西葫蘆zymv顯性抗病基因zymv-1的連鎖分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I的連鎖 分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西葫蘆是全球范圍內(nèi)普遍栽植的重要蔬菜之一，在我國的栽培面積逐年增加，特 別是近年來保護(hù)地設(shè)施栽培發(fā)展迅速，已成為保護(hù)地中繼黃瓜之后的第二大栽培作物。對 農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及豐富人民的菜籃子有著重要意義。
[0003] 小西葫蘆黃化花葉病毒?。▃ucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是目前危害西 葫蘆等葫蘆科作物生產(chǎn)的主要病害之一。ZYMV在世界范圍內(nèi)傳播蔓延迅速，近年來在我國 西葫蘆生產(chǎn)中的危害日趨嚴(yán)重和廣泛（劉衛(wèi)榮等，2008)。植株感染ZYMV后會產(chǎn)生花葉、植 株矮化畸形，果實(shí)表面瘤狀凸凹不平、果肉僵硬且味苦澀等癥狀，使果實(shí)失去商品價(jià)值，導(dǎo) 致產(chǎn)量損失達(dá)60%以上，嚴(yán)重者甚至絕產(chǎn)（Zechmann et al.，2003;劉衛(wèi)榮等，2008)。
[0004] 目前還沒有防治該病毒病的有效試劑，培育和推廣抗病品種是防治ZYMV最經(jīng)濟(jì)、 安全、有效的措施。但目前，抗病基因主要來源于野生南瓜材料，存在抗性性狀轉(zhuǎn)育困難，不 利性狀連鎖累贅，傳統(tǒng)抗病接種鑒定方法受環(huán)境和人為操作因素影響大，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性 和穩(wěn)定性不高，導(dǎo)致抗病育種效率低、周期長、抗病品種少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)需要。緊密連 鎖的分子標(biāo)記可以加速抗病育種進(jìn)程及提高選擇的準(zhǔn)確性，是分子標(biāo)記輔助選擇育種的必 要條件。但目前還沒有與西葫蘆ZYMV抗病基因緊密連鎖分子標(biāo)記的研究報(bào)道。因此，開發(fā) 與西葫蘆ZYMV抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對于提高西葫蘆抗病育種效率，拓展抗病基 因應(yīng)用范圍，保障西葫蘆的健康生產(chǎn)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I的連鎖分子標(biāo)記及其 應(yīng)用，可快速準(zhǔn)確地檢測抗性性狀轉(zhuǎn)育后代植株是否具有ZYMV-I抗病基因，為ZYMV抗病品 種的選育提供了保障，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] 西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I的連鎖分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為ZY-138和 ZY-157 ；
[0008] 所述的分子標(biāo)記ZY-138 :
[0009] 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，
[0010] 右端引物序列為SEQ ID NO. 2，
[0011] 擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp，此分子標(biāo)記來自西葫蘆自交系BS12染色體，為共顯性分子標(biāo) 記，利用Mapmaker/EXP3. 0測得與抗病基因 ZYMV-I的遺傳距離為0. 4cM ;
[0012] 所述的分子標(biāo)記ZY-157 :
[0013] 左端引物序列為SEQ ID NO. 3，
[0014] 右端引物序列為SEQ ID NO. 4，
[0015] 擴(kuò)增產(chǎn)物為97bp，此分子標(biāo)記來自西葫蘆自交系BS12染色體，為共顯性分子標(biāo) 記，利用Mapmaker/EXP3. 0測得與抗病基因 ZYMV-I的遺傳距離為2. 6cM。
[0016] 獲得西葫蘆抗ZYMV病毒病基因 ZYMV-I的分子標(biāo)記的方法，包括：以西葫蘆自交系 BS3和BS12分別作為感病和抗病親本配制F2代分離群體，用584對SSR引物篩選與西葫 蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I連鎖的分子標(biāo)記，得到2個(gè)分布在抗病基因兩側(cè)的共顯性分 子標(biāo)記 ZY-138 和 ZY-157。
[0017] 西葫蘆ZYMV抗病基因 ZYMV-I的分子標(biāo)記方法，用以下的任意一對分子標(biāo)記引物 PCR擴(kuò)增待檢測西葫蘆基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0018] 1)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記ZY-138 :
[0019] 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，
[0020] 右端引物序列為SEQ ID NO. 2，
[0021] 2)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記ZY-157 :
[0022] 左端引物序列為SEQ ID NO. 3，
[0023] 右端引物序列為SEQ ID NO. 4，
[0024] 如果用引物SEQ ID NOl和SEQ ID NO. 2, ZY-138能夠擴(kuò)增出150bp的擴(kuò)增片段， 或者用引物SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4, ZY-157能夠擴(kuò)增出97bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著 待檢西葫蘆存在抗ZYMV的基因 ZYMV-I。
[0025] 所述的分子標(biāo)記可以應(yīng)用在西葫蘆種質(zhì)資源中ZYMV抗病基因的鑒定和轉(zhuǎn)育中。
[0026] 本發(fā)明的有益效果為：
[0027] 1、在西葫蘆自交系BS12中鑒定了一個(gè)ZYMV抗病基因 ZYMV-1。
[0028] 2、獲得與西葫蘆ZYMV抗病基因 ZYMV-I緊密連鎖的共顯性分子標(biāo)記ZY-138和 ZY-157,分布在抗病基因兩側(cè)，與抗病基因的遺傳距離分別為0. 4cM和2. 6cM。利用獲得的 分子標(biāo)記能夠通過輔助選擇鑒定將抗病基因成功導(dǎo)入其它西葫蘆感病優(yōu)良自交系，使之獲 得抗病性狀。
[0029] 3、鑒定方便，分子標(biāo)記具有擴(kuò)增穩(wěn)定、檢測方便、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，用標(biāo)記ZY-138 和ZY-157檢測西葫蘆抗病基因 ZYMV-I，可以確定抗病基因是否存在以及存在狀態(tài)，并預(yù)測 植株對ZYMV病毒病的抗性，加快該抗病基因的利用。
[0030] 4、本發(fā)明提出了利用西葫蘆ZYMV病毒病抗病種質(zhì)資源BS12中抗病基因的方法： 利用分子標(biāo)記篩選，通過雜交與回交轉(zhuǎn)育將抗病基因?qū)胛骱J優(yōu)良感病自交系中，利用 該方法成功將抗病基因 ZYMV-I導(dǎo)入西葫蘆優(yōu)良自交系BS3,使其獲得了 ZYMV抗病性。
【附圖說明】
[0031] 圖1為分子標(biāo)記ZY-138和ZY-157與西葫蘆抗病基因 ZYMV-I的遺傳連鎖圖，左邊 為標(biāo)記間的圖距。
[0032] 圖2為分子標(biāo)記ZY-138的擴(kuò)增帶型，其中Pl為感病親本BS3, P2為抗病親本BS12， Fl為雜交一代；1-19為以BS3為輪回親本的回交單株；M :Trans DNA markerll，箭頭所指 為150bp特異擴(kuò)增條帶；
[0033] 圖3為分子標(biāo)記ZY-157的擴(kuò)增帶型，其中Pl為感病親本BS3, P2為抗病親本BS12， Fl為雜交一代；1-18為以BS3為輪回親本的回交單株；M :Trans DNA markerll，箭頭所指 為97bp特異擴(kuò)增條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] (一）西葫蘆自交系BS3與BS12F2代的創(chuàng)建與表型鑒定：
[0037] (1)西葫蘆自交系BS3(母本）與BS12(父本）進(jìn)行雜交得到雜種Fl，F(xiàn)l自交產(chǎn) 生F2代群體；
[0038] (2)F2代群體單株種植于溫室營養(yǎng)缽內(nèi)，外罩防蟲網(wǎng)，子葉完全展開后接種病毒 病，接種15天后進(jìn)行抗病性狀調(diào)查，鑒定結(jié)果見表1，
[0039] 表1接種ZYMV病毒病后BS3 XBSl2F2代群體遺傳分析
[0040]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I的連鎖分子標(biāo)記，其特征在于：所述分子標(biāo)記為 ZY-138 和 ZY-157 ; 所述的分子標(biāo)記ZY-138 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp，此分子標(biāo)記來自西葫蘆自交系BS12染色體，為共顯性分子標(biāo)記，利 用Mapmaker/EXP3. 0測得與抗病基因 ZYMV-I的遺傳距離為0. 4cM ; 所述的分子標(biāo)記ZY-157 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 3， 右端引物序列為SEQ ID NO. 4， 擴(kuò)增產(chǎn)物為97bp，此分子標(biāo)記來自西葫蘆自交系BS12染色體，為共顯性分子標(biāo)記，利 用Mapmaker/EXP3. 0測得與抗病基因 ZYMV-I的遺傳距離為2. 6cM。
2. 獲得權(quán)利要求1所述的西葫蘆抗ZYMV病毒病基因 ZYMV-I的分子標(biāo)記的方法，其特 征在于，包括：以西葫蘆自交系BS3和BS12分別作為感病和抗病親本配制F2代分離群體， 用584對SSR引物篩選與西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I連鎖的分子標(biāo)記，得到2個(gè)分 布在抗病基因兩側(cè)的共顯性分子標(biāo)記ZY-138和ZY-157。
3. 西葫蘆ZYMV抗病基因 ZYMV-I的分子標(biāo)記方法，其特征在于：用以下的任意一對分 子標(biāo)記引物PCR擴(kuò)增待檢測西葫蘆基因組DNA，并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物： 1) 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記ZY-138 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 2) 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記ZY-157 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 3， 右端引物序列為SEQ ID NO. 4， 如果用引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,ZY-138能夠擴(kuò)增出150bp的擴(kuò)增片段，或者 用引物SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4, ZY-157能夠擴(kuò)增出97bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著待檢 西葫蘆存在抗ZYMV的基因 ZYMV-I。
4. 權(quán)利要求1所述的西葫蘆ZYMV顯性抗病基因 ZYMV-I的連鎖分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特 征在于：所述的分子標(biāo)記可以應(yīng)用在西葫蘆種質(zhì)資源中ZYMV抗病基因的鑒定和轉(zhuǎn)育中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及西葫蘆ZYMV顯性抗病基因ZYMV-1的連鎖分子標(biāo)記及其應(yīng)用，分子標(biāo)記ZY-138和ZY-157與抗病基因的遺傳距離分別為0.4cM和2.6cM；利用引物對分子標(biāo)記ZY-138和ZY-157進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過擴(kuò)增產(chǎn)物可快速準(zhǔn)確地檢測抗性性狀轉(zhuǎn)育后代植株是否具有ZYMV-1抗病基因。本發(fā)明的有益效果為：可以顯著提高抗病育種效率，縮短育種周期，為ZYMV抗病品種的選育提供了保障；本發(fā)明獲得的分子標(biāo)記ZY-138和ZY-157具有可靠穩(wěn)定、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在鑒別抗、感品種和抗性單株時(shí)具有非常高的利用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15-10, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104560961
【申請?zhí)枴緾N201310507339
【發(fā)明人】李海真
【申請人】北京市農(nóng)林科學(xué)院
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月25日