該發(fā)明涉及作物遺傳育種和植物病理學領域，是一種室內快速鑒定苗期向日葵黃萎病抗性的方法。
背景技術：
向日葵是一種重要的油料作物，同時它也是一種觀賞植物，并且向日葵油是一種潛在的生物能源，而向日葵黃萎病是影響向日葵產量、品質的世界性病害之一。因其土傳病害的特點致使目前沒有有效的防治措施，選育抗性品種是有效、環(huán)保、經濟并且公認的方法。目前我國向日葵的黃萎病的鑒定方法大多數采用大田人工接菌、自然發(fā)病進行鑒定，鑒定時間長(100天左右)且受環(huán)境影響大。室內快速、準確鑒定向日葵資源材料的黃萎病抗性是抗病育種的關鍵。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的：提供一種室內快速、準確鑒定苗期向日葵黃萎病抗性的方法。
本發(fā)明的技術方案：向日葵黃萎病是一種土傳真菌病害，在大田其發(fā)病一般起始于向日葵現(xiàn)蕾期，大面積發(fā)病時間隨著地塊土壤菌量、空氣濕度、溫度等環(huán)境因素變化，一般其出現(xiàn)在盛花期和成熟期之間。所以要準確鑒定向日葵黃萎病抗性，接菌量、接菌時間、環(huán)境因素(溫度、濕度、光照)是鑒定的關鍵因子。
實驗步驟如下：
1 菌培養(yǎng)PDA(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉13-15g、蒸餾水定容至1000mL)，高溫高壓滅菌(壓力升至103.4kPa(1.05kg/cm2)，溫度達121.3℃)，維持20分鐘，分裝到滅菌的培養(yǎng)皿中，并對選定的向日葵黃萎病菌進行初始培養(yǎng)。待菌斑長至3-5cm時，將其分成4-6塊，分別接菌在養(yǎng)菌缽(麥麩∶水＝5∶2體積比混勻分裝在200-300ml的有蓋塑料缽中滅菌)中，10-14天黃萎病菌可長 滿整個養(yǎng)菌缽。
2 制作接菌缽 將四層報紙制作成15×20cm大小的長方形，后沿20cm邊對折，并將對折的邊用訂書機訂好，得到一個高15cm的圓柱桶做為接菌缽。再準備一個長方形的塑料培養(yǎng)盒(20cm×30cm)，將培養(yǎng)盒底平鋪4層報紙，并將裝滿滅菌營養(yǎng)土的接菌缽擺放在培養(yǎng)盒中，每盒放6-8個接菌缽可保證調查苗量。
3 播種 將挑選好的飽滿度、大小一致的向日葵種子用70％的酒精浸泡5分鐘，再用0.1％升汞深度滅菌8-10分鐘，后用無菌水沖洗三次。將無菌的向日葵種子播種在接菌缽中，播種深度2-3cm，每缽播種10-12粒，在營養(yǎng)盒中注入燒開后冷卻的自來水(每缽50-100ml)，后將其培養(yǎng)在28/25℃(晝/夜)、光照16小時黑暗8小時的光照培養(yǎng)箱中，每天定時澆水1-2次，保持接菌缽表面土壤濕潤為宜，一個星期后可出苗，出苗后保留每缽5-6株整齊一致的向日葵幼苗待用。
4 接菌 待向日葵幼苗長至2片真葉平展時，接種向日葵黃萎病菌孢子懸浮液(孢子含量2×106個/ml)50ml。接菌時期是影響室內鑒定苗期向日葵黃萎病抗性準確性的關鍵因素之一，接菌太早，因向日葵幼苗根不夠長而致使接菌不均勻；接菌太晚會導致向日葵在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時間太長，因其不適應室內條件而徒長。向日葵幼苗長至2片真葉平展時(約2個星期)為適宜時期。接菌量也是室內鑒定的關鍵因素之一，向日葵黃萎病菌液孢子含量一般選擇2×106-10×106個/ml，但是優(yōu)選濃度為2×106個/ml孢子懸浮液50ml為宜，該濃度和接菌量可促使向日葵黃萎病菌孢子均勻分布在整個接菌缽內。
5 統(tǒng)計分析 接菌2周后，向日葵開始發(fā)病，一般第3周是向日葵黃萎病發(fā)病盛期，調查供試品種總葉片數和發(fā)病葉片數，病葉變色的程度、葉片是否有脫落、卷枯等，并用改進的5級分級標準(表1)進行分級統(tǒng)計，計算調查品種的病情指數。最后將每一處理的三次重復數據進行平均。不同向日葵品種的抗性級 別劃分標準見表2。
表1 向日葵黃萎病病情指數劃分標準
表2 向日葵品種對黃萎病抗性水平的劃分標準
6 特點
(1)向日葵幼苗苗齡一致 作為接菌對象的向日葵幼苗的整個生長過程全部在光照培養(yǎng)箱中完成。且采用相對較小無底紙缽培養(yǎng)向日葵幼苗，這樣保證了用于實驗的向日葵種子在播種后生長條件相同一致，保證可向日葵幼苗在同一天破土，生長整齊一致，為了排除試驗材料本生影響，對每缽實驗材料進行人工篩選，綜上所述，在該方法下鑒定的同一向日葵品種的所有幼苗的妙齡是一樣的。
(2)感菌均勻 采用無底營養(yǎng)土紙缽接菌，蘸菌法保證了根部完全均勻的接觸到菌液，50ml的接菌量使得每個幼苗充分且均勻接觸到病原菌，2×106個/ml 濃度的菌液是參考前人的工作和我們多年實驗得出的實驗值，以上條件下促使該方法下每個向日葵幼苗均勻感菌。
(3)統(tǒng)計科學 很多病情指數的劃分是以統(tǒng)計病株數和總株數為計算基礎數據，而我們采用統(tǒng)計表現(xiàn)出黃萎病的病葉和總葉數為統(tǒng)計基礎數據，這樣的統(tǒng)計更加準確、科學，可操作性更強，使得計算得出的病情指數和實際情況更加相符。
(4)快速準確 和大田病圃鑒定方法相比，該方法的更加快速、簡捷、可重復性強，病圃鑒定一年一般鑒定一批樣品，而該方法可一般1個月鑒定結果就可得到，并且不收外界環(huán)境影響，只要實驗需要隨時都可進行。
(5)經濟環(huán)保 實驗用的紙缽可用廢舊的報紙或書紙等制作(本試驗用的是廢報紙)，營養(yǎng)土可用蛭石和沙土自己根據實際需要配置(大概比例：蛭石∶沙土，6∶4)，菌培養(yǎng)基使用麥麩和水按5∶2體積混合制成，更加節(jié)約成本，且其滅菌后還可作為肥料。