本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種玉米煙嘧磺隆抗感分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是我國(guó)重要的糧食作物之一。目前，我國(guó)人均耕地只有0.093公頃，隨著生產(chǎn)糧食的土地和淡水資源的減少，糧食供應(yīng)安全問題日益凸顯。除草劑煙嘧磺隆在玉米的生產(chǎn)中，具有使用最廣，安全最高，用量最少，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣受農(nóng)民和育種家的喜愛。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的玉米自交系和雜交種對(duì)煙嘧磺隆敏感，嚴(yán)重影響了正常的玉米育種和生產(chǎn)。

玉米煙嘧磺隆的敏感性受隱性單基因nsfy控制，其抗性受顯性單基因nsfy控制。在傳統(tǒng)育種中篩選玉米煙嘧磺隆抗性材料需要大規(guī)模的田間選擇，工作量大，效率低，難以滿足現(xiàn)在的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長(zhǎng)期研究與探索，提供了一種玉米煙嘧磺隆敏感、抗性的兩個(gè)分子標(biāo)記，兩個(gè)標(biāo)記的長(zhǎng)度分別為為277bp和261bp，都位于玉米5號(hào)染色體nsfy基因內(nèi)；通過分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測(cè)玉米品種或自交系中是否具有煙嘧磺隆抗性基因，以加快玉米煙嘧磺隆抗性品種的選育進(jìn)程。由于采用了專用的玉米煙嘧磺隆敏感和抗性的分子標(biāo)記，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了玉米煙嘧磺隆抗性品種或自交系的選擇效率和質(zhì)量，開發(fā)了實(shí)效性分子標(biāo)記，研制玉米煙嘧磺隆感性分子輔助育種體系，可以程序化應(yīng)用于育種實(shí)踐。

發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下:

本發(fā)明所獲得的玉米煙嘧磺隆敏感分子標(biāo)記位于玉米煙嘧磺隆敏感基因nsfy內(nèi)；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述；

玉米煙嘧磺隆抗性分子標(biāo)記位于玉米煙嘧磺隆抗性基因nsfy內(nèi)；其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述；

上述兩個(gè)分子標(biāo)記根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中基因nsfy中的SNP位點(diǎn)由本發(fā)明的發(fā)明人首次開發(fā)獲得的；

獲得上述兩個(gè)分子標(biāo)記后，可利用該分子標(biāo)記檢測(cè)玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆抗性的基因nsfy，其具體步驟為：

(1)檢測(cè)玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆敏感基因nsfy：

利用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)植株的葉片DNA，獲得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用AvaII專一酶酶切后檢測(cè)是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；

判定標(biāo)準(zhǔn)為：具有玉米煙嘧磺隆敏感的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:1所述的277bp的電泳帶；不具有玉米煙嘧磺隆敏感的品種或自交系中該片段不會(huì)切除，所以不會(huì)出現(xiàn)；

為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計(jì)了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；

反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

(2)檢測(cè)玉米煙嘧磺隆品種或自交系中是否含有煙嘧磺隆抗性的基因nsfy：

利用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)植株的葉片DNA，獲得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，之后利用BclI專一酶酶切后檢測(cè)是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述的片段；

判定標(biāo)準(zhǔn)為：具有玉米煙嘧磺隆抗性的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:5所述的261bp的電泳帶；不具有玉米煙嘧磺隆抗性的品種或自交系中該片段不會(huì)切除，所以不會(huì)出現(xiàn)；

為了配合該分子標(biāo)記，發(fā)明人設(shè)計(jì)了其特異性引物，其

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；

反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

通過特異性引物的擴(kuò)增，以及對(duì)產(chǎn)物的酶切結(jié)果進(jìn)行判定，即可判定該位點(diǎn)是否含有玉米煙嘧磺隆敏感、抗性基因，故而即可獲知待測(cè)玉米品種或品系是否具有煙嘧磺隆敏感、抗性表型，從而可以更好的育種并應(yīng)用于品種改良。

綜上所述，本發(fā)明人首次提供了一種玉米煙嘧磺隆抗感分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于玉米5號(hào)染色體的nsfy基因上；通過該分子標(biāo)記的應(yīng)用，可以檢測(cè)玉米品種或自交系中是否含有玉米煙嘧磺隆敏感、抗性基因，以加快玉米煙嘧磺隆抗性品種的選育進(jìn)程，由于采用了專用的煙嘧磺隆敏感、抗性分子標(biāo)記，不僅篩選快速精準(zhǔn)，不受環(huán)境影響，選擇目標(biāo)明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了玉米煙嘧磺隆抗性品種或品系的選擇效率和質(zhì)量。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對(duì)玉米煙嘧磺隆敏感自交系和玉米煙嘧磺隆抗性自交系的酶切驗(yàn)證結(jié)果電泳灰度圖，

圖中可知，玉米煙嘧磺隆敏感自交系經(jīng)過酶切后出現(xiàn)了277bp的電泳帶，而玉米煙嘧磺隆抗性自交系則沒有出現(xiàn)；

圖2為利用本發(fā)明所述的分子標(biāo)記和判定方法對(duì)玉米煙嘧磺隆敏感自交系和玉米煙嘧磺隆抗性自交系的酶切驗(yàn)證結(jié)果電泳灰度圖，

圖中可知，玉米煙嘧磺隆抗性自交系經(jīng)過酶切后出現(xiàn)了261bp的電泳帶，而玉米煙嘧磺隆敏感自交系則沒有出現(xiàn)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

實(shí)施例1玉米煙嘧磺隆抗性相關(guān)分子標(biāo)記的應(yīng)用

1.玉米的葉片DNA提取

采用常規(guī)技術(shù)提取玉米葉片DNA；

2.目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

PCR擴(kuò)增：其PCR擴(kuò)增體系為20μL

擴(kuò)增條件：

通過上述擴(kuò)增即可獲得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR產(chǎn)物專一酶切：

酶切體系10μL:

專一酶BclI：0.3μL

PCR產(chǎn)物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中添加0.3μL BclI專一酶(市場(chǎng)購(gòu)得)，50℃水浴2h。然后將酶切體系放置65℃5min；

將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為294bp，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，具有煙嘧磺隆抗性基因nsfy的品種或自交系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:5所述的261bp的電泳帶；不具有煙嘧磺隆抗性基因nsfy的品種或自交系中該片段未被切掉，無(wú)該片段；如圖2所示。

實(shí)施例2玉米煙嘧磺隆敏感相關(guān)分子標(biāo)記的應(yīng)用

1.玉米的葉片DNA提取，

采用常規(guī)技術(shù)提取玉米葉片DNA；葉片分別來(lái)源于玉米煙嘧磺隆抗性自交系和玉米煙嘧磺隆敏感自交系；

2.目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)增

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

PCR擴(kuò)增：其PCR擴(kuò)增體系為20μL

擴(kuò)增條件：

通過上述擴(kuò)增即可獲得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

PCR產(chǎn)物專一酶切：

酶切體系10μL:

專一酶AvaII：0.3μL

PCR產(chǎn)物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中添加0.3μL AvaII專一酶(市場(chǎng)購(gòu)得)，37℃水浴2h。然后將酶切體系放置65℃5min。

將上述擴(kuò)增產(chǎn)物分別在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小為295bp，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，具有煙嘧磺隆敏感基因nsfy的品種或品系中出現(xiàn)如SEQ ID NO:1所述的277bp的電泳帶；不具有煙嘧磺隆敏感基因nsfy的品種或品系中該片段未被切掉，無(wú)該片段；如圖1所示。