玉米紋枯病抗病相關(guān)基因grmzm2g169240及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個玉米抗紋枯病相關(guān)基因GRMZM2G169240的功能驗證和應(yīng)用，利用強(qiáng)啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將GRMZM2G169240基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花11，GRMZM2G169240基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明GRMZM2G169240基因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】玉米紋枯病抗病相關(guān)基因GRMZM2G169240及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一個玉米紋枯病抗病相關(guān)基因GRMZM2G169240及其功能驗證，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GRMZM2G169240基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)。
【背景技術(shù)】
[0002]植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果:(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
[0003]植物的抗病反應(yīng)是多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過程。參與植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類:(I)抗病基因，又稱R (resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
[0004]根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認(rèn)識，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996，Science274:2060-2063 ；Baker 等，1997，Science276:726-733 ;Jia 等，2000，EMBOJ.19:4004-4014 ；Dangl 和 Jones, 2001, Nature411:826-833 ;Nimchuk 等,2001, Curr.0pin.Plant Biol.4:288-294)。抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制:(I)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大約40個；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
[0005]抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參與信號傳導(dǎo)或參與防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高`或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26:403-410 ；Schenk 等，2000，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science inChina45:449-467)。目前，人們對抗病相關(guān)基因的認(rèn)識有限。根據(jù)已有報道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨作用時的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源:(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參與的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。
[0006]植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長期以來研究者們對這兩大類抗病反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968, DiseaseResistance in Plants, Academic, New York)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性(Ou 等，1975,Phytopathology65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet, 1979, Annu.Rev.Phytopathol.1:203-222)。質(zhì)量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。數(shù)量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus,QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無病原特異性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice BlastDisease, Zeigler 等編著，CAB International, Cambridge, UK, pp.245-265)。目前，人們對植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如水稻抗白葉枯病 QTL (Li 等，1999，Mol.Gen.Genet.261:58-63),抗稻瘟病 QTL (Wang 等，1994，Geneticsl36:1421-1434 ；Chen 等，2003, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOO:2544-2549)、抗紋枯病 QTL (Li 等，1995, Theor.Appl.Genet.91:382-388)和抗病毒病 QTL (Albar 等，1998，Theor.Appl.Genet.97:1145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用于植物抗病性的改良。
[0007]近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對應(yīng)，提示這些抗病相關(guān)基因可能就是相對應(yīng)的QTL?？共∠嚓P(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對應(yīng)這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻(Xiong等，2002，中國科學(xué)45:518-526 ;Ramalingam 等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.16:14-24 ；ffen 等，2003，Mol.Gen.Genomics269:331-339 ；Chu 等，2004， Mol.Gen.Genomics271:111-120)、小麥(Faris 等，1999，Theor.Appl.Genet.98:219_225)、豆類(Geffroy 等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13:287-296)和馬鈴薯(Trognitz 等，2002, Mol.Plant-MicrobeInteract.15:587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依據(jù)。
[0008]玉米和水稻是世界上重要的糧食作物，但紋枯病常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，并且玉米和水稻紋枯病菌可以互相侵染。因此，了解紋枯病的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良玉米和水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來的損失。分離克隆抗病相關(guān)基因是對玉米和水稻抗病機(jī)理研究的前提。同時，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行玉米和水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。因此如何利用玉米抗病基因的克隆獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一個從玉米中分離克隆出的抗病相關(guān)基因GRMZM2G169240完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用其改良玉米和水稻抵御病害的能力，其基因的序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。GRMZM2G169240基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，可見采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對由紋枯病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
[0010]發(fā)明人首先提供了一個從玉米中分離克隆出的抗病相關(guān)基因GRMZM2G169240完整編碼區(qū)段的DNA片段，其基因的序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0011]獲得了這一片段之后，將其與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)GRMZM2G169240基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明GRMZM2G169240基因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用，因此證實了超量表達(dá)該基因后可以賦予植物對由紋枯病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
[0012]該基因片段來源于玉米B73，其通過特殊設(shè)計的引物擴(kuò)增玉米B73cDNA獲得，其中所述的引物包括引物1，5^ -ATGGCTGTCGGCGTCGCA-3'其序列如序列表SEQ ID N0.3所示，引物2，5' -CTAGAACTTGTTGTTGTACCAGTA-3'其序列如序列表SEQ ID N0.4所示，之后利用強(qiáng)啟動子驅(qū)動原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將GRMZM2G169240基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花11。GRMZM2G169240基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明GRMZM2G169240基因在水稻抗紋枯病中可以發(fā)揮重要作用，如利用超量表達(dá)獲得的轉(zhuǎn)基因植株對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)。
[0013]之所以采用上述的方法，主要是由于將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個抗性基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列。而抗病相關(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種不能植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問題的前提。
[0014]綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國際上首次驗證了一個玉米抗病相關(guān)基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對由紋枯病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為接種紋枯病菌YWK62和YWK196后GRMZM2G169240基因的表達(dá)檢測；
[0016]結(jié)果表明，接種紋枯病菌后GRMZM2G169240被誘導(dǎo)表達(dá)，隨著接種時間的延長表達(dá)逐漸升高，在24h達(dá) 到峰值；
[0017]圖2為GRMZM2G169240超量表達(dá)Tl代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種紋枯病菌YWK1967天后結(jié)果不?、灰度圖；
[0018]圖3為圖2中結(jié)果的柱狀圖；
[0019]圖中，超量表達(dá)Tl代遺傳轉(zhuǎn)化植株(pCXUN::GRMZM2G169240-7、9和10)接種紋枯病菌PX0997天后形成的病斑明顯比水稻品種中花11 (WT)的短；
[0020]中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0022]實施例1GRMZM2G169240基因接種紋枯病菌后的表達(dá)模式
[0023]為了檢測GRMZM2G169240基因受紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)模式，利用qRT_PCR檢測了這個基因接種病原菌后的表達(dá)，所用引物為引物3，5' -CGCTTCTTGGAGAGTACTACATGTTC-3 '其序列如序列表SEQ ID N0.5所示，引物4，5' -CGGGCTCAACGTAGATGCA-3'其序列如序列表 SEQ ID N0.6 所示。
[0024]分析結(jié)果表明，GRMZM2G169240基因能夠受YWK196和YWK62的誘導(dǎo)(如圖1所示)，說明其基因參與了玉米對紋枯病的抗性反應(yīng)。
[0025]實施例2:分離克隆GRMZM2G169240基因
[0026]發(fā)明人根據(jù)數(shù)據(jù)庫GRMZM2G169240基因序列設(shè)計引物(引物1，5 ' -ATGGCTGTCGGCGTCGCA-3 '其序列如序列表 SEQ ID N0.3 所示，引物 2，5 ' -CTAGAACTTGTTGTTGTACCAGTA-3 '其序列如序列表 SEQ ID N0.4 所示)用來獲得GRMZM2G169240基因。提取玉米B73RNA并通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0027]反應(yīng)程序如下:預(yù)變性94°C5min，變性94°C40s，退火54°C40s，延伸72°C 1.5min，反應(yīng)35個循環(huán)，后延伸72°C 7min ；
[0028]結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片段連接至載體PGEM-T中(Promega公司)，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序由華大基因完成，獲得長度為1426bp的GRMZM2G169240片段，具有序列表SEQ IDN0.1的DNA序列ο
[0029]實施例3:GRMZM2G169240基因的功能驗證
[0030]將上述純化的cDNA片段通過TA克隆連入超量表達(dá)載體pCXUN，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5 a感受態(tài)細(xì)胞后對重組子進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組子中包含有與目的片段大小相同的條帶。將鑒定好的重組子擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測序后與原序列比對，連入的片段為全長cDNA并且沒有堿基突變和缺失，證明GRMZM2G169240超量表達(dá)載體pCXUN::GRMZM2G16924 0 構(gòu)建成功。
[0031]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang,Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice,2005, Plant CellRep.23 =540-547)將超量表達(dá)載體導(dǎo)入水稻品種中花11。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為pCXUN::GRMZM2G169240。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)化植株20株，其中陽性植株為11株。分別對Tl代3個轉(zhuǎn)基因株系pCXUN::GRMZM2G169240-7、9、10的10個單株進(jìn)行玉米紋枯病菌的接種鑒定。結(jié)果表明，接種紋枯病菌YWK1967天后，超量表達(dá)GRMZM2G169240的轉(zhuǎn)基因植株與野生相比平均病斑縮短了 1.61cm、4.71cm和3.86cm (表1，圖2和3所示)，說明GRMZM2G169240參與了水稻對紋枯病的抗性反應(yīng)，可見玉米抗紋枯病相關(guān)基因GRMZM2G169240在作物改良提高對紋枯病抗性中可以得到廣泛的應(yīng)用。
[0032]表1GRMZM2G169240超量表達(dá)植株接種YWK1967天后的病斑長度
【權(quán)利要求】
1.一種玉米抗紋枯病相關(guān)基因GRMZM2G169240，其特征在于:其基因序列如SEQ IDN0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的玉米抗紋枯病相關(guān)基因GRMZM2G169240在作物改良提高對紋枯病抗性中的應(yīng)用。`
【文檔編號】A01H5/00GK103820469SQ201410104984
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】丁新華, 儲昭輝, 李寧 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)