本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及VvSUC27基因在促進(jìn)植物攝取外界蔗糖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在高等植物中，首先由成熟的葉片通過光合作用合成有機(jī)物質(zhì)，并以碳水化合物的形式運(yùn)送至各個組織或器官中，從而為植物的生長發(fā)育提供能量。其中，碳水化合物主要是以蔗糖的形式完成長距離的轉(zhuǎn)運(yùn)。蔗糖進(jìn)入和載出韌皮部篩管分子有兩種主要的途徑：一、共質(zhì)體途徑：蔗糖由葉肉細(xì)胞合成后直接通過胞間連絲裝載入韌皮部進(jìn)行運(yùn)輸，然后在庫端卸載進(jìn)入庫端組織或器官細(xì)胞中貯存或代謝，在此過程當(dāng)中蔗糖無需作跨膜運(yùn)動；二、質(zhì)外體途徑：蔗糖是由主動跨膜裝載從源端進(jìn)入韌皮部進(jìn)行運(yùn)輸，然后在庫端跨膜卸載從而進(jìn)入庫端組織或器官。在此途徑中，蔗糖需要進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這就需要膜上特異的載體(蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)介導(dǎo)和能量驅(qū)動。因此蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著極為重要的作用。

而在葡萄中發(fā)現(xiàn)了3種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因：VvSUC11、VvSUC12和VvSUC27，這三個基因均通過轉(zhuǎn)化酵母后表達(dá)的蛋白質(zhì)對蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能驗證。Northern試驗發(fā)現(xiàn)，這三個基因在不同組織中的表達(dá)情況是不一樣的，VvSUC11，VvSUC12在根和卷須中的表達(dá)十分微弱，而VvSUC27根和卷須中表達(dá)明顯。由此可推斷VvSUC27主要在庫組織中表達(dá)，參與韌皮部的卸載，與長距離運(yùn)輸過程中的蔗糖回收。然而，對于VvSUC27的功能并沒有系統(tǒng)性的報導(dǎo)過，并且其基于過表達(dá)對于植物中的影響也不明確。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供VvSUC27基因在促進(jìn)植物攝取外界蔗糖中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明通過研究首次發(fā)現(xiàn)，在植物中轉(zhuǎn)入VvSUC27基因并對其進(jìn)行過表達(dá)，可使植物由根部吸收大量外源蔗糖，提高了根中乃至整個植株糖類物質(zhì)的，促進(jìn)了植物各器官的生長分化過程。含量。

因此，本發(fā)明提供了VvSUC27基因(GenBank登錄號：AF021810)在促進(jìn)植物攝取外界蔗糖中的應(yīng)用。具體為，將VvSUC27基因利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆到植物中，利用VvSUC27基因在植物中的過表達(dá)，促進(jìn)植物從外界攝取蔗糖。

本發(fā)明還提供了VvSUC27基因在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。具體為，將VvSUC27基因利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆到植物中，利用VvSUC27基因在植物中的過表達(dá)，促進(jìn)植物的生長。

所述應(yīng)用在促進(jìn)植物根部糖分積累及其在弱光環(huán)境或無光環(huán)境中生長方面，優(yōu)勢格外明顯。

進(jìn)一步地，所述植物可為花卉，使得花卉即使在無光下也能快速生長，從而使花卉易于培養(yǎng)，還有利于節(jié)約光能減少能源的浪費(fèi)；所述植物還可為含有肉質(zhì)根或塊根的植物，如蘿卜、紅薯、馬鈴薯、甜菜等，使得其根部即可食用部分，可以快速粗壯生長，含糖量增加；所述植物還可為一般農(nóng)作物，使其在單位時間里，植株快速生長，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，同時減少對光能的依賴型，易于存活。

在本發(fā)明的具體實施方式中，以煙草為例進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建。煙草屬管狀花目，茄科一年生或有限多年生草本植物，同時煙草作為一種模式植物，具有結(jié)構(gòu)簡單，生長周期短等優(yōu)點，是良好的轉(zhuǎn)基因材料。

該轉(zhuǎn)基因煙草中導(dǎo)入了葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VvSUC27基因，使其在煙草體內(nèi)過表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因煙草的生長速率要顯著性高于野生型煙草。

為方便理解，下面將對轉(zhuǎn)基因煙草的獲得方式進(jìn)行詳細(xì)描述。

本發(fā)明通過將葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白VvSUC27基因?qū)肴鸁熤?Nicotiana tobacum cv.Samsun NN)，經(jīng)篩選得到陽性轉(zhuǎn)基因煙草，觀察其在含蔗糖培養(yǎng)基中的表型，最終獲得了可以快速生長且能在黑暗中存活的轉(zhuǎn)基因煙草。

具體構(gòu)建步驟如下：

A.VvSUC27基因全長cDNA的克隆

A-1、葡萄cDNA的獲?。禾崛〕嘞贾昶咸压麑嵉目俁NA，以2μg總RNA為模板，采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶以O(shè)ligo dT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

A-2、根據(jù)NCBI上搜索到黑比諾葡萄VvSUC27基因CDs序列設(shè)計引物，正向引物：GGA GTT AGC CAA GCC TTC TTC A；反向引物：TTA AGA CGA CGG CTG AGT CCT C，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用DNA聚合酶LA Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到VvSUC27基因的編碼區(qū)；取10μL RCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測；將切膠回收的1.5kb DNA片段連接到pGEM-T Easy Vector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株，大提質(zhì)粒后測序，測序比對結(jié)果如圖1所示，可見擴(kuò)增得到的赤霞株VvSUC27與黑比諾VvSUC27在基因末端出現(xiàn)了4個堿基差異，一個氨基酸殘基差異(圖2)。為了驗證這幾個突變不是PCR或者測序或者其他試驗誤差導(dǎo)致，已先后在葡萄不同組織中，以及相同組織，不同樣品中重新提取RNA并反轉(zhuǎn)錄并且克隆測序了相應(yīng)的突變部分，發(fā)現(xiàn)所采集的葡萄樣品的VvSUC27基因的確存在著這4個堿基的差別。所以可推斷這是不同葡萄種屬上的差別，應(yīng)該一樣具有完整蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

B.過表達(dá)載體的構(gòu)建

B-1、通過在引物上加入酶切位點BamH I和Sac I，擴(kuò)增得到含有酶切位點，約1.5kb的VvSUC27片斷；

B-2、用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I分別雙酶切高效表達(dá)載體PBI121；

B-3、將酶切后的VvSUC27基因片段連接到pBI121載體上，并將其及pBI121空載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌EHA105中，在2-3天后，在培養(yǎng)皿上挑取克隆劃線培養(yǎng)后，進(jìn)行菌體PCR后，挑選出陽性克隆。

C.轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

分別用含有基因的表達(dá)載體(pBI121-VvSUC27)及pBI121空載體的農(nóng)桿菌EHA105通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。轉(zhuǎn)化后在含有Kan 100mg/L的生芽培養(yǎng)基上篩選，2周后即可見經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片切口面膨大，且陸續(xù)有小芽分化生長出來，沒有經(jīng)過浸染的對照組葉片切口雖然也有點變大，但無抗性芽，一個月后，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的煙草分化生長出來的小芽已經(jīng)有3cm長，而沒有經(jīng)過浸染的對照組葉片全部變黃。約一個半月后，陸續(xù)將小抗性芽用鋒利刀片切下，插入生根篩選培養(yǎng)基中。2周后可見生根，繼續(xù)培養(yǎng)2-4周后待煙草苗長到7cm高左右，打開組培瓶口，向瓶內(nèi)加入少量的水，鍛煉2，3天后，瓊脂經(jīng)浸泡后較容易與植物根系分離，將其移栽至蛭石與營養(yǎng)土(1：3)的花盆中，用透明塑料袋罩住以防止水分蒸發(fā)。待植物移栽成活后，從花盆中連土一并取出，移入溫室。

D.轉(zhuǎn)基因煙草的陽性檢測

D-1、提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA及RNA，

D-2、轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測：以DNA為模板，用一對位于VvSUC27基因內(nèi)部的引物，擴(kuò)增片斷位置在VvSUC27基因460-990bp處，大小為530bp，選出能擴(kuò)出對應(yīng)大小基因的植株做以下Southern檢測。

D-3、轉(zhuǎn)基因煙草的Southern檢測：轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA都可以被BamH I+Sac I雙酶切而切下1.5kb的VvSUC27基因下來，因此在做Southern雜交的時候，會在1.5kb處得到雜交帶。通過驗證酶切是否含有1.5kb的酶切條帶，來判斷是否為轉(zhuǎn)基因陽性苗。

第二方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)植物攝取外界蔗糖的方法，將攜帶VvSUC27基因CDS序列的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到目的植物中，利用VvSUC27基因在植物中的過表達(dá)，促進(jìn)植物攝取外界蔗糖。

作為優(yōu)選，所述過表達(dá)載體為含有VvSUC27基因CDS序列的表達(dá)載體PBI121。該載體具有CaMV35S組成型強(qiáng)啟動子，無組織特異性，能更好的實現(xiàn)VvSUC27基因的過表達(dá)。

進(jìn)一步地，由于上述方法促進(jìn)了植物從外界攝取蔗糖，而蔗糖可以做為信號分子影響內(nèi)源基因的表達(dá)，進(jìn)而更快的利用根部攝取的蔗糖來完成植物其他器官的分化生長。因此，上述方法進(jìn)一步也促進(jìn)了植物的生長。

第三方面，本發(fā)明提供了一種含有VvSUC27基因CDS序列的過表達(dá)載體，所述過表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：

1)提取葡萄果實的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

2)以所述cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增片段；所述特異性引物如SEQ ID NO.1～2所示；

3)將所述擴(kuò)增片段連接到表達(dá)載體PBI121中，即得。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過過表達(dá)VvSUC27基因，促進(jìn)了植物攝取外界蔗糖，尤其促進(jìn)了根部含糖量的增加，同時可使轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)快速生長的表型，并且可以在微光甚至使無光下快速生長，證實了該基因的一個新的功能應(yīng)用。

本基因的克隆和轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用，有望應(yīng)用于肉質(zhì)根或塊根植物的培育中，促進(jìn)其可食用根部糖分的積累，并可以使其快速粗壯生長；還有望應(yīng)用于花卉等植物的培育中，使得花卉等植物即使在無光下也能快速生長，從而使花卉易于培養(yǎng)，還有利于節(jié)約光能減少能源的浪費(fèi)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1步驟1中核酸序列比對結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實施例1步驟1中氨基酸序列比對結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實施例1步驟4中轉(zhuǎn)基因煙草(T₀)的PCR檢測。

圖4為本發(fā)明實施例1步驟4中轉(zhuǎn)基因煙草(T₀)的Southern檢測。

圖5為本發(fā)明實施例1步驟4中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)的實時熒光定量PCR驗證結(jié)果。

圖6為本發(fā)明實施例1步驟5中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)生長高度變化。

圖7為本發(fā)明實施例1步驟5中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)第7周表型比較。

圖8為本發(fā)明實施例2步驟1中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在微光下培養(yǎng)30天的各表型對比圖。

圖9為本發(fā)明實施例2步驟1中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在微光下培養(yǎng)30天的表型對比圖。

圖10為本發(fā)明實施例2步驟1中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在黑暗下培養(yǎng)30天的各表型對比圖。

圖11為本發(fā)明實施例2步驟1中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在黑暗下培養(yǎng)30天的表型對比圖。

圖12為本發(fā)明實施例3步驟1中煙草葉片的C¹⁴吸收試驗結(jié)果

圖13為本發(fā)明實施例3步驟2中轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)葉片、莖和根中可溶性糖含量的測定。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明中培養(yǎng)基及所用到的試劑為常規(guī)市售產(chǎn)品，具體配方如下：

菌體培養(yǎng)基：

LB培養(yǎng)液：1000mL：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，雙蒸水溶解后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容到1L，121℃高壓蒸汽滅菌20min

LB固體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)液中加入15g/L瓊脂，121℃高壓蒸汽滅菌20min，若配含有氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基，則每100mL中加入10mg氨芐青霉素，加入時培養(yǎng)基溫度應(yīng)低于60℃。

RNA提取試劑：

氯仿：異戊醇(49：1)：98mL氯仿中加入2mL異戊醇

10M LiCl溶液：稱取60.41g LiCl，用雙蒸水定容至100mL，再加入0.1mL DEPC，37℃溫箱中過夜保存，高壓滅菌。

DEPC水：雙蒸水100mL中加入0.1mL DEPC，37℃溫箱中過夜保存，高壓滅菌。

70％乙醇(提RNA用)：70mL無水乙醇和30mL DEPC水混合

50×TAE溶液(1000mL)：Tris 242g、冰醋酸57.1mL、EDTA(0.5M，pH 8.0)100mL

5M EDTA：18.61g EDTA·12H₂O溶于80mL雙蒸水，用1M的NAOH調(diào)pH值至8.0，待完全溶解后，定容至100mL，121℃下高壓滅菌30min。

CTAB提取緩沖液(+CTAB)：50mM Tris-Cl(pH 8.0)；0.7mM NaCl；10mM EDTA(pH 8.0)；2％CTAB；40mM巰基乙醇(臨用前加)

Southern雜交用試劑：

20×SSC：用800mL水溶解175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉，用幾滴14M HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至1L，分裝后高壓滅菌。該試劑的終濃度為3M NaCl和0.3M檸檬酸鈉。

變性液：0.5M NaOH，1.5M NaCl

中和液：0.5M Tris-HCl，pH 7.5，1.5M NaCl

Maleic Acid Buffer：0.1M馬來酸，0.15M NaCl；利用NaOH調(diào)節(jié)pH質(zhì)pH 7.5

Washing buffer：0.1M Maleic acid，0.15M NaCl；pH 7.5，0.3％(v/v)Tween 20

Detection Buffer：0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5

激素的配制：

NAA(1mg/mL)：用少量95％的乙醇溶解，無菌水定容或0.1M NaOH溶液配制。

6-BA(1mg/mL)：用0.1M HCl配制。

IAA(0.5mg/mL)：用少量95％乙醇溶解，無菌水定容。

GA3(0.5mg/mL)：用95％乙醇溶解，-20℃保存。

煙草轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基：

T1：MS基本成分+蔗糖20g/L，pH 5.8

T2：T1+6-BA(2mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Carb(500mg/L)

T3：T2+Hyg(20mg/L)

T4：T1+NAA(0.1mg/L)+Carb(500mg/L)+Hyg(20mg/L)

Preincubation media：

甘露醇175mM，CaCl₂ 0.5mM，K₂SO₄ 0.5mM，MES 20mM，pH 5.8，198mOsmol

消化液：

高氯酸：65％[w/w]，100μL；過氧化氫：33％[w/w]，200μL

統(tǒng)計學(xué)分析：

應(yīng)用OriginPro 9.0軟件分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖。應(yīng)用SPSS 10.0軟件(SPSS INC.，Chicago，MSA)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯多重比較法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析。0.01≤P<0.05差異顯著(*)，P<0.01表示差異極顯著(**)。

實施例1

1.VvSUC27基因全長cDNA的克隆

葡萄cDNA的獲取：提取赤霞株葡萄果實的總RNA，以2μg總RNA為模板，采用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶以O(shè)ligodT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；根據(jù)NCBI上搜索到黑比諾葡萄VvSUC27基因CDs序列設(shè)計引物，正向引物：GGA GTT AGC CAA GCC TTC TTC A；反向引物：TTA AGA CGA CGG CTG AGT CCT C，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用DNA聚合酶LA Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到VvSUC27基因的編碼區(qū)；取10μL RCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測；將切膠回收的1.5kb DNA片段連接到pGEM-T Easy Vector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株，大提質(zhì)粒后測序，測序比對結(jié)果如圖1所示，可見擴(kuò)增得到的赤霞株VvSUC27與黑比諾VvSUC27在基因末端出現(xiàn)了4個堿基差異，一個氨基酸殘基差異(圖2)。為了驗證這幾個突變不是PCR或者測序或者其他試驗誤差導(dǎo)致，已先后在葡萄不同組織中，以及相同組織，不同樣品中重新提取RNA并反轉(zhuǎn)錄并且克隆測序了相應(yīng)的突變部分，發(fā)現(xiàn)所采集的葡萄樣品的VvSUC27基因的確存在著這4個堿基的差別。所以可推斷這是不同葡萄種屬上的差別，應(yīng)該一樣具有完整蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

2.過表達(dá)載體的構(gòu)建

通過在引物上加入酶切位點BamH I和Sac I，擴(kuò)增得到含有酶切位點，約1.5kb的VvSUC27片斷；用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I分別雙酶切高效表達(dá)載體PBI121；將酶切后的VvSUC27基因片段連接到pBI121載體上，并將其及pBI121空載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌EHA105中，在2-3天后，在培養(yǎng)皿上挑取克隆劃線培養(yǎng)后，進(jìn)行菌體PCR后，挑選出陽性克隆。

3.轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

分別用含有基因的表達(dá)載體(pBI121-VvSUC27)及pBI121空載體的農(nóng)桿菌EHA105通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。轉(zhuǎn)化后在含有Kan 100mg/L的生芽培養(yǎng)基上篩選，2周后即可見經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片切口面膨大，且陸續(xù)有小芽分化生長出來，沒有經(jīng)過浸染的對照組葉片切口雖然也有點變大，但無抗性芽，一個月后，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染的煙草分化生長出來的小芽已經(jīng)有3cm長，而沒有經(jīng)過浸染的對照組葉片全部變黃。約一個半月后，陸續(xù)將小抗性芽用鋒利刀片切下，插入生根篩選培養(yǎng)基中。2周后可見生根，繼續(xù)培養(yǎng)2-4周后待煙草苗長到7cm高左右，打開組培瓶口，向瓶內(nèi)加入少量的水，鍛煉2，3天后，瓊脂經(jīng)浸泡后較容易與植物根系分離，將其移栽至蛭石與營養(yǎng)土(1：3)的花盆中，用透明塑料袋罩住以防止水分蒸發(fā)。待植物移栽成活后，從花盆中連土一并取出，移入溫室。

4.轉(zhuǎn)基因煙草的陽性檢測

提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA及RNA，轉(zhuǎn)基因煙草(T₀)的PCR檢測(圖3)：以DNA為模板，用一對位于VvSUC27基因內(nèi)部的引物，擴(kuò)增片斷位置在VvSUC27基因460-990bp處，大小為530bp，選出能擴(kuò)出對應(yīng)大小基因的植株做以下Southern檢測。轉(zhuǎn)基因煙草(T₀)的Southern檢測(圖4)：轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA都可以被BamH I+Sac I雙酶切而切下1.5kb的VvSUC27基因下來，因此在做Southern雜交的時候，會在1.5kb處得到雜交帶。通過驗證酶切是否含有1.5kb的酶切條帶，來判斷是否為轉(zhuǎn)基因陽性苗。在得到轉(zhuǎn)基因陽性苗后，進(jìn)行自交繁種，每代都進(jìn)行實時熒光定量PCR追蹤檢測，確保目的基因的穩(wěn)定遺傳，得到T₂代純合子轉(zhuǎn)基因株系。T₂代純合子轉(zhuǎn)基因株系實時熒光定量PCR驗證結(jié)果如圖5所示。

5.轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)的正常條件下的表型觀察

轉(zhuǎn)VvSUC27基因的T₂代純合子煙草在含有蔗糖的培養(yǎng)基MS上播種從第2周開始，出現(xiàn)了明顯的快速生長的表型(圖6)。由于T₂代轉(zhuǎn)基因煙草是播種在含有蔗糖的培養(yǎng)基上的，煙草發(fā)根生長后，由于有蔗糖的飼喂，會生長的比較快。煙草種子在發(fā)芽，生根，長出兩片子葉的過程中(約一個星期)，轉(zhuǎn)VvSUC27基因的煙草與陰性煙草相比沒有什么明顯區(qū)別，可在接下來的生長中，轉(zhuǎn)VvSUC27基因的煙草在表型上發(fā)生了極大的變化。在生長2-3周后，轉(zhuǎn)VvSUC27基因的煙草生長迅速，7周后，高度要比陰性高2-3倍左右(圖7)。

實施例2

1.轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在微光下的表型觀察

轉(zhuǎn)VvSUC27基因的T₂代純合子煙草在含有蔗糖的培養(yǎng)基MS上播種后，在正常光照下培養(yǎng)30天后，關(guān)閉組培架上的燈，使其置于微光下生長，并以野生型煙草為對照，微光培養(yǎng)30天后記錄表型變化(圖8-9)。由圖可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草在微光下培養(yǎng)30天后，除了葉片數(shù)目外，根數(shù)、莖長、莖粗葉面積均顯著性高于野生型的植株，而葉片數(shù)目上轉(zhuǎn)基因煙草的葉片數(shù)目也稍大于野生型植株的葉片數(shù)目(圖8)。同時可以觀察到野生型煙草的葉片顏色較轉(zhuǎn)基因型煙草葉片顏色較黃(圖9)。

2.轉(zhuǎn)基因煙草(T₂)在黑暗下的表型觀察

轉(zhuǎn)VvSUC27基因的T₂代純合子煙草在含有蔗糖的培養(yǎng)基MS上播種后，在正常光照下培養(yǎng)30天后，置于黑暗中培養(yǎng)30天后記錄表型變化(圖8-9)。由圖可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草在黑暗中培養(yǎng)30天后，除了葉片數(shù)目外，根數(shù)、莖長、莖粗葉面積均顯著性高于野生型的植株，而葉片數(shù)目上轉(zhuǎn)基因煙草的葉片數(shù)目也稍大于野生型植株的葉片數(shù)目(圖10)。葉片顏色上，轉(zhuǎn)基因型煙草葉片顏色較綠，葉片呈綠色的數(shù)目較多(圖11)。

綜上可以看出轉(zhuǎn)VvSUC27基因的煙草，不僅在正常光照下可以快速生長，在微光甚至是黑暗下較野生型煙草也可以較快較好的生長，VvSUC27基因促進(jìn)了煙草的生長。

實施例3

1.C¹⁴蔗糖吸收試驗

轉(zhuǎn)VvSUC27基因的T₂代純合子煙草在無糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)到6-8周左右，摘取新鮮煙草葉片，用打孔器將煙草葉片打為0.26cm²大小的圓形；將葉片浸泡入Preincubation media中孵育30min；取出葉片，轉(zhuǎn)移到含有1mM sucrose和0.1MBq mL–1sucrose-[¹⁴C](Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,UK)、其他成分同Preincubation media溶液，室溫溫和振蕩；分別于一定時間取葉片，放入Preincubation media中洗3min，重復(fù)此步驟3次；將葉片放入消化液(高氯酸：65％[w/w]，100μL和過氧化氫：33％[w/w]，200μL)于55℃消化16h；通過液閃計數(shù)儀器(Packard Tricarb 1900TR,Packard instruments,Rungis,France)計數(shù)同位素放射強(qiáng)度。結(jié)果表明(圖12)轉(zhuǎn)正義VvSUC27基因的煙草葉片吸收體外蔗糖的能力很明顯要高于陰性煙草。在1h時，轉(zhuǎn)正義VvSUC27基因的煙草葉片吸收體外蔗糖的量大約為陰性煙草的2倍左右。這說明VvSUC27基因所表達(dá)的蛋白的確具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的能力，VvSUC27基因的確為編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。

2.轉(zhuǎn)基因煙草中可溶性糖的測定

剪取剛剛成熟的新鮮的植物葉片(或-80℃冰箱中凍存的樣品)放在105℃烘箱15min殺死；在75℃的烘箱中烘干過夜至衡重；在研缽中磨碎，準(zhǔn)確稱取25mg于7mL離心管中；加入1.5mL 80％乙醇，在80℃水浴中提取半個小時，離心取上清；共提取3次，合并上清；加入少許(約0.1g)活性炭脫色，離心，并定容至5mL,稱之為提取液。吸取500μL提取液于1.5mL離心管中，在沸水浴中加熱濃縮至100μL以下(注意不要蒸干，也不要大于100μL)。稱之為濃縮液。

在7mL離心管中加入3mL蒽酮試劑，再將1.5mL離心管中的濃縮液加入，室溫下放置2h(25℃)；在620nm下測定吸光度值，來計算果糖的含量。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因煙草的根部，果糖的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型煙草，莖中的果糖含量也顯著性高于野生型煙草，葉片中的果糖含量與野生型煙草持平(圖13a)。

加入100μL 30％的KOH，在沸水浴中放10min，冷卻至室溫；在7mL離心管中加入3mL蒽酮試劑，再將1.5mL離心管中的濃縮液加入，40℃水浴10～15min；在620nm下測定吸光度值，來計算蔗糖含量。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因煙草的根部和莖中，蔗糖的含量要顯著性高于野生型煙草，葉片中的蔗糖含量略低于野生型煙草(圖13b)。

在7mL離心管中加入3mL蒽酮試劑，再將1.5mL離心管中的濃縮液加入，90℃加熱15min，流水冷卻至室溫；在620nm下測定吸光度值，從而計算出總糖的含量。結(jié)果表明，可溶性總糖達(dá)到野生型煙草的2倍左右，莖中總糖含量也偏高，可是不如根中明顯，而葉片中，可溶性總糖含量總體趨勢略低于野生型煙草的可溶性總糖含量(圖13c)。

綜述所述，VvSUC27基因的導(dǎo)入，促進(jìn)了植株根中糖分的積累，使得植物根部糖含量增加。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。