本發(fā)明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種腈水解酶及其應用。

背景技術：

(r)-(-)-鄰氯扁桃酸是一種具有廣泛用途的醫(yī)藥中間體和精細化工品，主要用于抗血小板凝集藥物氯吡格雷的合成。氯吡格雷作為全球重磅級藥物，2010年全球銷售額近100億美元，2011和2012年的銷售額也都在90億美元以上。隨著2012年5月17號氯吡格雷專利到期，全球掀起了一股仿制熱潮。而作為其重要中間體的(r)-(-)-鄰氯扁桃酸隨之也水漲船高，國內外需求不斷增長，因此研究如何獲得高濃度、高純度的(r)-(-)-鄰氯扁桃酸將具有重要的市場意義。

國內外通過腈水解酶酶法制備(r)-(-)-鄰氯扁桃酸已有報道，但數(shù)量不多。張陳勝通過傳統(tǒng)的基因組探礦技術從stappiaaggregata中篩選到對鄰氯扁桃腈具有對映體選擇性的腈水解酶lan，產物(r)-(-)-鄰氯扁桃酸的ee值為96.5％，但活力不高。basf公司構建了來源于a.faecalisatcc8750的腈水解酶y296位的不同突變體，其中y296a突變體對外消旋的鄰氯扁桃腈的相對比活力為y296野生型的近10倍。y296c突變體對所檢測的每一個取代的扁桃腈都具有相當高的活力，而對于未發(fā)生取代的扁桃腈活力則沒有改變。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的重組腈水解酶，以解決上述問題。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種腈水解酶，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

如上所述的腈水解酶在催化合成r-鄰氯扁桃酸中的應用。

如上所述的腈水解酶在催化合成r-鄰氯扁桃酸的中間產物中的應用。

本發(fā)明以源于bradyrhizobiumjaponicumusda110的腈水解酶(bll6402，np_773042)氨基酸序列為模板進行改造，獲得的新型重組腈水解酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明可推動腈水解酶在手性醫(yī)藥中間體合成中的應用，極大降低r-鄰氯扁桃酸的生產成本，進而降低氯吡格雷的價格，具有很好的示范作用，將會產生良好的社會效益與經濟效益。而通過生物催化法的溫和反應條件將顯著降低能耗及三廢排放量。項目的順利實施不僅可以實現(xiàn)r-鄰氯扁桃酸的綠色生產，還可以為建立以腈水解酶為基礎的生物催化法制備手性藥物中間體等手性化合物的技術平臺提供技術支撐，能夠提高我國的生物、化工、醫(yī)藥等領域的手性藥物、手性食品添加劑和手性農藥及其中間體等的研發(fā)水平，有利于我國的綠色生產、工業(yè)生物技術的發(fā)展，有著廣闊的應用前景，對國民經濟的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

本發(fā)明還請求保護編碼權利要求1所述的腈水解酶的基因。

優(yōu)選的，所述基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

需要注意的是，本領域技術人員可根據本發(fā)明提供的腈水解酶的氨基酸，根據密碼子的簡并性原則等自行調整其核苷酸序列以及功能等價體，這些經過調整的序列也在本發(fā)明請求保護的范圍內。

此外，本發(fā)明還請求保護在嚴格條件下能夠與seqidno:2所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列；以及與上述序列互補的核苷酸序列。

功能等價體序列還包括與seqidno：2所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性，且具有腈水解酶活性的基因序列，可以從任何植物中分離獲得。其中，序列同一性的百分比可以通過公知的生物信息學算法來獲得，包括myers和miller算法(bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、needleman-wunsch全局比對法(j.mol.biol.，48(3)：443-53，1970)、smith-waterman局部比對法(j.mol.biol.，147：195-197，1981)、pearson和lipman相似性搜索法(pnas，85(8)：2444-2448，1988)、karlin和altschul的算法(altschul等，j.mol.biol.，215(3)：403-410，1990；pnas，90：5873-5877，1993)。這對于本領域技術人員來說是熟悉的。

一種表達載體，其包含如上所述基因的序列。

優(yōu)選的，所述表達載體為pqe30。

一種工程菌，其被如上所述的表達載體所轉化。

優(yōu)選的，所述工程菌為大腸桿菌。

更優(yōu)選的，所述工程菌為m15大腸桿菌菌株。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的腈水解酶可在12h反應時間里，共將600mm的底物完全水解，由于底物流加和ph調控的稀釋作用，累計產生了112g/l的產物鄰氯扁桃酸。整個反應過程中反應轉化率保持在90％以上。反應10h后停止流加，繼續(xù)反應2h后底物全部轉化完。反應速率非常快，反應轉化率也很高。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為發(fā)酵過程中od600的增長情況；

圖2為發(fā)酵過程中dcw的增長情況；

圖3為發(fā)酵過程中酶產量的增長情況；

圖4為連續(xù)流加反應制備r-鄰氯扁桃酸進程結果圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

1.1新型腈水解酶的基因挖掘

1.1.1序列篩選

以源于bradyrhizobiumjaponicumusda110的腈水解酶(bll6402，np_773042)氨基酸序列為模板，通過blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)程序搜索潛在的扁桃腈腈水解酶。我們設立了三個標準對blastp的結果進行篩選。首先氨基酸序列一致性高于90％或者低于30％的都被剔除掉，將與bll6402具有高度相同性和不同性的酶過濾掉。具有相同序列一致性的酶只保留一到兩個。第二個標準是序列的來源。來源于同一種屬的序列只保留一個。因為他們往往具有非常高的序列一致性和相同的酶學特性。來源于同一菌株的所有不同序列全部保留。第三個標準是來源菌株的可獲得性。

除去上面三個標準，所有經過實驗驗證具有腈水解酶活性的序列都被挑出來。這些酶的底物特異性大部分都經過了實驗驗證，為后面的系統(tǒng)進化分析提供分類依據。expasy蛋白質組學服務器上的scanprosite程序用來檢測篩選出的序列是否具有glu-lys-cys催化三聯(lián)體。

1.1.2數(shù)據分析

篩選出來的氨基酸序列用clustalw先進行聚類分析。聚類后的數(shù)據用mega4.0軟件包中的鄰接法進行系統(tǒng)進化分析。bootstrap值設定為1000。

1.2腈水解酶的定向進化

1.2.1突變子文庫構建

突變引物含有酶切位點(bamhi/hindiii)及保護堿基。以質粒bcj2315/pqe30作為模板，采用天恩澤的易錯pcr試劑盒進行擴增。帶有突變堿基的pcr產物經bamhi/hindiii雙酶切后連于經同樣酶切過的線性載體pqe30，轉化大腸桿菌m15。

1.2.2突變子篩選

從平板上挑取單克隆(8000個轉化子)，接種于24孔培養(yǎng)板中，30℃培養(yǎng)36h。離心收集菌體。培養(yǎng)基采用自誘導培養(yǎng)基。將上述離心后的菌體用1ml生理鹽水清洗一遍，離心。菌體用1ml100mm磷酸鈉緩沖液(ph8.0)懸浮，30℃溫育10min后加入20μl1m的鄰氯扁桃腈起始反應。反應12h后加入100μl2mhcl終止反應。取200μl上清液13,000g離心10min后用測氨法檢測酶活，有活性的反應液通過hplc檢測ee值。

1.3結果與分析

通過優(yōu)化易錯反應pcr條件，突變頻率控制在3-7堿基/kb，轉化效率為1000克隆/10μl連接液，有效克隆率達到70％以上。

通過14輪共8000個突變子的篩選，我們得到了4個有益突變株，ee值均在95％以上。通過測序發(fā)現(xiàn)，四個突變體最少含有一個突變子。其中突變體18和1332，其49位的蘇氨酸都發(fā)生了突變。在突變體18中，49位的蘇氨酸突變成了絲氨酸。在突變體1332中，49位的蘇氨酸突變成異亮氨酸。在突變體338和1332中，113位的異亮氨酸都突變成了天冬酰胺。雖然ee值都提高了，但四個突變體在水解鄰氯扁桃腈時都表現(xiàn)出了活力的下降。

表1隨機突變產生的腈水解酶bcj2315突變體及單點突變體酶活及對映體選擇性比較

為了驗證四個突變體中的有益突變子，通過單點突變，我們得到了四個突變體中的所有突變子并對酶進行了純化。所有突變子的水解活力及ee值如表6.4所示。在突變體18中，只有一個突變位點，該突變位點突變后相對酶活為87％，ee值提高到95.9％。突變體338中，a91s為無義突變，i113n提高了產物的ee值，但活力都有所下降。在突變體101中，m98k和r345c為無義突變。y199c和t310p表現(xiàn)出了ee值的提高。其中t310p的相對活力為33％，y199c的活力則提高到了201％。在突變體1332中，y85f為無義突變。t49i和i113n均表現(xiàn)出了ee值的提高和活力的下降。

腈水解酶bcj2315的催化三聯(lián)體為e48-k130-c164，在我們所得到的有益突變體中，離催化三聯(lián)體最近的位點是第49位的t。而另外一個對對映體選擇性有影響的位點是t310，該位點在氨基酸序列上遠離腈水解酶的催化活性中心。因此，靠近和遠離腈水解酶催化中心的氨基酸突變都能影響到酶的對映體選擇性。研究者往往傾向通過對催化中心附近的位點進行點突變來達到改善酶某個性質的目的，因為對靠近催化中心的位點進行突變比對遠離催化中心的位點進行突變具有更高的效率。我們更傾向于通過隨機突變來達到提高bcj2315選擇性的目的。因為靠近催化中心的位點畢竟是有限的，而隨機突變作用于整個基因序列，能夠產生更多的遠離催化活性中心的有益突變。

通過定點突變，共有4個位點在提高bcj2315對映體選擇性方面做出了有益的貢獻。其中i113n表現(xiàn)出了最高的ee值，t49i的ee值提高的最低，為95.7％。在所有突變子當中，y199c表現(xiàn)出了最高的相對酶活。但y199c的ee值只有94.3％。綜合考慮活力及對映體選擇性，為了得到一個更好的突變子，我們將該4個位點進行了飽和突變，利用全細胞催化測定所有的突變子在酶活和ee值方面的表現(xiàn)。

表2腈水解酶bcj2315單點飽和突變體酶活及對映體選擇性比較

在篩選有益突變體的過程中，活力及ee值都是我們考慮的因素。ee值大于95％而活力沒有下降的突變體將會被優(yōu)先挑選出來。在t49所有突變體中，只有t49n表現(xiàn)出了活力的微弱提高，但其ee值相比野生型bcj2315下降了很多，只有76.1％。高于95％的突變體有8個(t49a，t49e，t49f，t49g，t49i，t49m，t49s，t49y)，但這8個突變體的相對活力都下降了，最高的只有野生型bcj2315的87％(t49s)。t310所有突變體中，ee值高于95％的只有t310p，t310p表現(xiàn)出了很好的對映體選擇性，ee值為98.1％。但相對活力卻只有野生型的32％。在t49和t310位點的飽和突變中我們沒有發(fā)現(xiàn)有益突變。絕大多數(shù)i113突變體都表現(xiàn)出了優(yōu)秀的對映體選擇性，其中7個突變體的ee值都大于99.9％。遺憾的是大部分突變體都表現(xiàn)出了相對酶活的降低，這7個突變的相對活力只有野生型的1％-6％，表現(xiàn)出了極低的相對酶活。兩個i113突變體表現(xiàn)出了相對較高的酶活力，i113m和i113l。相對酶活分別為138％和188％。且i113m的對映體選擇性很好，產物ee值為97.2％。因此i113m突變體被選定用于進一步研究。與i113突變體不同的是，y199所有突變體絕大多數(shù)都表現(xiàn)出了相對酶活的提高，但對映體選擇性卻提高的不大。ee值高于95％只有3個，y199a，y199e和y199g，ee值分別為95.6％，95.1％和96.7％。因此這幾個突變體也被挑選出來做進一步的研究。

考慮到突變體的ee值及相對酶活力，共四個有益突變體被挑選出來。它們是i113m，y199a，y199e和y199g。四個突變體都表現(xiàn)出了活力和ee值的提高，產物ee值最高為97.6％。在4個位點的飽和突變體中，我們觀察到y(tǒng)199絕大部分都表現(xiàn)出了相對酶活力的提高和ee值的提高，而在另外三個位點的飽和突變中，只有i113m被挑選出來，表現(xiàn)出了ee值和相對酶活的雙重提高。位點的聯(lián)合突變通常會引起有益結果的疊加效應。因此我們選取i113m突變體作為模板，通過對i113m突變體的199位進行飽和突變，考察一下兩個位點的聯(lián)合突變是否會進一步提高酶的相對酶活和對映體選擇性。結果如表6.6所示。通過兩點的聯(lián)合突變，我們得到了很多有益的突變。所有的突變體ee值都高于97％，最高的ee值為98.7％，由突變體i113m/y199g產生。突變體中最高的相對酶活力也由突變體i113m/y199g產生，為野生型的3.76倍，因此i113m/y199g被選作進一步的研究。

目前已有很多研究報道了在基因水平上改造腈水解酶，通過蛋白質工程改變腈水解酶的底物特異性、對映體選擇性、ph耐受性、底物耐受性及提高酶的活力等。kiziak發(fā)現(xiàn)去除pseudomonasfluorescensebc191腈水解酶c末端47-67個氨基酸導致酶活降低，酰胺產物的增多和對映體選擇性的改變。kiziak鑒定了一個保守的氨基酸位點h296，該位點與pseudomonasfluorescensebc191腈水解酶對映體選擇性和酰胺的形成有關。desantis對通過宏基因組方法得到的一個腈水解酶進行全基因飽和突變，得到的突變體可以耐受高濃度的3-羥基戊二腈(3m)且對映體選擇性提高到了98.1％。來源于敏捷食酸菌的脂肪族腈水解酶，一個單一的突變(t210a)使其對3-羥基戊腈的活性提高了7.3倍。兩個點的聯(lián)合突變(f168v+l201n)使其對羥基乙腈的活性提高了15.3倍，且突變體酶活，體積產率，產物收率都滿足工業(yè)上的需求。來源于紫紅紅球菌的腈水解酶，y142殘基被證明對底物特異性起作用。來源于neurosporacrassaor74a的腈水解酶，w168a突變體導致其在水解扁桃腈和2-苯基丙腈時產生更多的酰胺。且對2-苯基丙腈的對映體選擇性完全反轉(由r型反轉為s型)。迄今為止，通過基因工程改造腈水解酶使之能夠高度對映體選擇性水解外消旋鄰氯扁桃腈生成(r)-(-)-鄰氯扁桃酸尚未見報道。schreiner通過定向進化技術得到了來源于alcaligenesfaecalis的腈水解酶nitaf的突變體phnit45，該突變體在ph4.5時具有較高的穩(wěn)定性。phnit45在ph4.5的反應條件下可以水解r型的鄰氯扁桃腈生成(r)-(-)-鄰氯扁桃酸，產物ee值大于99％。但在ph7.0時，nitaf和phnit45的選擇性都很差，分別為76％和19％。在我們的研究中，通過對腈水解酶bcj2315的定向進化，得到的有益突變體在活力和ee方面都有了很大的提高，可以在中性及偏堿性反應條件下水解外消旋鄰氯扁桃腈生成(r)-(-)-鄰氯扁桃酸，理論產率為100％，ee值為98.7％。

表3腈水解酶bcj2315突變體i113m199位單點飽和突變體酶活及對映體選擇性比較

在i113m/y199g突變體基礎上，針對催化活性位點的氨基酸繼續(xù)進行迭代飽和突變，在篩選有益突變體的過程中，篩選到一株有益突變株，經過測序發(fā)現(xiàn)g59a突變體在i113m/y199g突變體基礎上，酶活有了進一步提高，因此在后續(xù)r-鄰氯扁桃酸制備工藝中，采用g59a/i113m/y199g(mga)突變體作為生物催化劑。

2腈水解酶催化合成r-鄰氯扁桃酸工藝研究

2.1.1搖瓶培養(yǎng)

如無特殊說明，以下培養(yǎng)過程中，lb培養(yǎng)基中均需添加kan0.05mm，amp0.1mm。

(1)取保藏于-80℃下的e.coli工程菌菌種，接種于lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。

(2)過夜菌0.5％(v/v)接種于400mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600＝0.6。

(3)培養(yǎng)物中加入iptg至終濃度0.1mm，30℃培養(yǎng)16h后收集菌體。

2.1.2催化劑制備

(1)搖瓶培養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)物于4℃下8000rpm離心5min。收集菌體。

(2)菌體重懸于100mmph8.0的na2hpo4/nah2po4緩沖液中，4℃8000rpm離心5min，收集菌體。

(3)重復步驟(2)一次。

(4)緩沖液洗滌后的菌體于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3e.coli/mga工程菌發(fā)酵

對于工業(yè)級制備r-鄰氯扁桃酸，需要大批量的工程菌作為催化劑，因此有必要建立一條廉價穩(wěn)定的e.coli/mga工程菌發(fā)酵工藝。高密度發(fā)酵是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細胞量，由此更多地或更高效地獲得目的產物。實現(xiàn)高密度發(fā)酵不僅可以減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產周期，減少設備投資，從而降低生產成本。

利用一般的發(fā)酵工藝生產大腸桿菌或以其構建的基因工程菌的表達產物，大腸桿菌的生物量，蛋白表達量，代謝產物在菌體內的發(fā)酵液中的濃度都比較低，難以獲得理想的生產效率。重組大腸桿菌進行高密度發(fā)酵可獲得較高的生物量，但對發(fā)酵條件有非常高的要求。影響高密度發(fā)酵的因素非常多，如細胞生長所需要的營養(yǎng)物質、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累，溶氧濃度，誘導方式，發(fā)酵液的ph值，補料方式及發(fā)酵液流變學特性等。

2.1.3.1

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基按組成成分可分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、復合培養(yǎng)基。其組成元素包括：c、h、o、n、s、p、fe、mg、k等。大腸桿菌高密度發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基一般為半合成培養(yǎng)基，它是在合成培養(yǎng)基的基礎上添加能促進細胞生長及代謝產物形成的不同物質，如適量無機鹽，氨基酸，維生素等。常用的碳源有糖類，油脂，有機酸和低碳醇。葡萄糖是碳源中最易利用的糖，常被用作培養(yǎng)基的主要成分。常用的氮源可分為有機氮源和無機氮源。培養(yǎng)基各組分的濃度和比例要適當，尤其是碳源與氮源的比例。如果碳源與氮源濃度過高，蘇安然比例合適，發(fā)酵起始會導致菌體的大量繁殖，但發(fā)酵后期菌體生長緩慢，代謝廢物過多，增大發(fā)酵粘度，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異常。因此設計一種平衡的培養(yǎng)基有利于產物的表達。

在培養(yǎng)基組分的設計過程中，我們采用蛋白胨與酵母膏作為基礎碳氮源，因為兩者不僅可以提供工程菌生長過程中所需的碳氮源，而且提供微量元素與生長因子等微量物質。在此基礎上，添加少量甘油作為速效碳源有利于發(fā)酵初期菌體的生長。磷酸鉀鹽的添加有利維持發(fā)酵液的ph平衡。mg²⁺的額外添加有利于提高酶的活力。

表4發(fā)酵基礎培養(yǎng)基組分

表5發(fā)酵補料培養(yǎng)基組分

2.1.3.2ph值

穩(wěn)定的ph值是使菌體保持最佳生長狀態(tài)的必要條件。由于外界的ph值變化會通過弱酸或弱堿的變化而改變菌體細胞內的ph值，從而影響細胞的代謝反應。因此在發(fā)酵過程中ph值的改變會影響細胞的生物量和基因產物的表達。另一方面，微生物的生長可引起培養(yǎng)液ph值的變化。在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，通常ph值會發(fā)生較大的變化。銨鹽中氨的消耗，或者微生物利用碳源產生的代謝產物即有機酸的積累，都會造成ph值的下降，而有機酸的消耗則會造成ph值的上升。在復合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當消耗碳源時，培養(yǎng)基中的氨基酸被用于異化代謝時，因氨的釋放，會造成ph值升高。發(fā)酵過程中跟蹤ph值的變化，可以為了解微生物代謝的變化提供十分重要的信息。在發(fā)酵工藝控制中，必須及時使用低濃度的堿或氨水調節(jié)ph值使之處于適宜的ph范圍內，避免ph值劇烈變化對細胞生長和代謝造成的不利影響。

在e.coli/mga工程菌的發(fā)酵過程中，我們控制ph在7.2左右，在該ph條件下有利于工程菌的生長和mga腈水解酶的積累。由于大腸桿菌產酸的積累，會造成發(fā)酵液ph值的降低，ph值的維持最重要的手段是堿性物質的添加。在本發(fā)酵中，氨水與naoh溶液均在ph調控手段的考慮范圍之內。naoh溶液用于調控ph優(yōu)勢在于滅菌簡便，不揮發(fā)，且可配制成高濃度溶液，其缺點在于由于naoh為強堿性物質，在滴入過程中會造成局部發(fā)酵液瞬間產生強堿性環(huán)境，對菌體造成破壞。氨水用于調控ph的優(yōu)勢在于氨水相對堿性較弱，調節(jié)相對較溫和，但是氨水滅菌相對麻煩，需過濾滅菌，且由于氨水極易揮發(fā)，對操作人員危害較大。

2.1.3.3溶解氧

溶解氧濃度是好氧微生物高密度發(fā)酵過程中影響菌體生長的重要因素之一，而且它往往會成為發(fā)酵的控制因素。這主要是由于氧在水中溶解度很小所致。在細胞的對數(shù)生長期若停止供氧，則發(fā)酵液中的溶解氧會在幾分鐘內耗盡。在發(fā)酵后期，反應器中生物量很大，而且發(fā)酵液粘度增大，此時受反應器供氧能力的限制，發(fā)酵液中的溶解氧濃度會低于臨界氧濃度。這樣，氧的溶解和傳遞便成了該細胞反應的限制步驟。

發(fā)酵開始階段，控制溶氧在20％以上。溶氧的控制主要通過逐步提高攪拌速度以及改變通氣量的方式控制。初期攪拌速度設定為300rpm，攪拌轉速的最終速度為700rpm。

2.1.3.4溫度與誘導條件

培養(yǎng)溫度是影響菌體生長和調控細胞代謝的重要因素。在發(fā)酵初期，溫度設定為37℃，有利于細胞的快速生長與繁殖。當進入對數(shù)生長期后，通過iptg進行誘導以調節(jié)工程菌的基因表達水平。此時以獲得較大量的目標蛋白即mga腈水解酶為主要目標。由于在較高溫度下工程菌內mga的表達容易形成較多無活性的包涵體形式，因此在誘導開始后，需適當降低工程菌的代謝水平，此時將溫度降低至30℃進行發(fā)酵。在較低的溫度下有利于mga的可溶性表達，降低包涵體的形成。

2.1.3.5發(fā)酵結果

綜合上述條件，對工程菌e.coli/mga進程了發(fā)酵，在發(fā)酵過程中不同時間點進行取樣分析，檢測發(fā)酵過程中od600，dcw以及酶產量的增長情況。具體結果見圖1，圖2，圖3結果所示。

由上述三圖可以看到，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基配方的設計，以及在發(fā)酵過程中ph，溫度以及溶氧的調控。以酶產量為主要目標同時兼顧菌體濃度的條件下，工程菌的發(fā)酵濃度達到了od600在75左右，dcw在35g/l左右，酶產量達到35000ku/l。酶產量在腈水解酶發(fā)酵領域處于領先水平。

2.2催化反應

腈水解酶催化水解鄰氯扁桃腈制備r-鄰氯扁桃酸的反應采用連續(xù)流加補料的反應模式，通過維持底物濃度在較低的水平以減緩酶失活的速率，通過連續(xù)流加補料，以達到r-鄰氯扁桃酸的高濃度積累。

2.2.1轉化液制備

腈水解酶催化水解鄰氯扁桃腈制備r-鄰氯扁桃酸的轉化反應于100mmph8.0的na2hpo4/nah2po4緩沖液中進行。

其中，緩沖液中添加乙醇10％(v/v)作為助溶劑。

20mg/ml終濃度的靜息細胞。

配制后的轉化液保溫至30℃用于后續(xù)反應。

2.2.2流加底物的制備

用于流加反應的鄰氯扁桃腈溶于乙醇中配置成終濃度為6m的流加液，流加液于30℃條件下保溫。

2.2.3連續(xù)補料流加反應

高濃度的鄰氯扁桃腈對腈水解酶mga的抑制作用非常明顯，更容易造成酶的失活。為了得到高濃度的產物(r)-(-)-鄰氯扁桃酸，我們通過采用連續(xù)流加底物模式來調整反應中的底物濃度，使反應始終保持在一個較高的速率下進行，以達到高濃度(r)-(-)-鄰氯扁桃酸的累積生產。在流加底物的過程中，將底物溶解在有機溶劑中，可以同時提高反應體系的有機助溶劑，以同時達到提高產物對映體選擇性的目的。向反應體系中加入有機溶劑還可以提高反應的速率，減少反應時間。我們選定乙醇作為助溶劑。底物鄰氯扁桃腈溶于乙醇形成高濃度的母液(6m)，在流加底物的同時不斷提高反應體系中乙醇的含量，使反應的活力和ee值都處于一個增長的過程彌補反應過程中部分酶的失活。起始反應乙醇的添加量為20％，在此濃度下，生成產物的ee值為95.9％。通過tlc監(jiān)測反應過程，調整底物補料速度。

300ml的反應于500ml的三口圓底燒瓶中進行，水浴保溫30℃，雙槳葉攪拌槳機械攪拌轉速350rpm。14#軟管流加底物，流加速度60mm/h，其中軟管與流加液需30℃保溫。

ph電極監(jiān)控反應ph的變化，6m氨水維持ph在7.95-8.10之間，其中ph的調節(jié)與監(jiān)控電極聯(lián)動。

2.2.4檢測方法

反應進程的監(jiān)控采用tlc在線監(jiān)控，hplc定量檢測的方法。檢測方法具體細節(jié)見分析方法一節(jié)。

2.2.5反應結果

底物以60mm/h的流加速度連續(xù)流加10h后停止流加，繼續(xù)延伸反應2h后結束反應。反應進程結果見圖4。

在12h反應時間里，共600mm的底物被完全水解，由于底物流加和ph調控的稀釋作用，累計產生了112g/l的產物鄰氯扁桃酸。整個反應過程中反應轉化率保持在90％以上。反應10h后停止流加，繼續(xù)反應2h后底物全部轉化完。

目前，關于利用腈水解酶大規(guī)模生產鄰氯扁桃酸的文獻報道并不多。張陳勝利用含有來源于labrenziaaggregata的重組腈水解酶細胞通過水/甲苯兩相體系在8h內將300mm的鄰氯扁桃腈完全水解，產率為94.5％，產物ee值為96.5％。含有腈水解酶的節(jié)桿菌(arthrobactersp.)f-73通過水/乙酸乙酯兩相體系，通過分批添加鄰氯扁桃腈(終濃度100mm)，9h內共轉化400mm的鄰氯扁桃腈，產率為92％，產物ee值為98.5％。產物經回收并重結晶后ee值可提高到99.3％。

2.3產物分離純化

r-鄰氯扁桃酸的純化采用結晶法進行。經過離心處理后的反應液，通過濃hcl進行酸化至ph1，通過旋轉蒸發(fā)濃縮至1/3體積，在10℃條件下冷卻結晶，收集晶體，重復濃縮結晶過程2次后，將收集到的晶體溶于乙醇中進行重結晶。重結晶晶體烘干后裝袋。

2.4產品檢測

純化后的r-鄰氯扁桃酸檢測結果如下：

1hnmr(400mhz,d2o)δ/ppm:5.530(s,1h),7.262–7.300(m,2h),7.322–7.356(m,1h),7.382–7.415(m,1h).

[α]d²⁵＝-153(c＝0.5,ethanol)

ee>98％

經檢測，產品符合企業(yè)標準。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。

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<110>棗莊市杰諾生物酶有限公司

<120>一種腈水解酶及其應用

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