本發(fā)明涉及的是基因工程的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種基于zmmikc2a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒淀粉含量的方法。

背景技術(shù)：

淀粉是植物種子的主要組成部分，作為光合作用的最終產(chǎn)物，是取之不盡用之不竭的天然材料。淀粉不僅可以作為糧食、飼料，而且是重要的工業(yè)原材料，廣泛用于食品、化工、能源、機(jī)械、建筑、制藥等行業(yè)。水稻中，淀粉為水稻胚乳的主要組成成分，其含量和品質(zhì)直接影響著水稻種子的品質(zhì)。

淀粉根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例以及支鏈淀粉的分支鏈結(jié)構(gòu)決定著水稻的品質(zhì)，同時(shí)直鏈淀粉和直鏈淀粉之間的比例還決定著淀粉的用途。直鏈淀粉生產(chǎn)的可再生、可降解膜應(yīng)用于農(nóng)用薄膜加工業(yè)和包裝工業(yè)，可以減少工業(yè)廢氣及減弱溫室效應(yīng)氣體的釋放，高直鏈淀粉還是生產(chǎn)光解塑料的最佳原料，用于一次性餐具，是解決日益嚴(yán)重的“白色污染”的有效途徑；支鏈淀粉具有更好的薪性，可增加膨化食品的體積，作為食品添加劑具有不同于直鏈淀粉的效果，在黏合劑領(lǐng)域具有較多應(yīng)用。

一般來說，結(jié)構(gòu)良好的天然淀粉在胃腸道內(nèi)能被迅速消化吸收，不會(huì)再有多余淀粉進(jìn)入結(jié)腸供細(xì)菌發(fā)酵而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。而結(jié)構(gòu)不良的淀粉，要使用各種理化方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后方能投入應(yīng)用。這會(huì)面使生產(chǎn)成本大大增加。此外，食用結(jié)構(gòu)不良淀粉也使人類的營(yíng)養(yǎng)和健康狀況受到嚴(yán)重影響。此外，淀粉食品的風(fēng)味及貯存性質(zhì)在不同程度上也受淀粉結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)踐證明，用高直鏈淀粉作為食品的添加劑口感和效果都比普通淀粉好。在這種需求下，淀粉結(jié)構(gòu)形成機(jī)理成為近期研究工作中的熱點(diǎn)，由于淀粉在人類生活中的重要作用，對(duì)于淀粉品質(zhì)的改良及淀粉生物合成已成為研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，糧食作物與淀粉合成相關(guān)基因的相繼克隆，人們期望通過對(duì)這些基因進(jìn)行調(diào)控以改良淀粉的含量及直鏈和支鏈淀粉的構(gòu)成，這使得在作物體內(nèi)直接生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)適宜的、能滿足人類相應(yīng)需求的“天然淀粉”已成為可能。

在禾谷類胚乳中淀粉的合成是一個(gè)多酶催化的復(fù)雜過程，主要涉及四大類酶：adp-葡萄糖焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(sss)、淀粉分支酶(sbes)、淀粉去分支酶(dbes)。這四大類酶都包括許多家族成員，各成員又有精細(xì)分工，在淀粉合成過程中發(fā)揮不同的作用。直鏈淀粉是由α-1,4糖普鍵連接的線性多聚物，通常只含有很小程度的分支。在正常作物種子中，直鏈淀粉約占儲(chǔ)藏淀粉的20-30％，它對(duì)于淀粉顆粒的形成并非必要。淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)主要是由于支鏈淀粉的折疊而形成的。agpase是淀粉合成過程中非常關(guān)鍵的酶，因此其對(duì)其活性的影響會(huì)直接影響到淀粉的合成。淀粉合成酶是通過催化α-1,4-葡聚糖鏈，在adp-葡萄糖上不斷的添加寡聚糖，從而實(shí)現(xiàn)葡聚糖鏈的延伸。根據(jù)淀粉體中存在的狀態(tài)，可分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule-boundstarchsynthase，gbss)和可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase，sss)。直鏈淀粉主要是由顆粒結(jié)合型淀粉合成酶gbssi負(fù)責(zé)合成的。淀粉合成酶將adpg(adp-葡萄糖)中的葡萄糖基添加到支鏈淀粉的分支鏈或直鏈淀粉的非還原性末端。淀粉合成酶可分為5個(gè)家族：ssi、ssii、ssiii、ssiv和gbss。它們分別延伸支鏈淀粉中不同聚合度的支鏈，或者延伸線性的直鏈淀粉鏈。gbss家族有兩個(gè)成員：gbssi和gbssii。gbssi由wx基因編碼，主要負(fù)責(zé)胚乳和花粉粒中直鏈淀粉的合成。gbssii主要在葉片中表達(dá)，負(fù)責(zé)非儲(chǔ)藏器官中的直鏈淀粉的合成。在玉米、小麥、水稻、馬鈴薯的gbssi缺失突變體中，貯藏器官淀粉粒中僅含有支鏈淀粉組分，幾乎不含有直鏈淀粉成分。gbssi是唯一能夠連續(xù)地延伸直鏈淀粉的淀粉合成酶，生成長(zhǎng)的寡糖鏈。多糖鏈的分支通過淀粉分支酶來實(shí)現(xiàn)，在淀粉分支酶(sbe)催化作用下，剪切掉多糖鏈內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，釋放還原端，產(chǎn)生一個(gè)α-1，6糖苷鍵，結(jié)合上可溶性糖鏈形成分支。sbe在支鏈淀粉合成過程中扮演著不同的角色，由于直鏈淀粉分支較少，sbe在直鏈淀粉的分支過程中也一定起重要作用。淀粉去分支酶的功能是去除一些不規(guī)則的分支。對(duì)玉米、水稻和擬南芥的isa酶突變體分析發(fā)現(xiàn)，該酶的突變能直接導(dǎo)致淀粉含量的降低，不正常的淀粉結(jié)構(gòu)、顆粒形態(tài)和植物糖原的積累，而pul主要在淀粉降解過程中起作用，然而在淀粉合成過程中也起作用，其突變影響淀粉含量和結(jié)構(gòu)。

綜上，通過基因工程手段培育直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例各不相同的植物對(duì)于淀粉工業(yè)化生產(chǎn)是迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于zmmikc2a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒淀粉含量的方法，以提供一種能夠提高水稻籽粒直鏈淀粉含量和直鏈淀粉/總淀粉比例的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種基于zmmikc2a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒淀粉含量的方法，所述zmmikc2a基因?yàn)橄率鰅)或ii)的dna分子：

i)核苷酸序列如seqidno.1所示的dna分子；

ii)核苷酸序列與seqidno.1至少具有98％同一性且編碼如seqidno.2所示的氨基酸序列的dna分子；

所述方法為：以人工合成或基因克隆方法獲得所述zmmikc2a基因，構(gòu)建zmmikc2a基因過量表達(dá)載體，并將過量表達(dá)載體導(dǎo)入目的水稻基因組中，得到籽粒直鏈淀粉含量以及直鏈淀粉/總淀粉比例均高于目的水稻的zmmikc2a基因過量表達(dá)植株。

所述zmmikc2a基因的獲得方法為基因克隆法，具體步驟包括：提取玉米籽粒胚乳或玉米花絲rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以cdna為模板，根據(jù)zmmikc2a基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

進(jìn)一步地，所述特異性擴(kuò)增引物序列為：

mikc2a-f：5′-atgggtaggggaaggattga-3′

mikc2a-r：5′-ttagaactgatgatgagggttattg-3′

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，zmmikc2a基因過量表達(dá)載體為多克隆位點(diǎn)區(qū)域依次連接有35s啟動(dòng)子、zmmikc2a基因和終止子的pcambia1301植物表達(dá)載體。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種基于zmmikc2a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒淀粉含量的方法，該方法利用zmmikc2a基因?qū)χ参镒蚜５矸酆铣上嚓P(guān)基因的正調(diào)控作用，通過基因工程的方法改變水稻籽粒中直鏈淀粉含量和直鏈淀粉/總淀粉比例，獲得具有高直鏈淀粉的轉(zhuǎn)基因水稻新品種，對(duì)利用基因工程技術(shù)開發(fā)具有特定功能的轉(zhuǎn)基因水稻新品種具有重要的實(shí)踐意義。

附圖說明

圖1為peasy-t1載體圖譜；

圖2為pcambia1301載體圖譜；

圖3為zmmikc2a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒大小和千粒重測(cè)定結(jié)果柱狀圖；其中圖3a為水稻籽粒長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果，圖3b為水稻籽粒寬度測(cè)定結(jié)果，圖3c為水稻籽粒厚度測(cè)定結(jié)果，圖3d為水稻籽粒千粒重測(cè)定結(jié)果；wt為野生型植株，c1-3為轉(zhuǎn)p1空載體的轉(zhuǎn)基因植株，l1-5為過量表達(dá)植株；

圖4為zmmikc2a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量柱狀圖；其中圖4a為直鏈淀粉含量，圖4b為總淀粉含量；wt為野生型植株，c1為轉(zhuǎn)p1空載體的轉(zhuǎn)基因植株，l1-5為過量表達(dá)植株。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料

本實(shí)施例所用方法如無(wú)特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無(wú)特別說明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。

2、方法

2.1zmmikc2a基因的獲得

選取玉米b73品種授粉后16天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳rna并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以玉米胚乳cdna為模板，根據(jù)zmmikc2a基因序列和玉米b73基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物mikc2a–f-1、mikc2a–r-1，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

引物序列為：

mikc2a–f-1：5′-ggggtaccatgggtaggggaaggattga-3′

mikc2a–r-1：5′-tcccccgggttagaactgatgatgagggttat-3′

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，預(yù)變性10min；98℃，變性20s；60℃，退火20s；72℃，延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃，復(fù)性10min；10℃保存。

將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量比為2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段并連接至peasy-t1載體(購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司，載體圖譜如圖1所示)，獲得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)trans5α細(xì)胞中，提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒做模板，以mikc2a-f-1、mikc2a-r-1為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，同時(shí)用kpni和smai雙酶切質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，篩選陽(yáng)性克隆子，將陽(yáng)性克隆子送去華大生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用mega4.0軟件比對(duì)，結(jié)果與預(yù)測(cè)一致。獲得的重組質(zhì)粒命名為t-mikc2a。

2.2zmmikc2a基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建

以pcambia1301(購(gòu)于上海捷蘭生物技術(shù)有限公司，載體圖譜如圖2所示)為原始載體，在其多克隆位點(diǎn)的ecori和saci酶切位點(diǎn)之間連接一個(gè)35s啟動(dòng)子，并在sphi和hindiii酶切位點(diǎn)之間加上一段nos終止子，獲得改造的載體p1。用kpni和smai雙酶切t-mikc2a得到小的目的片段，同時(shí)用kpni和smai雙酶切p1得到大的目的片段，將上述兩片段使用t4連接酶連接，構(gòu)建獲得載體p1-zmmikc2a，作為轉(zhuǎn)水稻的zmmikc2a基因過量表達(dá)載體。

2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的zmmikc2a基因過量表達(dá)植株的獲得

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的過量表達(dá)植株的獲得方法及培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基配方參見文獻(xiàn)：methodsinmolecularbiology，vol.343：agrobacteriumprotocols，2/e，volume1，具體包括以下步驟：

2.3.1水稻成熟胚誘導(dǎo)愈傷的獲得

在實(shí)驗(yàn)前，將目的水稻的成熟種子在強(qiáng)太陽(yáng)光下曬3-4h后對(duì)其去殼處理。先用滅菌水洗，水至清，再用75％(質(zhì)量)乙醇浸泡5min，然后用滅菌水、次氯酸和吐溫配制的殺菌水(具體比例：滅菌水：次氯酸＝1：1，總體積：吐溫＝1ml:1ul)浸泡30min，期間不停的搖晃，從而進(jìn)行表面滅菌，之后用無(wú)菌水沖洗，直至水變澄清，再將成熟種子放在滅菌濾紙上吸干水分后，取其于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26±1℃培養(yǎng)；10-15d后，將誘導(dǎo)出的乳黃色愈傷轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，繼代兩次后挑選繼代培養(yǎng)5-7d，將色澤淡黃的愈傷用于共培養(yǎng)。

2.3.2用于轉(zhuǎn)化水稻的農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備

將p1-zmmikc2a轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404中，獲得重組農(nóng)桿菌lba4404/p1-zmmikc2a，同時(shí)將未連接zmmikc2a的p1空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌lba4404中，獲得重組農(nóng)桿菌lba4404/p1作為對(duì)照。分別將重組農(nóng)桿菌lba4404/p1-zmmikc2a、lba4404/p1接種于yep液體培養(yǎng)基(含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6-1.0；室溫下5000rpm離心5min收集菌體，隨后將其懸浮于液體共培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至od600＝0.4，獲得共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。

2.3.3農(nóng)桿菌侵染水稻營(yíng)養(yǎng)器官

挑選色澤鮮嫩、呈乳黃的愈傷，集中放入100ml無(wú)菌三角瓶中，加入上述制備好的農(nóng)桿菌懸浮液(懸浮液以淹沒愈傷為好)；28℃，220rpm搖床上培養(yǎng)20-30min；倒掉菌液，將侵染后的愈傷置于含無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)2-3d。

2.3.4選擇培養(yǎng)

將共培的愈傷先用滅菌水清洗直至水變澄清，棄去清洗液，轉(zhuǎn)入含有羧芐青霉素(100mg/ml)的溶液中振蕩清洗30min以上，用無(wú)菌濾紙吸干，置于含無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中干燥處理；再將愈傷挑選到含有羧芐青霉素(500mg/ml)和潮霉素(50mg/l)篩選培養(yǎng)基上，28℃光照培養(yǎng)30d左右，直至長(zhǎng)出新的抗性愈傷。

2.3.5抗性愈傷的分化

從篩選培養(yǎng)基上挑選長(zhǎng)勢(shì)較好呈乳黃色的新愈傷于含有50mg/l潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先28℃暗培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)移到30℃條件下進(jìn)行全光照培養(yǎng)，15-30d，有綠點(diǎn)出現(xiàn)；30-40d后會(huì)分化出幼苗。

2.3.6生根、壯苗和移栽

待分化出的幼苗h≥3cm時(shí)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周；選擇h≥15cm、根系發(fā)達(dá)的幼苗，加水室溫下煉苗2-3d后，用溫水洗去培養(yǎng)基，移入含水稻培養(yǎng)土的水桶中栽培。待苗生長(zhǎng)健壯后移入水田中生長(zhǎng)，獲得26株獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)zmmikc2a基因水稻苗和43株轉(zhuǎn)p1空載體的水稻苗。

2.4轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻，以提取的轉(zhuǎn)基因水稻總dna為模板，用目的基因zmmikc2a片段和潮霉素基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用以初步鑒定轉(zhuǎn)zmmikc2a基因植株；同時(shí)以潮霉素基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，初步鑒定轉(zhuǎn)p1空載體植株。

檢測(cè)目的基因zmmikc2a片段的引物：

mikc2a–f-2：5’-atgggtaggggaaggattga-3’

mikc2a–r-2：5’-ttagaactgatgatgagggttattg-3’

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6min。

檢測(cè)潮霉素基因的引物：

hyg-f：5’-taggagggcgtggatatggc-3’

hyg-r：5’-tacacagccatcggtccaga-3’

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，34個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10min。

結(jié)果，26株獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)zmmikc2a基因水稻苗中有22株同時(shí)擴(kuò)增出目的基因zmmikc2a片段和潮霉素基因，43株轉(zhuǎn)p1空載體的水稻苗中全部擴(kuò)增出潮霉素基因，將該22株轉(zhuǎn)zmmikc2a基因植株進(jìn)行southern雜交，全部驗(yàn)證通過，即獲得了22株t0代轉(zhuǎn)基因植株(命名為l1-22)和43株t0代轉(zhuǎn)p1空載體植株(命名為c1-43)。t0代轉(zhuǎn)基因植株成熟后，收獲t1代種子，t1代種子自交繁殖得到t2代種子。依次類推，獲得zmmikc2a基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻株系和轉(zhuǎn)p1空載體的對(duì)照株系。

2.5zmmikc2a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒大小和千粒重測(cè)定

選取五株轉(zhuǎn)基因株l1、l2、l3、l4、l5的t3代籽粒進(jìn)行大小和千粒重測(cè)量。籽粒大小使用游標(biāo)卡尺單粒逐個(gè)測(cè)量，五個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株其t3代籽粒分別選取了1000粒，分部對(duì)籽粒長(zhǎng)、寬以及厚度進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)至少三次重復(fù)；千粒重使用電子天平，每百粒計(jì)數(shù)稱重，五個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株其t3代籽粒分別選取10個(gè)100粒計(jì)重，相加數(shù)即為千粒重量，三個(gè)重復(fù)。

實(shí)驗(yàn)以野生型中花11(wt)和三株轉(zhuǎn)p1空載體株c1、c2、c3為對(duì)照，結(jié)果如圖3所示，五個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株籽粒的長(zhǎng)度(圖3a)、寬度(圖3b)、厚度(圖3c)以及千粒重(圖3d)變化不大，說明zmmikc1a基因的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻籽粒外部表型影響不大。

2.6zmmikc2a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量測(cè)定

取5株獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)基因株l1、l2、l3、l4、l5的t3代籽粒進(jìn)行直鏈淀粉和總淀粉測(cè)定，并以野生型目的玉米籽粒(wt)和轉(zhuǎn)p1空載體株c1做對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)測(cè)定至少重復(fù)三次，測(cè)定方法如下：

直鏈淀粉測(cè)定時(shí)，首先對(duì)籽粒中淀粉進(jìn)行提純，將烘干去硬殼和胚的種子在室溫下用0.4％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的naoh溶液浸泡48h，料液(樣本比0.4％的naoh溶液)比為1:3，洗滌后再用0.4％的naoh溶液浸泡24h，反復(fù)水洗至種子表面不再黏滑為止，瀝干水分，用膠體磨粉碎，淀粉乳過篩(200目)，離心(3000r/min,20min)，取下層白色沉淀,即為淀粉,將淀粉反復(fù)漂洗離心，40℃鼓風(fēng)干燥，粉碎，過篩(200目)，即得淀粉純品，用于直鏈淀粉的測(cè)定。直鏈淀粉的測(cè)定采用愛爾蘭megazyme公司生產(chǎn)的直鏈淀粉/支鏈淀粉分析試劑盒(貨號(hào)：k-amyl)，測(cè)定方法可參見試劑盒說明書，在此不做詳細(xì)描述。

總淀粉測(cè)定時(shí)，先將烘干的種子去硬殼和胚，再使用組織研磨儀將其研磨成粉末，40℃過夜烘干，過0.5mm篩(35目)?？偟矸蹨y(cè)定采用愛爾蘭megazyme公司生產(chǎn)的總淀粉測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：k-tsta)，具體為：將研磨后樣品(準(zhǔn)確稱量～100mg)加入到試管中(16×120mm)，確保全部樣品位于試管底部；加入0.2ml乙醇溶液(80％v/v)，用漩渦混合器混合；放入攪拌架子，加入2ml的2mol/l的koh至每個(gè)試管中，冰水混合浴中攪拌20min左右，重懸粉末和溶解抗性淀粉(注意：不要使用渦旋儀混勻，會(huì)使淀粉乳化，確保加入koh時(shí)，試管處于劇烈震蕩狀態(tài)。這是為了避免淀粉形成團(tuán)塊難以溶解)；當(dāng)試管在磁力攪拌器上攪拌時(shí)，加入8ml的1.2mol/l醋酸鈉緩沖液(ph3.8)至每個(gè)試管。立即加入0.1ml耐熱α-淀粉酶(試劑盒配置溶液)和0.1ml淀粉葡糖苷酶(試劑盒配置溶液)，充分混合，在50℃下孵育；孵育30min，間斷混勻；樣品淀粉含量>10％：將全部的溶液轉(zhuǎn)移到100ml的容量瓶中,用洗瓶沖洗試管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸餾水調(diào)整溶液體積至100ml,充分混勻。取部分溶液離心(1800rpm,10min)；轉(zhuǎn)移兩份稀釋的樣品溶液(0.1ml)到圓底試管中(16×100mm)；加入3.0mlgopod溶液(試劑盒配置溶液)到每一個(gè)試管中(包括葡萄糖對(duì)照和試劑空白對(duì)照),然后在50℃下孵育20min；葡萄糖對(duì)照包括0.1ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/ml)+3.0mlgopod溶液。試劑空白對(duì)照：0.1ml蒸餾水+3.0ml的gopod溶液；相對(duì)于試劑空白在510nm下測(cè)定每一個(gè)樣品和葡萄糖質(zhì)控的吸光度。計(jì)算公式如下：

δa＝相對(duì)于試劑空白所讀取的吸光度；fv＝總體積(例如100ml或10ml)；0.1＝樣品分析體積；1/1000＝轉(zhuǎn)化從μg至mg；100/w＝淀粉作為干粉重量的比例；w＝干粉重量；162/180＝d葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫氫葡萄糖；淀粉％(占干物質(zhì)比重)＝淀粉％×100/100-水分含量(％)。

結(jié)果如圖4所示,圖中可以看出，zmmikc1a轉(zhuǎn)基因水稻籽粒直鏈淀粉和總淀粉含量都有所提高，其中直鏈淀粉含量增加幅度在1.75％-21.03％(圖4a)，總淀粉含量增加幅度為1.65％-6.87％(圖4b)。zmmikc1a基因過量表達(dá)，提高了水稻籽粒中直鏈淀粉和總淀粉的含量，特別是直鏈淀粉含量。說明zmmikc1a基因能直接或間接影響淀粉合成過程中直鏈淀粉相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)直鏈淀粉表達(dá)起正調(diào)控作用。

以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。

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<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所

<120>一種基于zmmikc2a基因調(diào)節(jié)水稻籽粒淀粉含量的方法

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