本發(fā)明屬于水稻生物技術育種領域，具體涉及一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾qSH1降低水稻籽粒落粒性的分子遺傳改良方法。

背景技術：

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物，世界上超過一半的人口以稻米為主要糧食。在我國，水稻也是最重要的糧食作物，作為第一大口糧作物，我國約65％的人口以稻米為主食。但是隨著人口的增加和耕地面積的減少，糧食的供需不平衡的問題日益嚴重。因此，水稻產量與經(jīng)濟發(fā)展、社會穩(wěn)定、國家安全息息相關，其在保障我國糧食安全起著舉足輕重的作用。

水稻籽粒的落粒性是與水稻收獲產量密切相關的重要農藝性狀之一。對于野生稻而言，極易落粒有利于其正常的繁衍后代。但對于人類當今實際生產應用的普通栽培稻品種(組合)，落粒性過強會因在收獲時谷粒大量掉落在田間而造成收獲產量的較大損失，因而不受歡迎。盡管經(jīng)過人工馴化與改良后，大多數(shù)栽培稻品種的落粒性都較適中，但仍然有部分品種，特別是某些秈型雜交稻骨干親本及其組合(如R1128、廣兩優(yōu)1128等)因易掉粒而導致收獲產量減少。因此，從遺傳上改良這些品種的落粒性對提高水稻收獲產量、保證水稻高產和穩(wěn)產都具有十分重要的現(xiàn)實意義。

隨著研究的深入，水稻易落粒特性的形成的生理、分子機制正在逐步明晰：水稻花支梗與護穎之間的離層(abscission layer)結構與水稻落粒性的產生直接相關。水稻的離層結構首先在其脫離器官的邊緣形成，在抽穗前16至20d即配子體細胞在幼穗中開始分化的時期，枝梗組織中的離層結構開始形成。而當水稻籽粒成熟時，離層細胞的細胞壁會發(fā)生斷裂并開始降解，使得成熟的谷粒很容易就從母體植株的枝梗上掉落下來(S Oba S,et a l.,1990,Japen.J.Breed；Watanabe N,et al.,2000,Euphytica；Zee S Y,et al.,1979,IRRN)。而qSH1是現(xiàn)已克隆的控制水稻落粒性的主效基因，其編碼了一個BEL1型同源異型蛋白。功能研究分析表明，在水稻花器官分化期的qSH1在水稻小穗基部的離層持續(xù)表達從而促進離層的發(fā)育，導致水稻籽粒易落粒(Konishi S,et al.,2006,Sicence)。

技術實現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有遺傳改良技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾水稻落粒性基因qSH1降低水稻落粒性的分子遺傳改良方法。對于落粒性過強的水稻品種，可通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾落粒性基因qSH1進行定向改良，培育出落粒性顯著降低且不帶轉基因成分的水稻新品種及新組合。本發(fā)明具有方向性強、遺傳背景改變小等優(yōu)勢，并可規(guī)避轉基因可能帶來的風險。

為解決上述問題，本發(fā)明所提供的技術方案是：一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾水稻落粒性基因qSH1降低水稻落粒性的分子遺傳改良方法，其包括如下步驟：

1)根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶點設計要求，在qSH1或LOC_Os01g62920或Os01g0848400編碼區(qū)和起始密碼子5’端附近區(qū)域選擇合適的靶點；

2)構建含靶點序列的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體；

3)利用上述的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體構建含有靶點序列的pCRISPR/Cas9重組載體；

4)將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入受體水稻中，獲得轉基因陽性植株；

5)利用上述轉基因陽性植株獲得靶向突變的突變植株；

6)利用上述突變植株加代種植后獲得不含轉基因成分的純合突變植株；

7)利用上述純合突變植株經(jīng)落粒性調查獲得落粒性顯著降低的植株作為落粒性改良株

本發(fā)明方法中，其中，步驟1)中所述靶點雙鏈片段中的一條鏈具有以下結構：5’-(N)_X-NGG-3’，N表示A，T，C和G中的任意一個，較好的靶點序列X為19或20且以A或G開頭，并且靶標序列NGG上游的12bp應在水稻基因組中有較好的特異性。

上述方案中，步驟2)具體步驟為：先分別合成帶有粘性末端的寡鏈靶點引物，將兩條互補配對的寡鏈靶點引物變性后移至室溫冷卻完成退火形成雙鏈靶點片段，將退火后的雙鏈靶點片段連接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA或pU6a-gRNA載體上并利用PCR擴增含有靶點的gDNA表達盒。

上述方案中，步驟3)具體步驟為：將PCR擴增后的gDNA表達盒連接到含Cas9表達盒的pCRISPR/Cas9載體上。

上述方案中，步驟4)具體步驟為：將含靶點的pCRISPR/Cas9重組載體轉化水稻愈傷組織，經(jīng)篩選、分化、生根和煉苗后，種植于溫室；通過潮霉素基因分子檢測鑒定獲得陽性轉基因水稻植株。

上述方案中，步驟5)具體步驟為：選擇上述陽性轉基因水稻的DNA，用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物擴增上述DNA，擴增產物純化后送公司測序。測序結果與野生型序列比對，分析轉基因植株是否在預期靶點區(qū)域發(fā)生突變，并分析突變類型、突變靶點基因型，獲得T0代突變水稻植株。

上述方案中，步驟6)具體步驟為：收獲T0代突變植株的種子，繼續(xù)種植T1代分離群體，通過潮霉素分子檢測、靶點擴增測序分析獲得靶標位點基因型純合且不帶轉基因成分的植株。

上述方案中，步驟7)具體步驟為：選擇上述植株黃熟期的主穗或大分蘗穗通過儀器法測定籽粒落粒程度，獲得落粒性顯著降低的植株。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.傳統(tǒng)降低水稻品種落粒性的方法多為利用難落粒的材料與受體材料雜交，再通過多代回交、自交，選擇綜合農藝性狀基本不變、落粒性降低且能穩(wěn)定遺傳的后代材料，該方法存在選育工作量大、材料穩(wěn)定速度慢等不足。而本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，靶向修飾qSH1獲得落粒性得到顯著降低的水稻新品種的方法，一般只需2-3代即可完成對水稻落粒性的定向改良，大大提高了改良工作效率，加快了育種的進程，節(jié)省了時間和成本。

2.傳統(tǒng)改良方法無論回交、自交多少代都會或多或少的滲入與目的基因緊密連鎖的其他基因，導致受體材料遺傳背景的改變甚至帶入某些不良性狀。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，靶向修飾qSH1獲得落粒性得到顯著降低的水稻新品種的方法，則不會改變受體材料的遺傳背景。

3.本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，靶向修飾qSH1獲得落粒性得到顯著降低的水稻新品種的方法，實現(xiàn)了水稻落粒性狀的定向改良，且可篩選獲得不含有轉基因成分的改良品種，此方法一方面規(guī)避了轉基因可能帶來的安全風險，另一方面與物理誘變、化學誘變等方法相比該方法的方向性強、突變效率更高，并且由于是靶向突變，更有基因組DNA損傷小的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中測量籽粒落粒性的方法，測得的拉力值越小表示該植株的籽粒落粒性越強。

圖2為本發(fā)明實施例中所獲得的qSH1-339的T1代植株潮霉素分子檢測結果，其中1-6分別為qSH1-339的T1代植株中的6株，N表示陰性對照，P表示陽性對照。

圖3為本發(fā)明實施例中所獲得的qSH1-339的T1代植株中第3號單株和R1128野生型對照于黃熟期主穗籽粒落粒性的測定結果，其中測得的拉力值越小表示該植株的籽粒落粒性越強。

圖4為本發(fā)明實施例中所獲得的qSH1-339-3加代繁殖后的改良株系和R1128野生型對照于黃熟期主穗的落粒情況。

具體實施方式：

下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。

本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾水稻落粒性基因qSH1降低水稻(本實施例中為秈稻品種R1128)落粒性的分子遺傳改良方法，其包括如下步驟：

1)根據(jù)日本晴qSH1參考序列，克隆秈稻R1128qSH1編碼區(qū)雙鏈片段并進行測序拼接；

2)根據(jù)上述測序拼接結果，在R1128qSH1編碼區(qū)和起始密碼子5’端上游區(qū)域設計兩條靶點序列：

Target-qSH1-1(SEQ ID NO.1)：GCGCCATGTCGTCCGCCGCT

Target-qSH1-5(SEQ ID NO.2)：ACATGGCGCGCACGCACGTA

上述兩條靶點序列均含有5’-(N)_X-NGG-3’結構，加框部分為NGG結構，其中Target-qSH1-5為反向互補鏈。

3)構建含Target-qSH1-1、Target-qSH1-5雙靶點的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體：首先分別合成帶有粘性末端的寡鏈靶點引物Target-qSH1-1F(SEQ ID NO.3)：GCCGCGCCATGTCGTCCGCCGCT，Target-qSH1-1R(SEQ ID NO.4)：AAACAGCGGCGGACGACATGGCG，Target-qSH1-5F(SEQ ID NO.5)：GGCACATGGCGCGCACGCACGTA，Target-qSH1-5R(SEQ ID NO.6)：AAACTACGTGCGTGCGCGCCATG。將兩對寡鏈靶點引物變性后冷卻至室溫完成退火，在將退火后的兩個片段分別接連到pY LgRNA-U6a、pYLgRNA-U3載體上，并利用PCR分別擴增含有Target-qSH1-5、Target-q SH1-1靶點的gDNA表達盒。

4)構建含Target-qSH1-5、Target-qSH1-1靶點片段的pCRISPR/Cas9載體：利用上述經(jīng)PCR擴增得到的含有Target-qSH1-5、Target-qSH1-1靶點的gDNA表達盒同時連接到含Cas9表達盒的pCRISPR/Cas9載體上。

5)轉基因植株獲得：

利用上述含雙靶點的pCRISPR/Cas9載體通過農桿菌介導遺傳轉化至秈稻R1128愈傷組織中，經(jīng)篩選、分化、生根和煉苗后，種植于溫室。通過潮霉素基因分子檢測鑒定獲得陽性轉基因水稻植株。

6)轉基因突變植株及獲得：

選擇上述陽性轉基因水稻植株DNA，用引物D-CqF9(SEQ ID NO.7)：AGTTTCACGGCTTACCATTTCC和D-CqR7(SEQ ID NO.8)：ACCATGAGGCGGTGGCGAGT擴增上述DNA樣品，擴增產物經(jīng)純化后送公司測序，測序結果與未轉化的野生型對照株序列比較，分析突變情況，具體參見SEQ ID NO.9-SEQID NO.15；

WT(SEQ ID NO.9)CCGTACGTGCGTGCGGG

Target-qSH1-T51-334(SEQ ID NO.10)CCGTACG--CGTGCGCGCCATGTCGTCCGCCGCTGGG

Target-qSH1-T51-336(SEQ ID NO.11)CCGTACTGTGCGTGCGCGCCATGTCGTCCGCCGCTGGG

Target-qSH1-T51-339(SEQ ID NO.12)CCG--------TGCGCGCCATGTCGTCCGCCAGCTGGG

Target-qSH1-T51-406(SEQ ID NO.13)CCGTACTAGTGCGTGCGCGCCATGTCGTCCGCCAGCTGGG

Target-qSH1-T51-408(SEQ ID NO.14)CCGTAC----GTGCGCGCCATGTCGTCCGC-GCTGGG

Target-qSH1-T51-422(SEQ ID NO.15)CCGTACTTGCGTGCGCGCCATGTCGTCCGCCGCTGGG

其中，WT為R1128野生型對照株系，WT中下劃線靶點為Target-qSH1-5、加框靶點為Target-qSH1-1；Target-qSH1-T51-334，-336，-339，-406，-408，-422為不同的T0代轉基因突變株系；相對于WT序列，序列中“-”代表堿基缺失，“”代表插入的堿基，有堿基的缺失和插入說明靶向修飾成功。

7)上述突變植株加代純合，獲得落粒性顯著降低的改良植株：

收獲T0代在預期靶點區(qū)域發(fā)生了定向突變的突變植株的種子，加代繁殖，于T1代分離群體，通過潮霉素分子檢測(檢測結果見圖2)、靶點擴增測序分析獲得靶點基因純合且不帶轉基因成分的植株；選擇上述植株黃熟期的主穗或大分蘗穗通過儀器法測定(請參見圖1和圖3)籽粒落粒程度，獲得落粒性顯著降低的植株，再經(jīng)加代繁殖獲得落粒性顯著降低的改良株系，結果參見圖4。

圖2的結果表明，T1代植株中第3和5號植株是不含轉基因成分的；圖3的結果表明，第3號植株在黃熟期籽粒落粒性顯著下降。

上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍，本領域的技術人員在本發(fā)明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。