一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法，包括：克隆水稻受體材料的OsLCT1外顯子；利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，根據(jù)外顯子序列選擇靶標(biāo)序列，構(gòu)建pCRISPR/Cas9重組載體；將pCRISPR/Cas9重組載體導(dǎo)入水稻愈傷組織中得到轉(zhuǎn)基因苗；篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株；獲得突變植株；將突變植株進(jìn)行繁種，于后代植株中分離不含轉(zhuǎn)基因成分的功能缺失突變體。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向敲除水稻OsLCT1，徹底失活鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsLCT1，定向育成不帶轉(zhuǎn)基因成分，稻米鎘含量顯著降低，綜合農(nóng)藝性狀無顯著變異的水稻材料，具有安全、高效、節(jié)約時(shí)間、成本低等優(yōu)勢(shì)。
【專利說明】
一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及水稻生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國工業(yè)化和城市化的不斷發(fā)展，工業(yè)"三廢"、城市垃圾及污水灌溉等造成 土壤重金屬污染不斷加劇。其中，重金屬鎘(Cadmium，Cd)在土壤一食物鏈中的活躍迀移已 對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。近些年來，稻米鎘超標(biāo)事件屢現(xiàn)報(bào)端，對(duì)我國糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重 的安全挑戰(zhàn)，引起國家各部委的高度重視。針對(duì)這一現(xiàn)狀，全國廣泛開展鎘低積累水稻品種 篩選和相關(guān)農(nóng)藝栽培技術(shù)研究，在效果與副作用、成本與時(shí)間周期等方面，還存在諸多需要 解決的問題。而定向改良水稻的鎘積累性狀，培育低鎘品種是解決稻米鎘超標(biāo)問題最環(huán)保、 最經(jīng)濟(jì)的方法。
[0003] 隨著研究的深入，水稻吸收、輸運(yùn)、分配和籽粒積累鎘的生理過程機(jī)制已逐漸明 晰：（1)根毛細(xì)胞從土壤溶液中吸收Cd2+; (2)木質(zhì)部介導(dǎo)Cd由根轉(zhuǎn)運(yùn)到莖和葉；（3)在莖節(jié) 中，部分Cd由木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到韌皮部中，再由韌皮部介導(dǎo)Cd優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)到上部莖節(jié)，并最終轉(zhuǎn)運(yùn) 到籽粒中；（4)在灌漿成熟期，葉中積累的Cd再次活化，由韌皮部介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中，這部分 Cd占籽粒Cd積累量的近一半。目前傳統(tǒng)的改良品種的籽粒鎘含量方法為利用低鎘材料與受 體材料雜交、回交，結(jié)合后代農(nóng)藝性狀觀察和鎘含量鑒定多代篩選，這樣的育種方法育種周 期長，并且無論回交多少代都會(huì)多少滲入與靶標(biāo)基因連鎖的其他基因，改變遺傳背景，影響 受體品種的農(nóng)藝性狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于CRISPR/Cas9系 統(tǒng)靶向突變OsLCTl降低水稻籽粒鎘含量的育種方法，利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向敲除水稻 OsLCTl，徹底失活鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsLCTl，定向育成不帶轉(zhuǎn)基因成分，稻米鎘含量顯著降低，綜 合農(nóng)藝性狀無顯著變異的水稻材料，具有安全、高效、節(jié)約時(shí)間、成本低等優(yōu)勢(shì)。
[0005] 為此，本發(fā)明提供了一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法，包括以下步驟：
[0006] S1、克隆水稻受體材料的OsLCT 1的第三個(gè)外顯子、測序；
[0007] S2、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，根據(jù)計(jì)第三個(gè)外顯子序列選擇靶標(biāo)序列；
[0008] S3、構(gòu)建含所述靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體；
[0009] S4、將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導(dǎo)入水稻愈傷組織中得到轉(zhuǎn)基因苗；
[0010] S5、篩選所述轉(zhuǎn)基因苗中的轉(zhuǎn)基因陽性植株；
[0011] S6、利用所述轉(zhuǎn)基因陽性植株獲得突變植株；
[0012] S7、將所述突變植株進(jìn)行繁種，于后代植株中分離不含轉(zhuǎn)基因成分的功能缺失突 變體，即為稻米鎘含量降低的水稻。
[0013] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S2中設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列的的一條鏈具有5'- (N) x-NGG-3 '結(jié)構(gòu)，所述N表示A，T，C和G中的任意一個(gè)，所述X為19或20。
[0014] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述靶標(biāo)序列包括TPS1和TPS2，所述TPS1的DNA序列為 SEQIDN0.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列為SEQIDN0.3所示的序列。
[0015] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S3具體包括以下步驟：
[0016] S3-1、根據(jù)靶標(biāo)序列以及酶切位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)帶粘性末端的接頭引物；
[0017] S3-2、酶切原始載體；
[0018] S3-3、將所述帶粘性末端的接頭引物退火后連接到酶切過的原始載體上，得到重 組gRNA表達(dá)盒；
[0019] S3-4、將所述重組gRNA表達(dá)盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020] S3-5、酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，將酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到酶切過的pCRISPR/Cas9載體上， 得到重組載體。
[0021] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S3-1中所述接頭引物包括TSP1-F、TSP1-R、 TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列為SEQ ID勵(lì).4所示的序列，所述了?51-1?的0嫩序列 為SEQIDN0.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列為SEQIDN0.6所示的序列 ；所述TPS2-R 的DNA序列為SEQIDN0.7所示的序列。
[0022]上述的育種方法，優(yōu)選的，所述原始載體為pU3-gRNA或pU6a-gRNA。
[0023]上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S3-2中采用Bsa頂每切所述原始載體。
[0024]上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S3-5中采用Bsa頂每切所述擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0025] 主要利用了Bsa I的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外的特點(diǎn)，便于一次酶切產(chǎn)生多種帶 不同粘性末端的DNA片段，一次完成酶切、連接。
[0026] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S3-3中，所述帶粘性末端的接頭引物位于所述 表達(dá)載體的兩個(gè)Bsa I內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，形成重組的gRNA表達(dá)盒。
[0027] 上述的育種方法，優(yōu)選的，所述步驟S6步驟具體為：提取所述轉(zhuǎn)基因陽性植株的 DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物;對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，選擇兩個(gè)等位OsLCTl均發(fā)生功 能缺失突變的To代純合突變體和雙等位突變體的植株作為突變植株。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0029] (1)本發(fā)明提供了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變OsLCTl降低水稻籽粒鎘含 量的育種方法。OsLCTl是目前在水稻中唯一鑒定出來的參與韌皮部運(yùn)輸Cd的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白，OsLCTl RNAi株系的籽粒的Cd含量可降至對(duì)照的50%左右，其形態(tài)表型、生物產(chǎn)量和經(jīng) 濟(jì)產(chǎn)量較對(duì)照無顯著差別。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，定點(diǎn)突變OsLCTl，快速定向改良 水稻的籽粒鎘積累性狀，獲得鎘含量顯著降低的水稻材料可以不帶轉(zhuǎn)基因成分。這種技術(shù) 方法一方面規(guī)避了轉(zhuǎn)基因可能帶來的安全隱患，另一方面由于是靶向突變，具有DNA損傷 小，突變位點(diǎn)可控的優(yōu)勢(shì)。
[0030] (2)本發(fā)明提供了一種基于CRISPR/Csa9系統(tǒng)靶向突變OsLCTl降低水稻籽粒鎘含 量的育種方法，采用5' _(N)x-NGG-3 '結(jié)構(gòu)的靶標(biāo)序列，靶標(biāo)序列NGG上游的12bp在水稻基因 組中有較好的特異性，能顯著降低脫靶概率。
[0031] (3)本發(fā)明提供了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變OsLCTl降低水稻籽粒鎘含 量的育種方法，大大縮短了育種周期，加快了育種進(jìn)程，節(jié)省了時(shí)間和成本。
[0032] (4)本發(fā)明提供了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變OsLCTl降低水稻籽粒鎘含 量的育種方法，由于是靶向定點(diǎn)突變，不改變受體材料的遺傳背景;而傳統(tǒng)雜交、回交的育 種方法，無論回交多少代都會(huì)多少滲入與靶標(biāo)基因連鎖的其他基因，改變遺傳背景，影響受 體品種的農(nóng)藝性狀。
【附圖說明】
[0033]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例 中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0034]圖1為實(shí)施例1中的1^代植株潮霉素陽性檢測結(jié)果;其中1-20分別表示20株不同的 !^代植株，CK+表示陽性對(duì)照，ΟΓ表示陰性對(duì)照。
[0035]圖2為實(shí)施例1中的突變體oslctl和對(duì)照WT的糙米Cd含量;材料于4mg/kg的鎘脅迫 盆栽種植，二次重復(fù)。
[0036]圖3為實(shí)施例1中的突變體oslctl和對(duì)照WT的糙米此、〇1、？6、211含量;材料于411^/ kg的錦脅迫盆栽種植，三次重復(fù)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而 限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038] 實(shí)施例
[0039] 以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0040] 實(shí)施例1:
[0041] 本發(fā)明的一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法，有效改良水稻籽粒的鎘積累性 狀，步驟如下：
[0042] 1)克隆粳稻品種107的OsLCTl第三個(gè)外顯子，即自O(shè)sLCTl翻譯起始密碼子ATG后第 214~1533位的核苷酸序列，進(jìn)行測序。測序結(jié)果為SEQ ID NO. 1所示的序列：

[0044] 2)根據(jù)步驟1)中第三個(gè)外顯子序列，設(shè)計(jì)兩條靶標(biāo)序列，分別為TPS1和TPS2:
[0045] TPS1(SEQ ID NO.2)：CCGCGTCGTTTGGGATCCTCAGG；
[0046] TPS2(SEQ ID NO.3)：CCGTGGTCTCTGGGGATAGTCAT〇
[0047] 以上兩條靶標(biāo)序列的反向互補(bǔ)鏈含有5'-(N)x-NGG_3'結(jié)構(gòu)。其中，下劃線部分為 5 ' -(N)x-NGG-3 '結(jié)構(gòu)中的NGG的互補(bǔ)鏈序列。
[0048] 3)含TPS1、TPS2雙靶點(diǎn)pCRI SPR/Cas9重組載體的構(gòu)建：
[0049] 3.1、合成帶粘性末端的靶標(biāo)序列雙鏈，作為接頭引物：
[0050] TPS1包括合成正向寡核苷酸鏈TSP1-F(SEQIDN0.4)和與之互補(bǔ)的反向寡核苷酸 鏈TSP1-R(SEQIDN0.5)，TPS2包括合成正向寡核苷酸鏈TSP2-F(SEQIDN0.6)和與之互補(bǔ) 的反向寡核苷酸鏈TSP2-R(SEQIDN0.7)，具體序列為 ：
[0055] 其中，未劃線的部分為靶標(biāo)序列TPS1(SEQIDN0.2)、TPS2(SEQIDN0.3)中去除 NGG的序列或其互補(bǔ)序列，下劃線部分為用于連接載體的粘性末端。
[0056] 3 · 2、構(gòu)建 pCRISPR/Cas9 重組載體：
[0057] 3.2.1接頭的制備:將接頭引物TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R分別溶解成100μΜ 的母液，各取lyL，其中TSP1-F與TSP1-R混合，TSP2-F與TSP2-R混合，稀釋到ΙμΜ。在95°C下放 置30S，移至室溫冷卻，完成退火。
[0058] 3.2.2酶切口1]3巧1?嫩41]6311?嫩載體：在2(^1^反應(yīng)體系中用101]883頂每切口1]3-gRNA、pU6a-gRNA載體20min，在70°C下放置5min使酶失活，得到酶切后的pU3-gRNA、pU6a-gRNA載體。
[0059] 3.2.3將步驟3.2.1中得到的接頭與步驟3.2.2得到的pU3-gRNA、pU6a-gRNA載體的 連接反應(yīng)：取lyL 10x T4 DNA ligase buffer，0.5yL pU3-gRNA/pU6a-gRNA載體（12ng)，ly LTSP2/TSPl，lyL T4 DNA ligase(35U)，最后加 ddH20至總體積 10μ1，在20°C~25°C下連接 15min，得到重組的 sgRNA 表達(dá)盒：pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSP 1 -gRNA。
[0060] 3.2.4PCR擴(kuò)增表達(dá)盒：用K0D高保真酶，和U3-F、U3-R引物對(duì)、擴(kuò)增步驟3.2.3中得 到的口1]313?211?麻 ；用1(00高保真酶，和1]6&4、1]6&-1?引物對(duì)、擴(kuò)增步驟3.2.3中得到的 pU6a-TSPl-gRNA表達(dá)盒。其中引物對(duì)的序列分別為：
[0065]反應(yīng)體系為：lyL pU3-TSP2-gRNA/pU6a-TSPl-gRNA載體，0.5yL U3-F/U6a-F，0.5y L U3-R/U6a-R，4yL dNTP，15yL 2xbuffer，0.5yL KOD酶，加 ddH20至總體積30yL。
[0066] 反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性lmin，28個(gè)循環(huán)：95°C變性10s，60°C退火15s，68°C延伸 20s。電泳，把擴(kuò)增后的pU3-TSP2-gRNA、pU6a-TSPl-gRNA表達(dá)盒等量混合，用PCR產(chǎn)物純化試 劑盒純化。
[0067] 3.2.5酶切擴(kuò)增產(chǎn)物、連接到酶切過的？0?13?1?/^&89載體上獲得?0?13?1?/^ &89重 組載體。具體構(gòu)建方法采用邊酶切邊連接的方法，以Bsa I為內(nèi)切酶。
[0068]反應(yīng)體系如下：lyL pU3-TSP2-gRNA(30ng)、pU6a-TSPl-gRNA表達(dá)盒混合物，lyL pCRISPR/Cas9載體（80ng)，lyL Bsa I(10U)，1.5yL lOxSmart Buffer，1.5yL ΑΤΡ(1πιΜ)，1μ L T4 DNA ligase(35U)，最后加 ddH2〇至總體積 15yL。
[0069] 反應(yīng)程序：在PCR儀上完成 12循環(huán)：37°C 5min、10°C 5min、20°C 5min。
[0070] 構(gòu)建方法可參照Ma等文獻(xiàn)A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Mol Plant(2015)。
[0071] 4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化水稻:將步驟3)中構(gòu)建好的pCRISPR/Cas9重組載體導(dǎo)入農(nóng) 桿菌種EHA105,用粳稻品種107的成熟種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。具體步驟如下： [0072] 將含有pCRISPR/Cas9重組載體的EHA105接種于YM瓊脂培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)2天得到培 養(yǎng)液。將收集到的培養(yǎng)液加入到含有l(wèi)〇〇mo 1 /L的乙酰丁香酮的NB液體培養(yǎng)基中，調(diào)0D600到 0.5得到菌液。將水稻愈傷組織在以上菌液中浸泡30min，用無菌水沖洗3~5次，用滅菌濾紙 吸干水分，風(fēng)干，后轉(zhuǎn)移到NB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)26°C~28°C暗培養(yǎng)3天。然后轉(zhuǎn)移愈傷組織至 含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基26°C~28°C暗培養(yǎng)，每15天繼代一次，繼代2次?？剐院Y選后，轉(zhuǎn) 入到再生培養(yǎng)基，分化出轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)潮霉素 PCR檢測，共獲得23株轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0073] 5)突變位點(diǎn)的鑒定：
[0074] 5.1、提取上述轉(zhuǎn)基因陽性植株的基因組DNA。
[0075] 5.2、針對(duì)含靶標(biāo)位點(diǎn)的800bp以內(nèi)的DNA片段，設(shè)計(jì)特異性引物，以Το代轉(zhuǎn)基因水 稻的基因組DNA或cDNA為模板，擴(kuò)增含靶標(biāo)位點(diǎn)的DNA片段，具體步驟為：
[0076]以步驟5.1中提取的DNA為模板，以T-C-F4和T-C-R4為上游引物和下游引物，用高 保真酶擴(kuò)增包含雙靶標(biāo)位點(diǎn)的DNA片段。
[0077] T-C-F4：GTCGGCGTGCTCTTCGGCGT(SEQ ID NO.12)；
[0078] T-C-R4:CTCCCGGTCGCATGGTCAGGT(SEQ ID N0.13)。
[0079] 反應(yīng)體系：〇.5yL DNA模板，lyL T-C-F4，lyL T-C-R4,4yL dNTP，15yL 2xbuffer， 0.5yL K0D酶，加 ddH20至總體積30yL。
[0080] 反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性3min，30個(gè)循環(huán):98°C變性10s，64°C退火30s，68°C延伸40s。
[0081] 5.3、擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測序，測序結(jié)果與野生型植株序列比對(duì)， 對(duì)于測序結(jié)果為疊峰的樣品，TA克隆，挑取10個(gè)左右單克隆，測序比對(duì)分析樣品基因型，部 分突變分析結(jié)果如表1所示。
[0082] 表1 :CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入的To代轉(zhuǎn)基因植株突變序列分析結(jié)果表
[0085]表1為實(shí)施例1中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入的To代轉(zhuǎn)基因植株突變序列分析;6-7、 7-1等表示不同的轉(zhuǎn)基因株系，CK表示對(duì)照;WT表示野生型;標(biāo)注下劃線的字母為NGG序列的 反向互補(bǔ)序列；表示此處堿基省略；表示堿基缺失，"Inv"表示倒位，其后的數(shù)字 表示堿基數(shù)。
[0086]從表1的測序結(jié)果表明，獲得的23株To代轉(zhuǎn)基因植株全部發(fā)生靶向InDel突變，突 變率為100%，主要突變類型為兩個(gè)靶位點(diǎn)間的序列缺失或倒位。
[0087] 6)根據(jù)測序比對(duì)結(jié)果，選取OsLCTl開放閱讀框發(fā)生移碼突變或提前終止，導(dǎo)致兩 個(gè)等位OsLCTl均發(fā)生功能缺失突變的To代純合突變株系7-1和雙等位突變株系7-3,繁種， 于!^代轉(zhuǎn)基因分離群體分子檢測潮霉素、Cas9等轉(zhuǎn)基因元件，結(jié)果參見圖2,分離不帶轉(zhuǎn)基 因成分的功能缺失突變體。
[0088]兩個(gè)等位OsLCTl基因均發(fā)生功能缺失突變是指兩個(gè)等位OsLCTl基因在靶標(biāo)位置 處均發(fā)生移碼突變或提前終止。純合突變體是指兩個(gè)等位OsLCTl基因發(fā)生同一種的突變， 雙等位突變體是指兩個(gè)等位OsLCTl基因發(fā)生兩種不同的突變。
[0089] 7)采取人工模擬鎘脅迫的盆栽試驗(yàn)，土壤取自大田表層，測定基礎(chǔ)肥力，風(fēng)干、過 篩、去雜、混勾，分裝至每盆25mg/kg，將Cd(CdCl2)以溶液形式加入備用土壤，錦處理濃度為 4mg/kg，平衡4周待用。
[0090] 將步驟7中的功能缺失突變體及對(duì)照種植于鎘污染盆，每盆6穴，每穴2株，三次重 復(fù)。于水稻成熟期，考察主要農(nóng)藝性狀，并鑒定糙米鎘含量及其他相關(guān)礦質(zhì)元素含量，結(jié)果 參見圖2、圖3。結(jié)果顯示，oslctl糙米鎘含量較對(duì)照顯著降低，而其他相關(guān)金屬元素并無顯 著影響，該方法可用于水稻籽粒鎘含量的分子改良。
[0091] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖 然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi) 容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因 此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何 簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降低水稻籽粒鎘含量的育種方法，其特征在于，包括以下步驟： 51、 克隆水稻受體材料的OsLCTl的第三個(gè)外顯子，測序； 52、 利用CRI SPR/Cas9系統(tǒng)，根據(jù)OsLCT 1第三個(gè)外顯子序列選擇靶標(biāo)序列； 53、 構(gòu)建含所述靶標(biāo)序列片段的pCRISPR/Cas9重組載體； 54、 將所獲得的pCRI SPR/Cas9重組載體導(dǎo)入水稻愈傷組織中得到轉(zhuǎn)基因苗； 55、 篩選所述轉(zhuǎn)基因苗中的轉(zhuǎn)基因陽性植株； 56、 利用所述轉(zhuǎn)基因陽性植株獲得突變植株； 57、 將所述突變植株進(jìn)行繁種，于后代植株中分離不含轉(zhuǎn)基因成分的功能缺失突變體， 即為稻米鎘含量降低的水稻。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S2中設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列的的一 條鏈具有5 ' - (N) x-NGG-3 '結(jié)構(gòu)，所述N表示A，T，C和G中的任意一個(gè)，所述X為19或20。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的育種方法，其特征在于，所述靶標(biāo)序列包括TPS1和TPS2,所述 TPS1的DNA序列為SEQIDN0.2所示的序列，所述TPS2的DNA序列為SEQIDN0.3所示的序 列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S3具體包括以 下步驟： S3-1、根據(jù)靶標(biāo)序列以及酶切位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)帶粘性末端的接頭引物； S3-2、酶切原始載體； S3-3、將所述帶粘性末端的接頭引物退火后連接到酶切過的原始載體上，得到重組的 gRNA表達(dá)盒； S3-4、將所述重組gRNA表達(dá)盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物； S3-5、酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，將酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到酶切過的pCRISPR/Cas9載體上得到 重組載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S3-1中所述接頭引物包括 TSP1-F、TSP1-R、TSP2-F和TSP2-R，所述TPS1-F的DNA序列為SEQIDN0.4所示的序列，所述 TPS1-R的DNA序列為SEQIDN0.5所示的序列，所述TPS2-F的DNA序列為SEQIDN0.6所示的 序列 ；所述TPS2-R的DNA序列為SEQIDN0.7所示的序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的育種方法，其特征在于，所述原始載體為pU3-gRNA或pU6a-gRNA。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S3-2中采用Bsa頂每切所述 原始載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S3-3中，所述帶粘性末端的 接頭引物位于所述表達(dá)載體的兩個(gè)Bsa頂每切位點(diǎn)之間，形成重組的gRNA表達(dá)盒。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的育種方法，其特征在于，所述步驟S3-5中，采用Bsa頂每切所述 擴(kuò)增產(chǎn)物。10. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5、6、7、8和9中任一項(xiàng)所述的育種方法，其特征在于，所述步驟 S6步驟具體為:提取所述轉(zhuǎn)基因陽性植株的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物;對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行測序，選擇兩個(gè)等位OsLCTl均發(fā)生功能缺失突變的To代純合突變體和雙等位突變體 的植株作為突變植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105936907SQ201610269268
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】唐麗, 趙炳然, 李曜魁, 呂啟明, 韶也, 毛畢剛, 胡遠(yuǎn)藝, 彭彥
【申請(qǐng)人】湖南雜交水稻研究中心