水混合物。
上述方法的變體所產(chǎn)生的實(shí)施例10示例性描述的實(shí)施方案包括以下步驟
1.提供逐漸變細(xì)的心軸，其與移液管吸頭或其它適宜的液體轉(zhuǎn)移工具的遠(yuǎn)側(cè)部分具有相同維數(shù)，除了所述心軸的頂部輕微延伸至形成尖頭之外。
2.以水溶性聚合物A包被步驟1的心軸3.將可滲透的、生物可吸收的濾過物質(zhì)B附著于步驟1的心軸頂部，這樣適于在液體中從細(xì)胞混懸液中分離細(xì)胞，所述濾過物質(zhì)基本上被溶于溶劑D中的可移去的保護(hù)涂層C包裹。
4.以溶于溶劑F中的膜形成的生物可吸收的聚合物E包被整個心軸和所述濾過物質(zhì)B5.移去步驟4的溶劑F生成覆蓋于心軸和步驟3的被附著的頂部的生物可吸收的聚合物膜的連續(xù)層。
6.通過在心軸附著點(diǎn)遠(yuǎn)側(cè)移去一小片覆蓋于濾過材料所述膜，在步驟5的膜中生成一個開孔。
7.通過在水中浸泡步驟6的產(chǎn)物基本移去聚合物A。
8.通過浸泡于溶劑D中基本移去保護(hù)涂層材料C。
9.從產(chǎn)物中移去心軸，繼續(xù)進(jìn)行完全移去材料A和C所必要的步驟7和8。
在以上方法的適宜的實(shí)施方案中，A為表面活性劑，例如PluronicTMF-127，B為含有軟骨素-6-硫酸酯和交聯(lián)明膠的纖維團(tuán)，C為焦化的蔗糖，D為水，E為PLGA，F(xiàn)為二氯甲烷。
制造本發(fā)明的兩端開口的長中空細(xì)絲支架的適宜的方法涉及作為心軸的尼龍單纖絲的使用，繼而通過溶解移除尼龍單纖絲，在其上沉積有多種成分。在此方法中也可考慮使用可被移除且不損壞生物材料包埋料的由其它材料制成的纖維?？蛇x擇地，中空細(xì)絲熔化擠出已證明是可用于產(chǎn)生本發(fā)明的中空細(xì)絲的技術(shù)。
在本發(fā)明的方法中，首先用顆粒包被細(xì)的尼龍纖維，以確保粘稠的溶液形式的生物可吸收材料的應(yīng)用能夠粘附該纖維。使用尼龍溶液或其它諸如聚苯乙烯的聚合物溶液，將這些顆粒涂敷于、粘附于或結(jié)合于該尼龍纖維。所述尼龍(或其它聚合物)顆粒牢固地粘附于所述細(xì)的尼龍纖維并且協(xié)助后續(xù)的以例如透明質(zhì)酸溶液的粘稠的水溶液對該纖維的包被，但該溶液不粘于該尼龍表面。用作顆粒的適宜的物質(zhì)為癸二酸，它基本不溶于水(透明質(zhì)酸的溶劑)和TFE(尼龍的溶劑)，但是在丙酮(透明質(zhì)酸和尼龍的非溶劑)中自由溶解。所述顆粒憑借該顆粒的移除在產(chǎn)生的中空細(xì)絲上形成多孔管腔表面。成熟、交聯(lián)或另外使包被的生物可吸收的材料不溶于水之后，用適當(dāng)?shù)娜軇┮迫ツ猃埡透街谠撃猃埖念w粒。如果需要，可再應(yīng)用不同生物可吸收材料的附加包被。在此方法的這一階段，所述尼龍和附著該尼龍的顆粒被移除，有廣泛選擇的溶劑可用于涂敷此第二種材料。適宜的第二種材料為丙交酯和乙交酯的共聚物(下文中稱之為PLGA)，因此在此方法中提供具有HAX內(nèi)部和PLGA外部的中空細(xì)絲。
從以上，此方法詳細(xì)的步驟如下1.提供水溶性材料W。
2.提供溶于溶劑A的材料X的纖維。
3.提供溶于溶劑B的生物可吸收的材料Y。
4.提供溶于溶劑C的顆粒P。
5.提供溶于溶劑D的生物可吸收的材料Z。
6.提供溶于溶劑N的聚合物M。
7.制備溶于溶劑N中的聚合物M溶液。
8.以步驟7的溶液包被步驟2的纖維。
9.將步驟4的顆粒P包被步驟8的被包被的纖維并使溶劑N蒸發(fā)，因此將所述顆粒結(jié)合于所述纖維上。
10.制備溶于溶劑B的材料Y溶液。
11.將步驟10的溶液包被到以步驟9的顆粒包圍的纖維上并使溶劑B蒸發(fā)。
12.若材料Y為水溶性的，則通過交聯(lián)使材料Y不溶于水。
13.通過用溶劑N溶解和沖洗從步驟12的包被的纖維中移除聚合物M。
14.通過用溶劑C溶解和沖洗從步驟13的包被的纖維中移除顆粒P。
15.通過用溶劑A溶解和沖洗從步驟14的包被的纖維中移除纖維X。
16.制備溶于水中的材料W的溶液。
17.如果需要，涂敷步驟16的溶液保護(hù)涂層于步驟15的細(xì)絲并使水蒸發(fā)。
18.制備溶于溶劑D的生物可吸收材料Z的溶液。
19.以步驟18的溶液包被步驟17的纖維并使溶劑D蒸發(fā)。
20.通過在水中浸泡細(xì)絲移除材料W的保護(hù)涂層，以新的水沖洗，并使細(xì)絲干燥。
21.切斷細(xì)絲成適宜的長度并且滅菌。
22.通過使在適宜的液體中適宜體積的細(xì)胞混懸液被芯吸入所述細(xì)絲管腔，以所述適宜的細(xì)胞接種細(xì)絲。
23.通過插入所述細(xì)絲的一端任選地以額外的細(xì)胞構(gòu)造裝載所述細(xì)絲。
24.在需要毛干生長的皮膚中做切口并將步驟22或23的細(xì)絲植入切口，含有細(xì)胞構(gòu)造的一端包埋于皮膚中，并且遠(yuǎn)側(cè)端在皮膚上經(jīng)皮延伸。
在包括以上步驟的適宜的方法中，W為焦化蔗糖，X為尼龍，A為TFE，Y為透明質(zhì)酸(鈉鹽)，B為水，P為癸二酸(顆粒大小為10-500微米，優(yōu)選50-200微米)，Z為PLGA，D和N為二氯甲烷，M為聚苯乙烯，并且C為丙酮。如果需要PLGA具有多孔性，D可特定為丙三醇和TFE的溶液。通過蒸發(fā)TFE，PLGA和丙三醇相分離為二連續(xù)乳液。通過溶于水中移除丙三醇賦予殘留的PLGA包被多微孔結(jié)構(gòu)。
為制造用于軟骨組織工程應(yīng)用的支架，步驟11的的大量的纖維，加入或不加入其它成分，可采用步驟10的其它的包被溶液作為粘和劑束在一起。在溶解心軸纖維之前，所述束可被切成盤，據(jù)此，在溶解纖維并完成處理步驟之后可構(gòu)造所需要的產(chǎn)品。
實(shí)施例實(shí)施例1 PLGA不損害毛囊存活和毛發(fā)生長從CCA Purac Biochem bv，Gorinchem，荷蘭(PurasorbPLGA，在氯仿中的固有粘度為1.06dl/g)獲得d，1-丙交酯和乙交酯(52∶48)的共聚物(PLGA)，并溶解于二氯甲烷中(10％w/v)。蔗糖被熔化并加熱直至焦化，并使其冷卻至能從熔化物中拉出所需尺寸的細(xì)絲的溫度為止。細(xì)絲被冷卻直至凝固，然后立即放置在覆蓋有氯化鈉粉末的表面以防止它們變粘。通過將PLGA溶液包被于粉化的、以鹽覆蓋的焦化糖的細(xì)絲制備中空細(xì)絲。蒸發(fā)二氯甲烷，通過將包被的細(xì)絲放置于水中溶解并除去糖和鹽。在IACUC許可下在Mercer大學(xué)(Atlanta，GA)從安樂死的C57B16小鼠(Charles River)上切下鬣(胡須)毛囊。將被切下的胡須重新植入于同系基因型小鼠剃過的背部皮膚上的斜切口。然后重復(fù)操作如下將切下的毛囊先插入并將其整潔地安置于空PLGA細(xì)絲腔中，這樣該毛囊就完全被聚合物包圍(圖7)。30天后將被植入小鼠安樂死并且切下皮膚，平展于矩形紙板上，在福爾馬林中固定并通過石蠟包埋、切片、H&E染色的常規(guī)方法處理用以通過光學(xué)顯微鏡檢查分析。
30天后，發(fā)現(xiàn)8個中7個對照毛囊植入物生長出鬣毛干。3個中2個PLGA/毛囊植入物也被發(fā)現(xiàn)生長出毛干(圖8)。在PLGA中有或沒有鞘的再生的、移植的毛囊組織學(xué)未表現(xiàn)出任何異常。
實(shí)施例2多微孔PLGA中空細(xì)絲的制備在TFE(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)中制備丙三醇(glycerine U.S.P.)和PLGA(ResomerTMRG504，Boehringer Ingelheim，Germany)溶液，丙三醇與PLGA的比率為80∶20(w/w)。將此溶液包被焦化蔗糖細(xì)絲(如以上在實(shí)施例1中所描述制備)數(shù)層，涂層間時間足夠涂層干燥。蒸發(fā)丙三醇和PLGA的溶劑TFE，引起溶質(zhì)濃度增加直至丙三醇不再殘留混合。丙三醇從PLGA/TFE的相分離導(dǎo)致形成二連續(xù)乳液。然后將包被的細(xì)絲放置于水中，這樣引起糖及丙三醇還有任何殘余的TFE迅速溶解并從當(dāng)前的多微孔PLGA中浸出。用水漂洗合成的多孔中空細(xì)絲并使其在干燥器中完全干燥。該干燥的PLGA中空細(xì)絲多孔結(jié)構(gòu)如圖4和圖5的SEM照片所示。
實(shí)施例3親水PLGA中空細(xì)絲的制備在無水乙醇中溫和加熱制備約5％(w/v)的PluronicTMF-127表面活性劑(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶液，它是乙烯氧化物和丙烯氧化物的共聚物。如實(shí)施例1所描述制備PLGA中空細(xì)絲。使澄清無色的PluronicTMF-127溶液被芯吸入PLGA細(xì)絲中的一根，并使乙醇完全蒸發(fā)。放置一滴紅色食用色素染料于玻璃板上。將一根15mm長的PluronicTMF-127處理的PLGA中空細(xì)絲及一根15mm長的未處理的具有相同直徑的對照細(xì)絲與染料接觸，使每根細(xì)絲的一端接觸到該液體表面。PluronicTMF-127處理的PLGA中空細(xì)絲迅速芯吸水染料溶液通過它的整個長度，相反，未處理的細(xì)絲僅緩慢芯吸染料到它長度的4mm。
實(shí)施例4 PLGA包被的HAX細(xì)絲的制備將癸二酸(Aldrich Chemical Co.，MilWaukee，WI)用研缽和研棒磨碎并篩濾獲得尺寸為＞63和＜212微米的顆粒。用溶于TFE的尼龍溶液(10％w/v)包被一米長的細(xì)的單纖絲尼龍纖維(0.003-英寸直徑，Shakespeare Monofilament Division，Columbia，SC)，并立即牽引所述纖維通過含有所述溶液的移液管，然后通過放置于移液管吸頭出口的一堆癸二酸顆粒從而使癸二酸顆粒包圍纖維。纖維懸吊于一端并且使其懸掛于垂直位置。通過將180mg透明質(zhì)酸鈉粉末(1.4百萬分子量，Lifecore Biomedical，Chaska，MN)與10ml水混合并且使其水化，并室溫過夜溶解制成透明質(zhì)酸鈉鹽溶液。將溶液混和均勻，然后手動將膠液珠沿該纖維向下流動將其包被于該纖維上。使透明質(zhì)酸鹽溶液的薄涂層干燥，然后涂敷兩層附加的涂層，并使涂涂層間的時間足夠涂層干燥。然后將該纖維切為約4cm長，并且放置于含有溶于丙酮的0.2％(w/v)的N，N′-異丙基乙基氨基碳化二亞胺(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)的小瓶中，其中丙酮含有10％(v/v)的水。室溫3小時后，倒出溶液并替換為純丙酮。再倒出丙酮并通過蒸發(fā)除去殘留的丙酮。然后在小瓶中裝滿TFE(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)并使其維持室溫過夜。倒出TFE并替換為新的TFE，數(shù)小時后倒出并替換為丙酮。再倒出丙酮通過蒸發(fā)除去殘留的丙酮，生產(chǎn)HAX細(xì)絲。
于明火上在試管中攪拌加熱蔗糖直至蔗糖熔化且焦化為止。倒出黑褐色的熔化物并使其凝固。將其溶解于水中(約20％w/v)制備糖漿。將干燥的HAX細(xì)絲放置于該糖漿中，HAX細(xì)絲迅速吸收液體并且直徑顯著變大。從糖漿中移去細(xì)絲并使其部分干燥。然后用氯化鈉粉末(＜63微米)包被細(xì)絲并放置于干燥器中干燥過夜。將堅(jiān)硬的、脆的、琥珀色的細(xì)絲浸入溶于二氯甲烷(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)的10％(w/v)的PLGA(PurasorbPDLG，在氯仿中固有粘度為1.06dl/g，CCA Purac Biochem bv，Gorinchem，荷蘭)溶液中并使溶劑蒸發(fā)。然后將包被的細(xì)絲浸泡于水中直至糖和鹽溶解，以琥珀色消失為據(jù)。然后將細(xì)絲返回干燥器并使其完全干燥。通過實(shí)施例1的方法制備不含HAX的PLGA對照中空細(xì)絲。這些細(xì)絲芯吸液體的能力通過將其一端浸入一滴含有紅色食用著色染料的水中測試。紅色的水迅速進(jìn)入含有HAX的細(xì)絲管腔并完全充滿，由此使細(xì)絲成為紅色。但是，不含有HAX的細(xì)絲不能芯吸水并且具有水排斥性，漂浮于水面上。
實(shí)施例5包含在PLGA中空細(xì)絲支架中的來自小鼠細(xì)胞的體內(nèi)毛發(fā)毛囊新生及毛干生長如以外所述(S.M Prouty，L. Lawrence，et al.(1996).″Fibroblast-dependent induction of a murine skin lesion with similarityto human common blue nevus.(以人普通藍(lán)痣類似物損傷的鼠皮膚的成纖維細(xì)胞依賴的誘導(dǎo)作用)"Am J Pathol 148(6)1871-85)，此處引入其教導(dǎo)，從新生小鼠中分離表皮和真皮細(xì)胞。與發(fā)表的程序有兩點(diǎn)不同，即，為便于從新生小鼠皮膚的真皮上分離表皮，使用C57/B16小鼠(Charles River Laboratories)及使用分散酶(Gibco)而不是胰酶。一旦真皮和表皮細(xì)胞群都單獨(dú)分離出來，將它們再組合使真皮細(xì)胞與也被稱為表皮芽的表皮的比率為100∶1。以900rpm旋轉(zhuǎn)此細(xì)胞組合物5分鐘。生成的片狀沉淀物重懸于PBS以獲得至少10百萬總細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度，通過簡單地將所述纖維浸沒于細(xì)胞混懸液將細(xì)胞混懸液迅速加載于按實(shí)施例1所討論的方法制備的所述PLGA中空細(xì)絲。然后用19-號皮下注射針通過穿刺皮膚，再退出針直至一半的開放斜面暴露為止，插入中空細(xì)絲植入物于該開口中，然后完全退出針同時將細(xì)絲推至皮下，這樣將這些細(xì)胞接種的細(xì)絲植入裸(Nu/Nu)鼠背部皮膚下面。植入后3周，小鼠被尸體解剖并切下皮膚。在細(xì)絲植入位點(diǎn)的皮膚的皮下觀察到伴隨著PLGA支架材料的毛囊樣結(jié)構(gòu)和毛干。如圖9所示，在這張顯微照片上可觀察到良好成形的毛囊球和長毛干。該支架材料不易看見，因?yàn)樗菬o色的且部分被降解了。
實(shí)施例6軟骨素-6-硫酸酯在細(xì)胞混懸液中作為附加物的用途利用實(shí)施例5中描述的方法以評估在注射給裸鼠之前添加至細(xì)胞混懸液中的一些可溶性材料。將準(zhǔn)確的相同數(shù)量的每種細(xì)胞類型注射到對照和測試材料的注射位點(diǎn)，這些位置位于同一只小鼠。如圖10所示，注射細(xì)胞后13天，在相同放大倍數(shù)下，在有起始5％濃度的軟骨素-6-硫酸酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)存在下，在皮下間隔形成的毛囊明顯大一些。
實(shí)施例7 PluronicTMF-127在細(xì)胞混懸液中作為附加物的用途以20％PluronicTMF-127表面活性劑(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)替換軟骨素-6-硫酸酯重復(fù)進(jìn)行實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)。如圖11所示，注射細(xì)胞后13天，在相同放大倍數(shù)下，在皮下間隔形成的毛囊比無PluronicTMF-127表面活性劑存在的注射液的對照注射位點(diǎn)的毛囊明顯大一些。
實(shí)施例8交聯(lián)明膠中空細(xì)絲的制備將豬皮明膠(300 bloom，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶于溫水中形成5％(w/v)的溶液。此溶液應(yīng)用于實(shí)施例4所描述的以癸二酸包裹的細(xì)尼龍細(xì)絲。涂敷數(shù)層包被，使應(yīng)用涂層間的時間足夠涂層干燥。然后該纖維被切為約4cm長，并且放置于含有溶于丙酮的0.2％(w/v)的EDC(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的小瓶中，其中丙酮含有10％(v/v)的水。室溫3小時后，倒出溶液并替換為純丙酮。再倒出丙酮并通過蒸發(fā)除去殘留的丙酮。然后在小瓶中裝滿TFE(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)并使其維持室溫過夜。倒出TFE并替換為新的TFE，數(shù)小時后倒出并替換為丙酮。再倒出丙酮通過蒸發(fā)除去殘留的丙酮，生產(chǎn)不溶于水的明膠中空細(xì)絲。
實(shí)施例9交聯(lián)軟骨素-6-硫酸酯/明膠的制備將癸二酸(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)用研缽和研棒磨碎為能通過63微米的篩的顆粒。將一次性10微升移液管吸頭(Eppendorf epTIPSTM，Brinkman Instruments，Westbury，NY)切為三等分段。棄掉近側(cè)部段，用癸二酸粉末填充中間段。將軟骨素-6-硫酸酯(80mg)和豬皮明膠(80mg)溶于2.0ml溫水中。將裝有不銹鋼管的注射器安裝到癸二酸填充的移液管吸頭部分的較大的開口，將此溶液加載到此注射器中。溶液被注射到填充的癸二酸中，使得當(dāng)液體在填充料中移動時從粉末中擠出空氣。然后將從移液管吸頭切下的遠(yuǎn)側(cè)段插入到填充段中。擦掉從開口端中擠出的多余的糊。
經(jīng)干燥器過夜貯存使裝配的段完全干燥。然后將它們放置于溶于9∶1(v/v)的丙酮∶水的0.2％(w/v)的EDC溶液中。約1小時后，輕輕將兩段移液管吸頭分開，推出模制產(chǎn)品并且放回EDC溶液中放置另外的3小時，然后將該交聯(lián)支架浸泡于純丙酮中1小時再使其干燥。
實(shí)施例10 PLGA移液管吸頭鞘支架及交聯(lián)的明膠/軟骨素-6-細(xì)絲將軟骨素-6-硫酸酯及豬皮明膠(各100mg)溶于2.0ml溫的去離子水中，并通過26-號針緩慢注入裝滿丙酮的硅橡膠管，丙酮從升高的貯器流進(jìn)燒杯中。收集合成的細(xì)的白色的細(xì)絲并放置于溶于9∶1的丙酮∶水的0.2％(W/v)的EDC溶液中4小時。然后用純丙酮漂洗細(xì)絲并使其干燥。給細(xì)絲添加溶于水的30％(w/v)的焦化蔗糖并且使細(xì)絲浸泡于其中直至細(xì)絲完全飽和。將一小束飽和的纖維團(tuán)放置于1.0mm內(nèi)徑的TeflonTM管中并使其在干燥器中完全干燥。褐色的糖包裹的圓柱細(xì)絲被從管中擠出放置到30-號針的頂部，此針通過Eppendorf移液管吸頭(10 microliter epTIPSTM，Brinkman Instruments，Inc.，USA)的末端伸出。將具有附著的糖包裹的細(xì)絲的移液管吸頭懸吊點(diǎn)朝下浸入溶于二氯甲烷的30％(w/v)的PluronicTMF-127溶液中，并使其干燥，然后再浸入溶于二氯甲烷的15％(w/v)PLGA溶液中，并使其干燥。用剪子剪斷被干燥的PLGA的遠(yuǎn)側(cè)端并將整個移液管吸頭放置于水中。數(shù)分鐘后，由于水合的PluronicTMF-127表面活性劑涂層，PLGA薄膜容易地從移液管吸頭滑落。將產(chǎn)生的支架進(jìn)一步浸泡直至焦化糖的褐色消失為止。
為了測試包含在PLGA鞘中的含纖維材料作為濾過介質(zhì)的功能并因此作為收集和植入毛發(fā)毛囊誘導(dǎo)細(xì)胞的方式的能力，將在水中的活性碳顆粒(100-400 mesh，Norit CAl Activated Charcoal，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)漿牽引到10微升移液管吸頭，將吸頭插入到所述PLGA支架鞘中，從移液管中推出所述的漿并通過支架末端出來。如圖15所示，在纖維性材料的近端活性碳顆粒清晰可見，隨著水的經(jīng)過它們在近端集聚。
實(shí)施例11用于組織工程軟骨的捆束中空細(xì)絲HAX支架將透明質(zhì)酸鈉(MW 1.4×106 Daltons，產(chǎn)品編號80081，LifeCoreBiomedical，Inc.，Chaska，MN 55318)溶解在去離子水中，放置于透析袋中并對1克/100ml去離子水的陽離子交換纖維素(Dowex AG50W-X4，purchased from BIO-RAD Laboratories，Inc.，Hercules，CA)透析，并于4℃用磁力棒攪拌2天。從透析袋中移去溶液并凍干以獲得松散的白色固體，將此固體重溶于去離子水以獲得含有3.4％(w/v)的透明質(zhì)酸的粘稠溶液。
將尼龍單纖絲線(直徑0.003英寸，SN-38 WonderThreadTM，Shakespeare Monofilament Division，哥倫比亞，SC)排成3米長的一列，并以在溶于二氯甲烷的約5％(w/v)聚苯乙烯(碎的一次性培養(yǎng)皿碎片)溶液中的癸二酸粉末(＜63微米)漿包被，采用以下方式包被通過將纖維穿過球部截掉的一次性移液管(cat.no.231，Samco ScientificCorp.，San Fernando，CA)，穿過球部孔將所述的漿注射入移液管，然后沿該纖維的長度向下移動移液管(先流過球部)，這樣移液管吸頭作為量孔用于使所述的漿均勻沉積。二氯甲烷蒸發(fā)后，包被的纖維為不透明的白色并且比未包被的纖維具有顯著的粗糙感。然后將以上透明質(zhì)酸溶液以相同方式涂敷于包被纖維。涂敷5層包被，每層透明質(zhì)酸涂層之間約有1小時干燥時間。然后小心卷起纖維并放置于有蓋的皿，此皿具有溶于丙酮的0.2％(w/v)EDC溶液，該丙酮含10％(v/v)的去離子水，并浸沒于此溶液中使其過夜浸泡。然后在純丙酮中漂洗并再次捆扎纖維，這次約將約10根纖維一起捆束為一個連續(xù)的繩。手動以透明質(zhì)酸溶液包被所述繩，即指用一只手的拇指和食指及中指拿住少量粘稠溶液，所述繩放置于三指接合形成的缺口處并朝著繩的長度移動手。進(jìn)行數(shù)層包被并且每層之間使其有足夠干燥的時間。然后卷起包被的繩并放置于上述的含有EDC溶液的有蓋皿中，使其浸泡過夜。然后用純丙酮漂洗并使其干燥。
將該繩切為4cm長并且每段用大量的透明質(zhì)酸溶液包被。將包被的段束在一起并用0.009英寸直徑的尼龍單纖絲(Shakespeare)圍繞著束捆扎成單獨(dú)的環(huán)。將每環(huán)扎緊并打結(jié)，將多余的透明質(zhì)酸溶液從束中擠出，然后將束一端懸掛干燥。多余的溶液從末端滴下，并且一天后所述束成為硬的、輕的混合物。然后用刀片將其切為3mm直徑的盤，并將該盤放置于新一批的以上提及的EDC溶液過夜，以使透明質(zhì)酸交聯(lián)及溶去癸二酸，并再在二氯甲烷中過夜以完成溶去聚苯乙烯。然后將其放置于TFE中溶去尼龍。一小時后替換新的TFE并使該盤在新的TFE中浸泡過夜。然后以新的TFE漂洗該盤，再用丙酮漂洗并使其干燥。將干燥的盤放置于50％戊二醛水溶液(Acros no.41096-5000，購于Fisher Scientific Co.，F(xiàn)airlawn，NJ)中，并于室溫使其浸泡72小時，如M.Hu，E.E.Sabelman，S.Lai，E.K.Timek，F(xiàn).Zhang，V.R.Hentz，and W.C.Lineaweaver在"Polypeptide resurfacingmethod improves fibroblast′s adhesion to hyaluronan strands(多肽再涂層方法提高層纖維細(xì)胞對透明質(zhì)烷細(xì)絲的附著)″，Journal ofBiomedical Materials Research(生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志)，vol.47，79-84頁(1999)中所推薦，此處引入其教導(dǎo)。這種處理將EDC交聯(lián)的HAX轉(zhuǎn)變?yōu)楦m于組織工程軟骨應(yīng)用的較緩慢降解的材料。將所述盤從戊二醛中移出后，更換數(shù)次去離子水漂洗，然后使其在水中浸泡過夜。再次漂洗盤并在用于細(xì)胞接種和生物反應(yīng)器研究之前放置于作為消毒劑的70％(v/v)異丙醇/水溶液中。
權(quán)利要求
1.生物可吸收的結(jié)構(gòu)，包括限定內(nèi)部管腔的細(xì)絲，所述結(jié)構(gòu)適合用于組織工程。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，適合用于毛發(fā)毛囊的組織工程。
3.束起的多個如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，所述束適合用于選自骨、軟骨和骨軟骨組織的組織工程的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，其中所述細(xì)絲包括內(nèi)層和外層，所述內(nèi)層具有限定管腔的內(nèi)表面。
5.如權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)，包括一種或多種生物可吸收的材料，所述材料選自聚(乳酸)、聚(乙二醇酸)、聚(環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(二甲基環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(對-二噁烷酮)、聚(酯)、聚(酯-酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、膠原、明膠、血清白蛋白、蛋白質(zhì)、多糖、粘多糖、碳水化合物、葡萄糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丙烯酸酯)以及所述生物可吸收材料的共聚物、摻合物及混合物，以及包含阻斷與另外的非降解聚合物共聚的生物可吸收的鍵的低聚物，此低聚物通過所述的生物可吸收的鍵的降解或水解作用被釋放而被代謝或排出。
6.如權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)，其中所述外層基本上是無孔的并且所述內(nèi)層為多孔。
7.如權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)，其中所述內(nèi)層包括選自以下的生物材料膠原、明膠、纖維素衍生物、淀粉、糊精、殼聚糖、脂蛋白、軟骨素-6-硫酸酯、重組形式的人膠原和明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、白蛋白，血清蛋白、多糖、粘多糖、人體天然發(fā)生的天然生物聚合物、所述生物材料的共聚物、摻合物、混合物及其交聯(lián)衍生物。
8.如權(quán)利要求4所述的結(jié)構(gòu)，其中所述外層包括丙交酯和乙交酯的共聚物，所述內(nèi)層包括選自交聯(lián)的透明質(zhì)酸和軟骨素-6-硫酸酯的生物可吸收的材料。
9.制備如權(quán)利要求4所述的生物可吸收的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟a.制備包括第一生物可吸收的材料和孔生試劑的模制結(jié)構(gòu)；b.從步驟a的模制結(jié)構(gòu)中移去所述孔生試劑；c.交聯(lián)所述生物可吸收的材料；d.以第二生物可吸收的材料包被所述結(jié)構(gòu)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一生物可吸收的材料包括軟骨素-6-硫酸酯和明膠的混合物，并且所述孔生試劑包括癸二酸顆粒。
11.用于誘導(dǎo)毛發(fā)毛囊生長的植入物，包括如權(quán)利要求2所述的結(jié)構(gòu)，利用選自以下的細(xì)胞接種細(xì)絲從毛發(fā)毛囊斷片獲得的細(xì)胞、真皮乳頭細(xì)胞、真皮鞘細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)根鞘細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞、成人或嬰兒來源的表皮細(xì)胞、成人或嬰兒來源的真皮細(xì)胞、衍生自胚胎的干細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、脂肪組織細(xì)胞、肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和任何所述細(xì)胞的組合。
12.如權(quán)利要求11所述的植入物，其中所述細(xì)胞在被接種到所述細(xì)絲之前在培養(yǎng)中增殖。
13.如權(quán)利要求11所述的植入物，其中所述表皮被接種于所述細(xì)絲的管腔壁并且毛囊細(xì)胞被插入到所述細(xì)絲的一端。
14.如權(quán)利要求13所述的植入物，其中所述毛囊細(xì)胞包括真皮乳頭細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14所述的植入物，其中所述表皮細(xì)胞被接種于所述細(xì)絲的內(nèi)管腔并且培養(yǎng)的真皮乳頭細(xì)胞團(tuán)被插入到所述細(xì)絲的管腔的一端。
16.毛發(fā)生長或恢復(fù)的方法，包括以下步驟a.取得頭皮毛囊細(xì)胞；b.培養(yǎng)所述毛囊細(xì)胞以增加它們的數(shù)量；c.提供如權(quán)利要求2所述的結(jié)構(gòu)；d.以表皮細(xì)胞接種所述結(jié)構(gòu)；e.以步驟b獲得的毛囊細(xì)胞接種所述含有表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)；f.將所述結(jié)構(gòu)植入期望新毛發(fā)生長的皮膚位置。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中步驟d的細(xì)胞從人嬰兒包皮獲得。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟d的細(xì)胞補(bǔ)加了從胚胎、臍帶血液、骨髓、脂肪組織、肌肉、皮膚獲得的干細(xì)胞和任何所述細(xì)胞的組合。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟a的細(xì)胞培養(yǎng)自毛囊斷片，所述毛囊斷片選自含有真皮乳頭、真皮鞘、基質(zhì)、內(nèi)根鞘和外根鞘的斷片。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包含軟骨素-6-硫酸酯。
21.制造生物可吸收的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟a.用顆粒包被纖維b.用生物可吸收的材料的溶液包被由步驟a的顆粒所包被的纖維c.使生物可吸收的材料不溶于水；以及d.移出所述纖維和顆粒。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，還包括用第二生物可吸收的材料包被產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的步驟。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述纖維為尼龍，所述顆粒為癸二酸，且所述生物可吸收的材料為透明質(zhì)酸。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述纖維為尼龍，所述顆粒為癸二酸，所述生物可吸收的材料為透明質(zhì)酸，且所述第二生物可吸收的材料為丙交酯和乙交酯的共聚物。
25.用于骨和軟骨生長的方法，包括a.取得骨或軟骨祖細(xì)胞；b.以步驟a的細(xì)胞接種如權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)；c.將步驟b的結(jié)構(gòu)植入需要生長新的骨組織或軟骨組織的位置。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述結(jié)構(gòu)包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸。
27.如權(quán)利要求2所述的結(jié)構(gòu)包括生物可吸收的材料，所述材料選自聚(乳酸)、聚(乙二醇酸)、聚(二甲基環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(環(huán)丙烷碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(對-二噁烷酮)、聚(酯)、聚(酯-酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)，和所述聚合物的共聚物、摻合物和混合物，以及包含阻斷與另外的非降解聚合物共聚的生物可吸收的鍵的低聚物，此低聚物通過所述的生物可吸收的鍵的降解或水解作用被釋放而被代謝或排出，以及用生物可吸收的材料包被在其內(nèi)(管腔)表面上，所述材料選自纖維素衍生物、淀粉、糊精、殼聚糖、脂蛋白、重組形式的人膠原和明膠、軟骨素-6-硫酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維結(jié)合素、層粘連蛋白、白蛋白，其它血清蛋白、多糖、粘多糖和其它以天然形式或通過以下物質(zhì)的交聯(lián)作用賦予不溶性的人體天然發(fā)生的天然生物聚合物交聯(lián)試劑、蛋白質(zhì)、碳水化合物、葡萄糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丙烯酸酯)、聚(異丁烯酸酯)、聚(乙烯醇)及所述聚合物的共聚物、摻合物和混合物。
28.如權(quán)利要求27所述的結(jié)構(gòu)，其中所述材料包含丙交酯和乙交酯的共聚物。
29.如權(quán)利要求28所述的結(jié)構(gòu)，其中所述生物可吸收的結(jié)構(gòu)以氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物包被。
30.制備如權(quán)利要求2所述的結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟a.以水溶性聚合物包被逐漸變細(xì)的心軸；b.將生物可吸收的材料附著于心軸頂部；c.以膜成形生物可吸收的聚合物包被所述心軸和所述生物可吸收的材料；d.從所述結(jié)構(gòu)中移去所述心軸。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物可吸收的材料包括含有軟骨素-6-硫酸酯和交聯(lián)的明膠的纖維團(tuán)，且所述膜成形生物可吸收的聚合物含有丙交酯和乙交酯共聚物。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的支架，其被構(gòu)造用于模仿天然毛發(fā)毛囊的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還涉及特殊組合物的用途及產(chǎn)生結(jié)合了生物相容性與需要的生物可吸收速率的支架的制造方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制造擬生態(tài)的毛發(fā)毛囊移植物的方法和以細(xì)胞接種移植物并將移植物植入需要生長新毛干的皮膚的方法。本發(fā)明的又一實(shí)施方案涉及毛發(fā)增殖的方法，其中細(xì)胞在培養(yǎng)中增殖并與培養(yǎng)的角質(zhì)化細(xì)胞或其它的異源細(xì)胞聯(lián)合等分為大量生物可吸收性支架。
文檔編號A61L27/56GK1938055SQ200580009793
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者托馬斯·H·巴羅斯, 史蒂芬·A·科什漢, 布賴恩·馬歇爾 申請人:阿德蘭斯研究院有限公司