水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物病原學(xué)和植物檢疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一批能更方便快捷的特異鑒定水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記，特別是提供了水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定的顯性分子標(biāo)記和共顯性分子標(biāo)記，以及應(yīng)用這些分子標(biāo)記檢測兩種病原細(xì)菌的應(yīng)用，采用這些分子標(biāo)記和多個(gè)分子標(biāo)記聯(lián)合鑒定的方法，更確保了結(jié)果的可靠性，不僅能夠準(zhǔn)確的鑒定病害從而采取正確的防治措施符合當(dāng)前檢驗(yàn)檢疫的發(fā)展發(fā)向，而且能夠及時(shí)控制病害的擴(kuò)展蔓延。
【專利說明】水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是提供了水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定的顯性分子標(biāo)記和共顯性分子標(biāo)記，以及應(yīng)用這些分子標(biāo)記檢測兩種病原細(xì)菌的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻黃單胞桿菌是一類典型的黃色的革蘭氏陰性菌，是水稻上主要的細(xì)菌性致病菌，包括水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv.0ryzae (Xoo)和水稻細(xì)菌性條斑病菌Xanthomonas oryzae pv.0ryzicola (Xoc) (Zhao, Ardales et al.2004).Xoo 能夠引起水稻的維管束病害是水稻白葉枯病，而Xoc是通過組織間隙來侵染水稻從而引起水稻細(xì)菌性條斑病。由于水稻白葉枯病(BB)受到溫度以及地域的影響成為最為嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性病害之一，受之影響嚴(yán)重的主要是亞洲和部分非洲地區(qū)。然而高產(chǎn)的水稻品種是更易受到水稻白葉枯病(BB)的侵染，因此水稻白葉枯病(BB)常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，減產(chǎn)量達(dá)50%。相比之下，水稻細(xì)菌性條斑病菌(BLS)引起的損失相對較小，嚴(yán)重的時(shí)候減產(chǎn)量達(dá)30%。但是，隨著雜交水稻的廣泛種植，水稻細(xì)菌性病害有逐年加重的趨勢。因此，遏制水稻細(xì)菌病害的發(fā)展對于穩(wěn)定糧食生產(chǎn)和改善人們生活水平至關(guān)重要。
[0003]隨著全球貿(mào)易在農(nóng)業(yè)中的蔓延，水稻種子進(jìn)出口的檢驗(yàn)工作尤為重要。而在亞洲包括中國在內(nèi)，已經(jīng)把水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌定義為水稻檢疫性病害。其種子帶菌傳播嚴(yán)重，因此，快速檢測和準(zhǔn)確的識別病原物是檢疫工作的關(guān)鍵，同時(shí)能夠有效的防治病害發(fā)生和減 少病害帶來的損失。盡管水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性病菌的侵染方式不同，但是由于同屬水稻黃單胞菌的白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae, Xoo)和條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzicola, Xoc)親緣關(guān)系非常近,且基因組序列相似性高達(dá)90%以上，在檢疫工作中不易被鑒定區(qū)分。傳統(tǒng)的篩選分離手段對于同種不同致病變種，形態(tài)特征極為相似菌株，區(qū)分起來耗時(shí)耗力。噬菌體技術(shù)在水稻細(xì)菌病害流行中較為常用，但噬菌體?；砸自斐傻募訇幮砸约把鍖W(xué)方法中抗血清質(zhì)量問題易產(chǎn)生的假陽性，使得這種方法的普及受到限制。在當(dāng)前的檢驗(yàn)檢疫工作中，采用方便、經(jīng)濟(jì)的PCR分子標(biāo)記開展相關(guān)工作已經(jīng)成為主要方法，各種以PCR為依托的檢測方法絡(luò)繹不絕，如TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法雖然準(zhǔn)確靈敏但成本昂貴，很難應(yīng)用到日常檢驗(yàn)檢疫工作中。在水稻兩種細(xì)菌性病害的檢驗(yàn)檢疫中，前人利用兩種病原菌中電子轉(zhuǎn)移黃蛋白α亞基的差異和跨膜蛋白基因(ΑΥ319937、ΑΥ319941)的差異設(shè)計(jì)顯性?；砸飦磉M(jìn)行鑒定區(qū)分，取得一定的效果。由于細(xì)菌間存在一定程度的遺傳物質(zhì)的交換，單一分子標(biāo)記容易造成檢測上的誤差，而且PCR實(shí)驗(yàn)在實(shí)際操作中容易形成一定的污染概率，存在一定的假陽性風(fēng)險(xiǎn)，因此開發(fā)豐富的、保守性高的分子標(biāo)記進(jìn)行多位點(diǎn)檢測有利于保證檢測的準(zhǔn)確性。
[0004]而伴隨著生物測序技術(shù)的發(fā)展，完成了很多全基因組測序工作。到目前為止，已經(jīng)有四個(gè)黃單胞桿菌的菌株完成了測序(其中包括KACC10331，PX099A，MAFF311018，andBLS256),以及完成了水稻白葉枯病菌株AX01947的草圖?；谝勋@得的信息，可以利用生物信息學(xué)的比較算法來研究不同小種之間的差異。如何利用這些已有研究成果來區(qū)分水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性病菌成為我們的研究前沿。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明人正是針對現(xiàn)有技術(shù)的研究情況基于這些已經(jīng)發(fā)布的物種序列進(jìn)行全基因組序列比對，提供了水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是提供了水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定的顯性分子標(biāo)記和共顯性分子標(biāo)記，以及應(yīng)用這些分子標(biāo)記檢測兩種病原細(xì)菌的應(yīng)用。
[0006]發(fā)明人首先根據(jù)已公布的3個(gè)白葉枯病菌株MAFF311018、KACC10311、PX099A與2個(gè)條斑病菌株BLS256的基因組序列和RS105的部分基因序列，利用生物信息學(xué)的方法對Xoo菌株全基因組內(nèi)以及與Xoc全基因組間比對分析，選定白葉枯病菌MAFF311018和條斑病菌BLS256為分析對象，根據(jù)兩菌株基因組的差異序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過常規(guī)PCR技術(shù)，對包含水稻白葉枯病菌和條斑病菌及其它相關(guān)菌株在內(nèi)的40個(gè)候選菌株進(jìn)行檢測區(qū)分。最終確定了可以用于區(qū)分的分子標(biāo)記如下:水稻白葉枯病菌的分子標(biāo)記，其序列如SEQID N0.1-58所示；水稻細(xì)菌性條斑病菌的分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID N0.59-104所示；水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的共顯性分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID N0.105-126所示；利用這些分子標(biāo)記不但可以特異鑒定水稻黃單胞桿菌，還可以對水稻黃單胞桿菌的兩個(gè)致病變種水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)致鑒定，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中鑒定準(zhǔn)確性差的問題，鑒定技術(shù)中不可靠的問題。
[0007]通過上述確定的分子標(biāo)記，結(jié)合簡單的PCR技術(shù)以及普通的DNA檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，為簡便，快速、準(zhǔn)確地檢測兩種病原細(xì)菌開辟了有效途徑，可以對于大量的樣本采用多標(biāo)記協(xié)同檢測，有利于提 高檢測可靠性，符合檢測技術(shù)發(fā)展的方向。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明特異性引物設(shè)計(jì)原理示意圖；
[0009]圖2為水稻白葉枯病菌?；砸矧?yàn)證結(jié)果示意圖，
[0010]圖中1-10為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3，JSB2-24, RS85, RS105, HNB8-47, HCAl, HCA2, HCBI, HCCI, HGAl ；
[0011]11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是 PX099, PX086, PX071, PX061, JL691-1, PX0339a，PX0339b, PX0339c, SC-yc-a, Fujian,⑶414，HeNlI, YN24, YN18, YNl1，ΥΝΙ, Τ3, Τ2, Tl, JL691-2，ΡΧ0349, ΡΧ0364, ΡΧ0347, Zhel73_l, Zhel73_3 ；
[0012]36-40:為參照菌株,分別是 Aac, Xcv, Xac, Xcc, Pst ;
[0013]圖3為水稻細(xì)菌性條斑病菌專化性引物驗(yàn)證結(jié)果示意圖，
[0014]圖中1-10為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3，JSB2-24, RS85, RS105, HNB8-47, HCAl, HCA2, HCBI, HCCI, HGAl ；
[0015]11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是 PX099, PX086, PX071, PX061, JL691-1, PX0339a，PX0339b, PX0339c, SC-yc-a, Fujian,⑶414，HeNlI, YN24, YN18, YNl1，ΥΝΙ, Τ3, Τ2, Tl, JL691-2，ΡΧ0349, ΡΧ0364, ΡΧ0347, Zhel73_l, Zhel73_3 ；
[0016]36-40:為參照菌株,分別是 Aac, Xcv, Xac, Xcc, Pst ;[0017]圖4為水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌共顯性引物驗(yàn)證結(jié)果示意圖，
[0018]圖中1-10:為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3，JSB2-24, RS85, RS105, HNB8-47，HCAl, HCA2, HCBI, HCCI, HGAl ；
[0019]11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是 PX099, PX086, PX071, PX061, JL691-1, PX0339a，PX0339b, PX0339c, SC-yc-a, Fujian,⑶414，HeNlI, YN24, YN18, YNl1，ΥΝΙ, Τ3, Τ2, Tl, JL691-2，ΡΧ0349, ΡΧ0364, ΡΧ0347, Zhel73_l, Zhel73_3 ；
[0020]36-40:為參照菌株,分別是 Aac, Xcv, Xac, Xcc, Pst。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0022]實(shí)施例一設(shè)計(jì)可以區(qū)分鑒定水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的分子標(biāo)記
[0023]水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.0ryzae)的三個(gè)小種 KACClO33KPX099A、MAFF311018 和水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzicola)的兩個(gè)小種BLS256、RS105,五個(gè)病菌的基因組序列和相關(guān)信息從NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下載獲得。(表1)
[0024]表1五種細(xì)菌基因組信息的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0025]
【權(quán)利要求】
1.水稻黃單胞桿菌分子標(biāo)記，其特征在于:所述的水稻黃單胞桿菌包括水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌，其中水稻白葉枯病菌的特異分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID N0.1-58所示；水稻細(xì)菌性條斑病菌的特異分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID N0.59-104所示；水稻白葉枯病菌和水稻 細(xì)菌性條斑病菌的共顯性分子標(biāo)記，其序列如SEQ ID N0.105-126所示。
2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定和植物檢疫中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/64GK103993074SQ201410169517
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】丁新華, 儲昭輝, 馮雯杰, 楊龍, 馮傳順 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)