本發(fā)明涉及植物抗逆生理學(xué)，具體涉及半野生棉萌發(fā)期對(duì)鈉鹽抗性鑒定方法。
背景技術(shù)：
：半野生棉(semi-wildcotton)是陸地棉野生種系，共7個(gè)：闊葉棉(latifolium)、帕默爾棉(palmeri)、瑪利加郎特棉(marie-galante)、雷奇蒙地棉(richmondi)、尤卡坦棉(yucatanese)、莫利爾棉(morrilli)和尖斑棉(punctatum)。半野生棉原產(chǎn)地主要在墨西哥，少量在巴西，其種類劃分依據(jù)主要是自然分布的地理位置和形態(tài)主體特征，每個(gè)種系又包含多個(gè)變異類型。半野生棉是陸地棉的原始類型，未經(jīng)人工馴化過(guò)，由于其特殊的地理位置和多變的氣候條件，相較于經(jīng)過(guò)人工和自然雙重選擇壓力的栽培品種，半野生棉具有豐富的遺傳多樣性，含有多種優(yōu)良基因，包括抗病蟲、耐干旱、耐鹽堿、纖維高強(qiáng)等，同時(shí)因?yàn)殛懙孛抟吧N系與栽培品種在遺傳上具有親和性，容易雜交成功，因此具有極其重要的潛在應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)如今關(guān)于棉花抗鹽性的研究大多集中栽培棉(cultivatedcotton)的抗鹽性的研究上，然而我國(guó)并不是棉花的起源地，對(duì)我國(guó)陸地棉栽培種的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)育種資源多來(lái)自岱字棉等少數(shù)幾個(gè)陸地棉種質(zhì)資源材料，從而導(dǎo)致很難擁有遺傳多樣性豐富的群體來(lái)進(jìn)行抗鹽性篩選。同時(shí)現(xiàn)在栽培棉NaCl萌發(fā)期抗性的研究上大田中多采用0.5％NaCl溶液、0.4％地下咸水溶液或者直接用海水進(jìn)行脅迫，實(shí)驗(yàn)室中的栽培棉鑒定時(shí)150mMNaCl為適宜鹽脅迫濃度、200mMNaCl為極限濃度，存在有脅迫濃度低、脅迫成分不確切等，不足以鑒定具有抗性多樣性的半野生棉材料，而且進(jìn)行鹽池鑒定則存在鹽分分布不均勻、受環(huán)境影響大、鑒定周期長(zhǎng)(45天左右)等缺點(diǎn)，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。因此，探索一種適合半野生棉萌發(fā)期抗鹽性的方法以迅速準(zhǔn)確的篩選出高抗鹽的半野生棉材料，可以加快栽培棉的抗鹽性遺傳改良，具有實(shí)踐利用價(jià)值和意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供半野生棉萌發(fā)期鈉鹽抗性鑒定方法，用來(lái)彌補(bǔ)針對(duì)半野生棉材料抗鹽性鑒定時(shí)方法的不足，以期能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)棉花半野生種質(zhì)資源的進(jìn)行客觀鑒定，為棉花抗鹽性遺傳改良提供依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的半野生棉萌發(fā)期鈉鹽抗性鑒定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：1)對(duì)半野生棉種子進(jìn)行均一化處理：首先是對(duì)選定的半野生棉材料進(jìn)行濃硫酸脫絨，清水沖洗干凈之后，次氯酸鈉消毒，然后置40烘箱中加熱干燥24h以打破種子休眠，在種子珠孔端切剝一小口，露出種仁即可。由于半野生棉材料的收集與保藏不易，針對(duì)不同年份的半野生棉材料，采用此種方法處理之后的半野生棉材料種子可以保持在萌發(fā)前的狀態(tài)是一致的，避免了因?yàn)槟承┎牧献陨硖禺愋詫?duì)萌發(fā)狀態(tài)造成的影響，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)過(guò)此類情況如尖斑棉6，在未進(jìn)行切剝處理時(shí)，發(fā)芽率幾乎為零，處理后發(fā)芽率達(dá)到了90％以上；2)制備鹽脅迫基質(zhì)：采用粒徑為0.05-0.80mm的沙子，清水洗凈后高溫滅菌，以100g沙子：16ml鹽液的比例加入鹽濃度250mM的NaCl溶液，混勻后做為發(fā)芽基質(zhì)。這樣可以固定沙床含水量為恒定16％。此種方法選用的為250mMNaCl濃度，高于栽培棉鑒定鹽濃度，是專門針對(duì)半野生棉的抗性多樣性進(jìn)行的設(shè)計(jì)，可以準(zhǔn)確鑒定出高抗鹽性的半野生棉材料，在之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用200mM的鹽作為脅迫濃度，半野生棉材料會(huì)出現(xiàn)多個(gè)材料鹽害率極低且極為接近的現(xiàn)象；3)播種并培育棉苗：采用12cm*19cm*13cm發(fā)芽盒，把步驟2)基質(zhì)放入發(fā)芽盒中，把種子均勻放入發(fā)芽盒中后，再覆上一層基質(zhì)即可，置于溫度28℃，濕度85％，光照12h，黑暗12h的條件下，發(fā)芽并培養(yǎng)14d。此種方法可以保持每個(gè)材料在發(fā)芽盒中的狀態(tài)的一致性，杜絕了因?yàn)橥饨绛h(huán)境變化所引起的鑒定錯(cuò)誤的發(fā)生；4)統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析：待生長(zhǎng)至14d時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，調(diào)查每一株棉苗的鹽害情況，并評(píng)價(jià)每株棉苗的鹽害指數(shù)，評(píng)價(jià)半野生棉材料的抗性水平。本發(fā)明為半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、半野生棉材料萌發(fā)狀態(tài)一致：通過(guò)均一化處理之后的半野生材料可以達(dá)到初始萌發(fā)狀態(tài)的一致性，有利于棉花出苗整齊一致，而且材料和沙子經(jīng)過(guò)前期滅菌處理，避免了細(xì)菌的干擾，實(shí)驗(yàn)中對(duì)照材料出苗均勻一致，根系發(fā)育完整，萌發(fā)期一致，保證了鑒定的準(zhǔn)確性。2、專門為半野生棉材料選定的適合半野生棉抗性多態(tài)性的鹽濃度250mM，相較于大田栽培種鑒定用0.4％的鹽分和溫室栽培種鑒定200mMNaCl高了很多，適合具有抗性多樣性的半野生棉材料鑒定。3、該方法不受季節(jié)控制，鑒定周期短，可短時(shí)間鑒定半野生棉材料的抗鹽性。半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，鑒定周期為14d，播種后第14d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，統(tǒng)計(jì)每株棉苗的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行評(píng)分。較大田鹽池鑒定(45d左右)縮短30d，可快速進(jìn)行半野生棉材料萌發(fā)期抗鹽性篩選，為加速抗逆育種提供技術(shù)支持。4、投入的人力物力小，省工又經(jīng)濟(jì)。半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，可以在溫室之內(nèi)進(jìn)行鑒定，使用商品河沙、分析純?cè)噭┖头N子發(fā)芽盒，而且都是經(jīng)過(guò)高溫消毒，省去大量的人力和物力的投入，可進(jìn)行大批量材料的鑒定；易于推廣和利用。具體實(shí)施方式實(shí)施例1采用萌發(fā)期單鹽NaCl脅迫處理，對(duì)半野生棉(闊葉棉40、闊葉棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉85)以及栽培棉(中棉所12、中棉所16、鄂荊1號(hào)、海7124)的抗鹽水平進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)。1、棉花材料：半野生棉(闊葉棉40、闊葉棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉85)，栽培種鄂荊1號(hào)，海7124，栽培棉敏鹽對(duì)照材料中棉所12、栽培棉耐鹽對(duì)照材料中棉所16。2、半野生棉種子進(jìn)行均一化處理：對(duì)選定的半野生棉材料進(jìn)行濃硫酸脫絨，洗凈晾干后，再用NaClO消毒處理種子，洗凈晾干后，置40℃烘箱24h打破種子休眠，選擇籽粒飽滿成熟的種子，用單面刀片在種子合點(diǎn)端(鈍端)切小口，大小1mm×1mm，種殼切破露出種仁即可。3、制備鹽脅迫基質(zhì)：選擇直徑為0.05-0.80mm的沙子，清水洗滌至不渾濁，晾干后180℃，2h高溫滅菌；稱量試驗(yàn)所需的沙子重量，按照質(zhì)量比100g沙子：16ml水的比例計(jì)算所需水量，按照用水量進(jìn)行計(jì)算所需鹽分，進(jìn)而用無(wú)菌水配制250mM的NaCl鹽溶液，把配制好的鹽溶液加入到稱量好的沙子中，混勻后作為鹽脅迫培養(yǎng)基質(zhì)；對(duì)照基質(zhì)按照質(zhì)量比16％(水/干沙子)加入無(wú)菌水，混勻作為對(duì)照培養(yǎng)基質(zhì)；4、播種并培育棉苗：首先在發(fā)芽盒下層鋪合適厚度的沙子約10-15mm，種子均勻播在濕沙上，加蓋10-15mm濕沙，每盒播種6行，每行5粒，每?jī)尚幸粋€(gè)材料(或重復(fù))，蓋上蓋子，置于溫度28℃，濕度85％，光照12h，黑暗12h的條件下，培養(yǎng)14d；按同樣的方法設(shè)置對(duì)照組。5、統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析：播種后14d統(tǒng)計(jì)每一個(gè)半野生棉材料的出苗率以及針對(duì)每一株棉苗進(jìn)行評(píng)分。對(duì)每一株棉苗進(jìn)行客觀分級(jí)評(píng)分是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。根據(jù)出苗率和評(píng)分結(jié)果對(duì)半野生棉抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行傷害評(píng)分：然后計(jì)算材料的相對(duì)鹽害率。0分-未萌發(fā)種子；1分-株高為對(duì)照的50％以下，種子剛破土、未破殼；2分-株高為對(duì)照的50％～70％，子葉邊緣卷曲；3分-株高為對(duì)照的70％～100％，子葉卷曲、發(fā)黃；4分-株高與對(duì)照處理相當(dāng)，棉苗正常生長(zhǎng)，子葉展開。相對(duì)鹽害率計(jì)算公式為：得分率＝∑fx/(4n)，f為該級(jí)別的株數(shù)，x為相應(yīng)級(jí)別的分值，n為播種數(shù)。結(jié)果見表2:表1萌發(fā)期耐鹽性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別相對(duì)鹽害率(％)耐鹽性10.0～20.0高耐220.1～40.0耐340.1～60.0中耐460.1～80.0中敏580.1～100.0敏感表2：半野生棉抗鹽性水平評(píng)價(jià)結(jié)果當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3