本發(fā)明是一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，屬于辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：辣椒炭疽病一般由5種病原菌引起，即紅色炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides＝gloeosporiumpiperatum)，黑色炭疽病菌(c.coccodes＝c.nigrum)、黑點炭疽病菌(c.capsici)、尖孢炭疽菌(c.acutatu)和黑線炭疽菌(c.dematium)，在湖南省以紅色炭疽菌危害為主。辣椒炭疽病主要危害葉片和果實。初侵染時呈水浸狀黃褐色圓斑，進(jìn)而發(fā)展為中央灰褐色，有同心輪紋，上生小黑點的圓型或不規(guī)則型病斑，干燥時呈現(xiàn)膜狀且易破裂。病菌侵染葉片時，初期病斑呈褪綠呈水漬狀，慢慢擴大，病斑中間灰白色，周圍褐色。在果實上，病斑表面初生為水漬狀，逐漸擴展為褐色凹陷，圓形或不規(guī)則形狀，病斑上生有黑點，為病原菌分生孢子，受害的辣椒莖病部呈不規(guī)則或梭形病斑，縱裂凹陷。在我國辣椒種植區(qū)，辣椒炭疽病是一種常發(fā)真菌性病害，辣椒染病后可引起(30-85)％產(chǎn)量損失。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明目的是提供一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，以解決上述
背景技術(shù)：
中提出的問題,本發(fā)明使用方便，便于操作，設(shè)計巧妙，提高了市場競爭力。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，包括：培養(yǎng)基制備；接種體分離；接種體鑒定；接種體保存；接種體復(fù)壯；接種孢子制備；鑒定設(shè)計；鑒定材料準(zhǔn)備；對照品種選擇；接種以及接種后管理；病情調(diào)查；抗病性評價。進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基制備包括制備水瓊脂培養(yǎng)基以及制備馬鈴薯培養(yǎng)基：在制備水瓊脂培養(yǎng)基中，以1l培養(yǎng)基為列：用5個250ml三角瓶每個裝入200ml純凈水和4g瓊脂粉然后加熱至121℃，滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆茫谥苽漶R鈴薯培養(yǎng)基中，以1l為列：稱取馬鈴薯200g，切成細(xì)條或片狀，放入鍋中蒸煮當(dāng)馬鈴薯煮至熟而不爛時，在1l量筒上用紗布過濾馬鈴薯殘渣，定容至1l，用5個250ml三角瓶每個分別加入200ml濾液、4g葡萄糖、和4g瓊脂粉然后121℃，滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆?。進(jìn)一步地，接種體分離的具體步驟為：從田間采集剛開始發(fā)病的辣椒炭疽病病果，在超凈工作臺上，用手術(shù)刀取0.5cm×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸鈉中浸泡2min，用滅菌水清洗3次后，用滅菌濾紙吸干病健塊的水分，插入倒的水瓊脂平板上，放置28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)2d，待長出菌絲后再轉(zhuǎn)接在pda平板上，獲得分離物。進(jìn)一步地，接種體鑒定的具體步驟為：將培養(yǎng)7d后的分離物在顯微鏡下進(jìn)行菌絲、孢子形態(tài)觀察，如符合辣椒炭疽病病原菌的形態(tài)特征，用ctab法提取分離物菌絲dna，經(jīng)過對獲得的dna進(jìn)行電泳分析，分離物的dna提取成功將分離物的dna進(jìn)行pcr擴增，擴增產(chǎn)物用1％瓊脂凝膠電泳檢測，將得到的rdnaits序列提交至genbank,blast進(jìn)行對比，如與辣椒炭疽病病原物的its序列具有99％的相似，即可確定是辣椒炭疽病病原菌。進(jìn)一步地，用ctab法提取分離物菌絲dna的具體步驟為：將培養(yǎng)(5～7)d的分離物，用干凈滅菌手術(shù)刀刮菌絲與一干凈滅菌的1.5ml離心管中，加500μlte緩沖液混勻，加入10％sds溶液30μl和10mg/ml蛋白酶k(pk)3μl混勻，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μlnacl(5m)混勻。加入80μlctab/nacl混勻，65℃水浴10min。加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5ml離心管。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5ml離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min。取上清至新1.5ml離心管，加入2/3體積異丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，沉淀用70％冷乙醇洗滌(輕輕來回倒置離心管)12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，55℃干燥15min。加入20～50μlte緩沖液溶解dna沉淀，用1％的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和dna，將混有上樣緩沖液的dna加至樣品孔中，用dnamaker做分子量的標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像分析儀下觀察是否提取出dna電泳帶，拍攝并記錄實驗結(jié)果，經(jīng)過對實驗結(jié)果的觀察，分離物dna提取成功，剩下的dna在-20℃保存。進(jìn)一步地，接種體保存的具體步驟為：將鑒定為辣椒炭疽病的病原菌，進(jìn)行3次單孢分離純化后，轉(zhuǎn)接于含pda斜面培養(yǎng)基的5cm冷凍離心管上，于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)3d，在斜面上加倒入一層1cm厚滅菌礦物油后置4℃或室溫保存。進(jìn)一步地，接種體復(fù)壯的具體步驟為：接種前需要進(jìn)行病原物接種體的復(fù)壯，復(fù)壯方法為：將接種體培養(yǎng)在pda培養(yǎng)基上、于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)3d，從菌絲邊緣用打孔器打0.51cm大小的菌絲塊接種在表面消毒的感病品種辣椒果實上，放入溫度為28℃、濕度為90％的人工氣候箱中光照和黑暗交替12/12h進(jìn)行培養(yǎng)，等果實發(fā)病后進(jìn)行病原菌分離。進(jìn)一步地，接種孢子制備的具體步驟為：將復(fù)壯分離后獲得的分離物轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在pda培養(yǎng)基上、于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)7d，待菌絲長滿平板后，將平板放入28℃的人工氣候箱中光照和黑暗交替進(jìn)行產(chǎn)孢，待產(chǎn)生分生孢子后，用無菌水洗下孢子，用3層滅菌的擦鏡紙過濾菌絲，制成濃度為1×105個/ml分生孢子的懸浮液供接種用。進(jìn)一步地，鑒定設(shè)計的具體步驟為：鑒定材料選擇青果或紅色成熟果，每個品種或資源材料設(shè)3-4次重復(fù)，每個重復(fù)不少于6個果，每次重復(fù)一半接種用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液1μl、一半接種的無菌水1μl。進(jìn)一步地，鑒定材料準(zhǔn)備的具體步驟為：選取形狀和成熟度一致、無病無蟲危害的健康果實，將果實用清水洗凈，晾干或在超凈工作臺上吹干，放入75％的酒精中浸泡2min，用1％次氯酸鈉溶液中浸泡2min，用無菌水洗3次，然后在超凈工作臺中晾干。進(jìn)一步地，對照品種選擇的具體步驟為：以亞蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品種pbc602和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品種茄門厚皮辣椒分別作為室內(nèi)抗病性鑒定的陽性和陰性對照品種，以各鑒定材料與對照相比的相對抗性來判定各鑒定材料的相對抗性。進(jìn)一步地，接種以及接種后管理的具體步驟為：在每個果實的中央部用微量注射器細(xì)刺破表皮后注入1μl用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液(1×105個/ml)，當(dāng)全部接種完畢后，放入鑒定室內(nèi)28℃黑暗保濕24h，以后每天光照12h，相對濕度為(80～100)％，溫度控制在28℃。進(jìn)一步地，病情調(diào)查的具體步驟為：接種后(5～7)d進(jìn)行病情調(diào)查，逐一觀察果實每一接種處的病斑擴展情形，逐個果實觀察發(fā)病情況，記載各病級病果數(shù)，并將發(fā)病結(jié)果記入。進(jìn)一步地，抗病性評價的具體步驟為：以參鑒品種的病情指數(shù)分別與對照品種的病情指數(shù)進(jìn)行比較，以3～4次重復(fù)病情指數(shù)平均數(shù)與對照病情指數(shù)進(jìn)行比較，以此作為抗性劃分依據(jù)，在辣椒炭疽病抗性鑒定中，參鑒品種應(yīng)進(jìn)行3次鑒定實驗，實驗以感病對照品種的病情指數(shù)>30，參鑒品種的空白對照的病情指數(shù)為0，即參鑒品種空白對照果實不發(fā)病，該抗性鑒定結(jié)果有效。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，通過自然誘發(fā)或人工接種等方法，將病原物直接或間接接種到寄主植株或器官上，使其發(fā)病，并依據(jù)相關(guān)的抗性評價標(biāo)準(zhǔn)，來區(qū)分品種的抗病性。具體實施方式為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，包括：培養(yǎng)基制備；接種體分離；接種體鑒定；接種體保存；接種體復(fù)壯；接種孢子制備；鑒定設(shè)計；鑒定材料準(zhǔn)備；對照品種選擇；接種以及接種后管理；病情調(diào)查；抗病性評價。培養(yǎng)基制備包括制備水瓊脂培養(yǎng)基以及制備馬鈴薯培養(yǎng)基：在制備水瓊脂培養(yǎng)基中，以1l為列：稱取瓊脂15～20g，用自來水定容到1000ml，煮沸后用量筒盛或燒杯盛培養(yǎng)基，然后分裝在三角瓶中121℃，滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆?，在制備馬鈴薯培養(yǎng)基中，以1l為列：稱取馬鈴薯200g，切成細(xì)條或片狀，放入鍋中蒸煮0.5h左右，當(dāng)馬鈴薯煮至熟而不爛時，在燒杯或量筒上用紗布過濾馬鈴薯殘渣，把收集的濾液放入洗干凈的鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂(15～20)g煮沸后用量筒盛或燒杯盛培養(yǎng)基，用自來水定容到1000ml，然后分裝在三角瓶中121℃，滅菌30min后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆谩＝臃N體分離的具體步驟為：從田間采集新鮮的辣椒炭疽病果，取0.5cm×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸鈉中浸泡2min，用滅菌水清洗3次后，用滅菌濾紙吸干病健塊的水分，用滅菌鑷子夾著病健部插入倒的水瓊脂平板上，放置28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)2d，待長出菌絲后再轉(zhuǎn)接在pda平板上，獲得分離物。接種體鑒定的具體步驟為：將培養(yǎng)7d后的分離物進(jìn)行肉眼觀察，菌落形態(tài)剛開始為橙紅色，后變?yōu)楹稚蛏罨疑?，圓形，邊緣整齊，菌落輪紋的分界線明顯，菌絲呈白色，濕度大的情況下，菌落表面溢出淡紅色孢子堆，在電子顯微鏡下觀察其分生孢子盤無剛毛，分生孢子橢圓形，無色，單胞，大小為13.5μm×4.2μm，符合紅色炭疽菌的形態(tài)特征，用ctab法提取分離物菌絲dna，經(jīng)過對獲得的dna進(jìn)行電泳分析，分離物的dna提取成功將分離物的dna進(jìn)行pcr擴增，定性pcr擴增檢測結(jié)果如表1，表2。表1檢測辣椒炭疽病的pcr引物表2檢測辣椒炭疽菌的pcr反應(yīng)體系組成加樣體積10×pcrbuffer5μldntp(10mmol/μl)1μltaqdna聚合酶(2.5u/μl)1μl引物tis4(25μmol/μl)2μl引物tis5(25μmol/μl)2μl模板dna(100/μl)1μl雙蒸水38μl總體積50μl95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂凝膠電泳檢測，按比例混勻電泳上樣緩沖液和pcr產(chǎn)物，將混有上樣緩沖液的pcr擴增產(chǎn)物加至樣品孔中，用dnamaker做分子量的標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像分析儀下觀察是否擴增出預(yù)期的特異性dna電泳帶，拍攝并記錄實驗結(jié)果。實驗結(jié)果可以看出5個分離物的its片段均在(500～750)bp之間的一條特異性擴增條帶(583bp)，與預(yù)期目的片段長度基本一致。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂凝膠電泳檢測，獲得了1條550bp左右的清晰條帶，經(jīng)測序后得到的rdnaits序列提交至genbank,blast結(jié)果表明與紅色炭疽菌的its序列99％相同。用ctab法提取分離物菌絲dna的具體步驟為：將培養(yǎng)(5～7)d的分離物，用干凈滅菌手術(shù)刀刮菌絲與一干凈滅菌的1.5ml離心管中，加500μlte緩沖液混勻，加入10％sds溶液30μl和10mg/ml蛋白酶k(pk)3μl混勻，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μlnacl(5m)混勻。加入80μlctab/nacl混勻，65℃水浴10min。加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5ml離心管。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液(25:24:1)混勻，12000r/min離心15min。取上清至新1.5ml離心管，加入等體積的氯仿/異戊醇混合液混勻，12000r/min離心5min。取上清至新1.5ml離心管，加入2/3體積異丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，沉淀用70％冷乙醇洗滌(輕輕來回倒置離心管)12000r/min離心10min。去上清，用吸水紙吸干離心管口，55℃干燥15min。加入20～50μlte緩沖液溶解dna沉淀，用1％的瓊脂糖凝膠，按比例混勻電泳上樣緩沖液和dna，將混有上樣緩沖液的dna加至樣品孔中，用dnamaker做分子量的標(biāo)記，進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)束后，在凝膠成像分析儀下觀察是否提取出dna電泳帶，拍攝并記錄實驗結(jié)果，經(jīng)過對實驗結(jié)果的觀察，分離物dna提取成功，剩下的dna在-20℃保存。接種體保存的具體步驟為：將鑒定為辣椒炭疽病的病原菌，進(jìn)行3次單孢分離純化后，轉(zhuǎn)接于含pda斜面培養(yǎng)基的5cm冷凍離心管上，于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)3d，在斜面上加一層滅菌礦物油后置4℃或室溫保存。接種體復(fù)壯的具體步驟為：接種前需要進(jìn)行病原物接種體的復(fù)壯，復(fù)壯方法為：將接種體培養(yǎng)在pda培養(yǎng)基上、于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)3d，從菌絲邊緣用打孔器打0.5cm大小的菌絲塊接種在表面消毒的感病品種辣椒果實上，放入溫度為28℃、濕度為90％的人工氣候箱中光照和黑暗交替12/12h進(jìn)行培養(yǎng)，等果實發(fā)病后進(jìn)行病原菌分離。接種孢子制備的具體步驟為：將復(fù)壯分離后獲得的分離物轉(zhuǎn)接培養(yǎng)在pda培養(yǎng)基上、于28℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)7d，待菌絲長滿平板后，將平板放入28℃的人工氣候箱中光照和黑暗交替進(jìn)行產(chǎn)孢，待產(chǎn)生分生孢子后，用無菌水洗下孢子，用3層滅菌的擦鏡紙過濾菌絲，制成濃度為1×105個/ml分生孢子的懸浮液供接種用。鑒定設(shè)計的具體步驟為：鑒定材料選擇紅色成熟果，每個品種或資源材料設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)一半接種用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液1μl、一半接種的無菌水1μl，每次重復(fù)不少于6個果。鑒定材料準(zhǔn)備的具體步驟為：選取形狀和成熟度一致、無病無蟲危害的健康果實，將果實用清水洗凈，晾干或在超凈工作臺上吹干，放入75％的酒精中浸泡2min，用1％次氯酸鈉溶液中浸泡2min，用無菌水洗3次，然后在超凈工作臺中晾干。對照品種選擇的具體步驟為：以亞蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品種pbc602和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品種茄門厚皮辣椒分別作為室內(nèi)抗病性鑒定的陽性和陰性對照品種，以各鑒定材料與對照相比的相對抗性來判定各鑒定材料的相對抗性。接種以及接種后管理的具體步驟為：在每個果實的中央部用微量注射器細(xì)刺破表皮后注入1μl用無菌水配制的病原菌分生孢子懸浮液(1×105個/ml)，當(dāng)全部接種完畢后，放入鑒定室內(nèi)28℃黑暗保濕24h，以后每天光照12h，相對濕度為(80～100)％，溫度控制在28℃。病情調(diào)查的具體步驟為：接種后(5～7)d進(jìn)行病情調(diào)查，逐一觀察果實每一接種處的病斑擴展情形，逐個果實觀察發(fā)病情況，記載各病級病果數(shù)，并將發(fā)病結(jié)果記入?？共⌒栽u價的具體步驟為：以參鑒品種的病情指數(shù)分別與對照品種的病情指數(shù)進(jìn)行比較，以3次重復(fù)病情指數(shù)平均數(shù)與對照病情指數(shù)進(jìn)行比較，以此作為抗性劃分依據(jù)，在辣椒炭疽病抗性鑒定中，參鑒品種應(yīng)進(jìn)行3次鑒定實驗，實驗以感病對照品種的病情指數(shù)>30，參鑒品種的空白對照的病情指數(shù)為0，即參鑒品種空白對照果實不發(fā)病，該抗性鑒定結(jié)果有效。作為本發(fā)明的一個實施例：本發(fā)明的一種辣椒炭疽病室內(nèi)抗性鑒定方法，通過自然誘發(fā)或人工接種等方法，將病原物直接或間接接種到寄主植株或器官上，使其發(fā)病，并依據(jù)相關(guān)的抗性評價標(biāo)準(zhǔn)，來區(qū)分品種的抗病性。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點,對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。當(dāng)前第1頁12