(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種來(lái)源于敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044腈水解酶的突變體及其在抗癲癇藥物中間體1-氰基環(huán)己基乙酸合成中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

加巴噴丁是美國(guó)warner-lambert公司首先開(kāi)發(fā)的抗癲癇藥，與目前使用的同類產(chǎn)品相比，具有口服吸收快，耐受性好，毒副作用小，治療效果好，在體內(nèi)不代謝，不與血漿蛋白結(jié)合，不誘導(dǎo)肝酶，能夠穿過(guò)人體大腦的血腦屏障，與其他抗癲癇病藥物相互作用的可能性很低，作為難治性癲癇病的疊加用藥作用尤為突出。

1-氰基環(huán)己基乙酸(1-cyanocyclohexaneaceticacid)是合成新一代抗癲癇藥物加巴噴丁(gabapentin)的關(guān)鍵中間體，市場(chǎng)前景非常廣闊。目前，用于合成加巴噴丁包括其關(guān)鍵中間體1-氰基環(huán)己基乙酸全部采用化學(xué)合成技術(shù)，生產(chǎn)過(guò)程中存在三廢排放量大，環(huán)境污染嚴(yán)重，三廢處理成本高等問(wèn)題。

腈水解酶(nitrilaseec3.5.5.1)是一種能將腈類物質(zhì)(含有-cn)水解為相應(yīng)羧酸的酶。腈水解酶催化反應(yīng)具有高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、成本低等特點(diǎn)，是一種環(huán)境友好的綠色合成方法，符合原子經(jīng)濟(jì)的要求，對(duì)節(jié)能減排及建設(shè)和諧社會(huì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。由于腈水解酶的這些優(yōu)異的特性，使其成為工業(yè)上極具發(fā)展?jié)摿Φ拇呋瘎?。目前工業(yè)化應(yīng)用中比較成功的腈水解酶的例子很多，德國(guó)basf公司的產(chǎn)品(r)-扁桃酸，首先由苯甲醛和氫氰酸反應(yīng)生成消旋扁桃腈，再選擇合適的反應(yīng)條件，通過(guò)腈水解酶催化的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分，可以定量地轉(zhuǎn)化為(r)-扁桃酸。杜邦公司開(kāi)發(fā)了一套工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程，將2-甲基戊二腈(mgn，己二腈制造尼龍-66過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化為1,5-二甲基-2-哌啶酮(1,5-dmpd)。1,5-二甲基-2-哌啶酮在電子學(xué)、涂層及溶劑應(yīng)用中具有令人滿意的特性。mgn首先用固定化的含腈水解酶的微生物細(xì)胞催化劑(acidovoraxfacilis72w)水解為4-氰基戊酸(4-cpa)銨鹽，水解反應(yīng)的選擇性大于98％，轉(zhuǎn)化率為100％，能得到二分之一氰基羧酸銨鹽，產(chǎn)生1～2％的唯一反應(yīng)副產(chǎn)物2-甲基戊二酸二銨鹽。與一個(gè)由mgn加氫直接轉(zhuǎn)化為1,3-dpmd和1,5-dmpd混合物的化學(xué)工藝相比，化學(xué)-酶法生產(chǎn)工藝產(chǎn)量高、產(chǎn)生的浪費(fèi)較少，并生成單一的內(nèi)酰胺異構(gòu)體。此外，許多腈水解酶已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并用于多種藥物中間體和精細(xì)化學(xué)品的合成。

但是，天然的腈水解酶熱穩(wěn)定性普遍較差，這阻礙了其工業(yè)應(yīng)用。提高酶的熱穩(wěn)定性，可通過(guò)對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾或分子改造而實(shí)現(xiàn)。由于腈水解酶的晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道較少，對(duì)于腈水解酶穩(wěn)定性的改造也罕有報(bào)道。crum和benedik等人多年來(lái)研究來(lái)源于短小芽胞桿菌(bacilluspumilus)的cyanidedihydratase(cyndpum)的溫度穩(wěn)定性。研究者首先利用易錯(cuò)pcr，篩選出了多個(gè)正向突變株(k93r,d172n和e327k)，隨后將施氏假單胞菌(pseudomonasstutzeri)cyanidedihydratase(cyndstu)的c端與cyndpum融合，提高了其溫度穩(wěn)定性(參考文獻(xiàn))。

從敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044克隆的腈水解酶已經(jīng)在大腸桿菌(escherichiacoli)bl21(de3)中過(guò)量表達(dá)，通過(guò)分子改造，對(duì)底物1-氰基環(huán)己基乙腈表現(xiàn)出了較高的催化活力，能夠催化1-氰基環(huán)己基乙腈生產(chǎn)加巴噴丁的中間體1-氰基環(huán)己基乙酸(catalysiscommunications,2015，66,121-125)。但是，由于現(xiàn)有的生物催化劑還存在溫度穩(wěn)定性較差，高溫下催化反應(yīng)效率較低，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題，而底物1-氰基環(huán)己基乙腈的溶解度就受到溫度的顯著影響，在溫度較高的條件下反應(yīng)能增加底物溶解度，促進(jìn)反應(yīng)效率，但是現(xiàn)有的腈水解酶還不能滿足這一要求。因此，通過(guò)分子改造的方法提高腈水解酶的溫度穩(wěn)定性，提高反應(yīng)效率，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本具良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要針對(duì)來(lái)源于敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)cctccno:m209044腈水解酶溫度穩(wěn)定性較差的問(wèn)題，提供了多個(gè)腈水解酶突變體蛋白及在1-氰基環(huán)己基乙酸合成中的應(yīng)用，包括含有該基因的重組載體，以及重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種腈水解酶突變體，所述突變體是將seqidno.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位進(jìn)行突變獲得的。

本發(fā)明利用易錯(cuò)pcr技術(shù)對(duì)來(lái)源于敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶編碼基因(genbankaccessionno.:ahw42593.1)進(jìn)行隨機(jī)突變，首先利用t7引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，進(jìn)行隨機(jī)突變，得到腈水解酶突變體核苷酸序列，連接至表達(dá)載體pet-28b(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主，誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)大規(guī)模、高通量的篩選方法檢出正突變子，然后結(jié)合定點(diǎn)突變的方法，得到溫度穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的突變體，從而獲得能夠高效催化雙腈化合物區(qū)域選擇性水解合成單氰基羧酸化合物的突變體蛋白。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述突變體為下列之一：(1)將seqidno.2所示氨基酸序列的第201位蘇氨酸突變?yōu)楸奖彼?t201f)、異亮氨酸(t201i)、亮氨酸(t201l)或色氨酸(t201w)；(2)將seqidno.2所示氨基酸序列第339位谷氨酰胺突變?yōu)橘嚢彼?q339k)；(3)將seqidno.2所示氨基酸序列第343位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?q343k)；(4)將seqidno.2所示氨基酸序列第201位的蘇氨酸突變?yōu)楸奖彼?，同時(shí)將第339位和第343位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷＞唧w方法如下：構(gòu)建含敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶acn-f168v(即seqidno:2，由369個(gè)氨基酸殘基組成，其核苷酸序列seqidno:1所示)的質(zhì)粒pet-28b(+)-acn-f168v。將構(gòu)建獲得的pet-28b(+)-acn-f168v表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌e.colibl21(de3)中實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。采用易錯(cuò)pcr方法進(jìn)行隨機(jī)突變，并重組至表達(dá)載體pet-28b(+)，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主e.colibl21(de3)中，構(gòu)建突變文庫(kù)。挑選突變文庫(kù)中的單菌落至96孔板中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，將培養(yǎng)的濕菌體溶于ph7.0的磷酸鹽緩沖液中，取1/2菌液，利用苯酚-次氯酸鈉法檢測(cè)活力，其余菌液在45℃恒溫水浴鍋中保存24h后，采用相同的方法檢測(cè)活力。將溫度穩(wěn)定性提高的菌株進(jìn)行測(cè)序分析，獲得突變體序列信息。將溫度穩(wěn)定性提高的突變體蛋白進(jìn)一步進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)液相色譜測(cè)定水解雙腈化合物酶活，將篩選得到的高穩(wěn)定性突變體菌株進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)對(duì)上述構(gòu)建的突變文庫(kù)篩選以及理性設(shè)計(jì)方法，獲得了活力提高的突變體為：acn-t201l(核苷酸序列seqidno.3)、acn-t201f(核苷酸序列seqidno.7)、acn-t201i(核苷酸序列seqidno.6)、acn-t201w(核苷酸序列seqidno.8)、acn-q339k(核苷酸序列seqidno.4)，acn-q343k(核苷酸序列seqidno.5)及acn-t201f/q339k/q343k(核苷酸序列seqidno.9)。

本發(fā)明還涉及一種所述腈水解酶突變體的編碼基因、由所述編碼基因構(gòu)建的重組載體以及由所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的重組基因工程菌。所述的宿主細(xì)胞可以是本領(lǐng)域的各種常規(guī)宿主細(xì)胞，本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌e.colibl21(de3)。

本發(fā)明還提供一種所述腈水解酶突變體在催化雙腈化合物制備單氰基羧酸化合物中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用以含腈水解酶突變體編碼基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體、濕菌體固定化細(xì)胞或者濕菌體超聲破碎后提取的純酶為催化劑，以雙腈化合物為底物，以ph＝7.0、200m磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，45℃恒溫水浴反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得單氰基羧酸化合物；所述雙腈化合物為1-氰基環(huán)己基乙酸、丙二腈或丁二腈。所述底物終濃度以緩沖液體積計(jì)為100～1000mm，優(yōu)選1000mm，所述催化劑用量以濕菌體重量計(jì)為10～100g/l緩沖液，優(yōu)選50g/l。

進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法之一制備：(1)將含腈水解酶突變體編碼基因工程菌接種到lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，按體積濃度2％的接種量接種至含終濃度50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)液的od600為0.6-0.8之間，加入終濃度為0.1mm異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)，離心，收集菌體，用生理鹽水清洗2次，得到濕菌體；(2)將步驟(1)濕菌體用含終濃度300mmnacl的ph8.0、50mmnah2po4緩沖液重懸，超聲波破碎(400w,15min,1s破碎1s暫停)，破碎產(chǎn)物離心(12000×g,20min)后取上清液作為粗酶液；將粗酶液以1ml/min的流速通過(guò)經(jīng)平衡緩沖液沖洗的ni-nta柱，用洗脫緩沖液洗脫弱吸附的雜蛋白，流速為2ml/min；再用蛋白洗脫緩沖液洗脫并收集目的蛋白，流速為2ml/min；最后將收集的目的蛋白以質(zhì)量濃度0.9％氯化鈉水溶液為透析液進(jìn)行透析，取截留液即為純酶；所述平衡緩沖液為含終濃度300mmnacl的ph8.0、50mmnah2po4緩沖液；所述洗脫緩沖液為含終濃度300mmnacl和50mm咪唑的ph8.0、50mmnah2po4緩沖液；所述蛋白洗脫緩沖液為含終濃度300mmnacl和250mm咪唑的ph8.0、50mmnah2po4緩沖液；(3)將步驟(1)濕菌體懸浮于ph＝7.0、200mm磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中，加入6mg/ml硅藻土，室溫?cái)嚢?h，隨后加入體積終濃度3％聚乙烯亞胺，室溫?cái)嚢?h，最后加入體積終濃度1％戊二醛，攪拌1h，真空抽濾，獲得固定化細(xì)胞；所述聚乙烯亞胺以質(zhì)量濃度5％水溶液形式加入，所述戊二醛以質(zhì)量濃度25％水溶液形式加入。

本發(fā)明所述的腈水解酶突變體可以是含有該腈水解酶突變體基因的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體(即濕菌體，優(yōu)選為大腸桿菌e.colibl21(de3))，也可以是未純化的粗酶液，或是經(jīng)過(guò)純化后的純酶，如果需要可以對(duì)其進(jìn)行固定化后進(jìn)行使用。

luria-bertani(lb)液體培養(yǎng)基終濃度組成：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，溶劑為水，ph值自然。

lb固體培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，瓊脂1.5％，溶劑為水，ph值自然。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)分子改造，腈水解酶acn純酶的熱穩(wěn)定性最高提高了14倍，且利用含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌在高溫下(45℃)水解1-氰基環(huán)己基乙腈，反應(yīng)時(shí)間縮短為原來(lái)的三分之一。因此，本發(fā)明所獲得的突變體在高效催化1-氰基環(huán)己基乙腈合成加巴噴丁中間體1-氰基環(huán)己基乙酸中具有良好的應(yīng)用前景。另外，發(fā)現(xiàn)突變株在45℃條件下催化丙二腈或丁二腈生產(chǎn)相應(yīng)的氰基羧酸活性也大幅度提高，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

(四)附圖說(shuō)明

圖1腈水解酶突變體蛋白純化后的電泳圖。泳道1為acn-t201w，泳道2為acn-t201f，泳道3為acn-f168v，泳道4為acn-t201l，泳道5為acn-q343k，泳道6為acn-q339k，泳道7為acn-t201i。

圖2腈水解酶突變體的活力比較。

圖3腈水解酶突變體在45℃下的熱穩(wěn)定性。

圖4含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞45℃下溫度穩(wěn)定性。

圖5含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化750mm1-氰基環(huán)己基乙腈時(shí)間比較曲線圖。

圖6為1-氰基環(huán)己基乙酸高效液相色譜圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：構(gòu)建腈水解酶突變文庫(kù)

以含有克隆來(lái)源于敏捷食酸菌(a.facilis)cctccno:m209044腈水解酶基因acn-f168v(核苷酸序列seqidno.1、氨基酸序列seqidno.2)的pet-28b(+)-acn-f168v質(zhì)粒為模版，利用t7promoter和t7terminator為引物(表1)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，隨機(jī)引入突變。pcr反應(yīng)體系(50μl)：模版0.5～20ng，1×taqbuffer(不含mg²⁺)，0.2mmdntp，0.3mmmncl2，2mmmgcl2，引物t7promoter與t7terminator各0.2μm，taqdna聚合酶5u。pcr條件(1)95℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性50s；(3)55℃退火60s；(4)72℃延伸120s，步驟(2)～(4)共30個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析后切膠回收。

隨后以上述膠回收產(chǎn)物為引物，擴(kuò)增得到完整的質(zhì)粒。pcr體系(50μl)為5×primestarbuffer(mg²⁺plus)，0.2mmdntp，2.5uprimestarhsdnapolymerase，膠回收產(chǎn)物50ng，pet-28b(+)-acn-f168v質(zhì)粒20ng。pcr條件：(1)72℃保溫5min；(2)98℃預(yù)變性3min；(3)98℃變性10s；(4)68℃退火5s；(5)72℃延伸6min，步驟(3)～(5)共35個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。

擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶dpni37℃消化3h后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入e.colibl21(de3)，涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

通過(guò)該易錯(cuò)pcr方法，每輪可以產(chǎn)生大概150-200個(gè)單菌落，總共產(chǎn)生了300,000-600,000個(gè)單菌落，并且經(jīng)過(guò)測(cè)序，其突變頻率(1-2bp/1000bp)符合預(yù)期。

表1引物設(shè)計(jì)表

實(shí)施例2：突變體的高通量篩選

挑取實(shí)施例1中的單菌落至96深孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔板加入1000μllb液體培養(yǎng)基(含有終濃度50μg/ml卡那霉素，終濃度1mmiptg)，37℃培養(yǎng)18h。將96深孔板的菌體離心30min(3000rpm，4℃)，棄上清后，用1.5ml磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(200mm，ph7.0)重懸菌體。取出500μl菌懸液于新的96深孔板中，各孔中加入底物1-氰基環(huán)己基乙腈(終濃度100mm)，35℃反應(yīng)1h。取出500μl菌懸液于新的96深孔板中，各孔中加入底物1-氰基環(huán)己基乙酸(終濃度100mm)，35℃反應(yīng)12h。其余菌液放置于45℃恒溫水浴搖床中，保溫1天后，加入底物1-氰基環(huán)己基乙腈(終濃度100mm)，35℃反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，將96深孔板的反應(yīng)液離心30min(3000rpm，4℃)，取出上清液(即為待測(cè)反應(yīng)液)，采取苯酚-次氯酸鈉法進(jìn)行顯色反應(yīng)。

用移液管取2ml的a溶液(10g/l苯酚，50mg/l亞硝基鐵氰化鈉，溶劑為水)置于10ml的離心管中，加入4μl待測(cè)反應(yīng)液，混合均勻之后再用移液管加入2ml的b溶液(5g/l氫氧化鈉，8.8ml/l含5.2％有效氯的次氯酸鈉溶液，溶劑為水)混合均勻。放入37℃中水浴加熱5min，至離心管內(nèi)顏色不再發(fā)生變化后，取200μl置于96孔板中，630nm處測(cè)量吸光度。配置100mm氯化銨水溶液，梯度稀釋后，使用上述方法測(cè)定吸光度，以氯化銨濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.014x-0.01，x為氯化銨濃度，y為吸光值。之后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得到待測(cè)反應(yīng)液中銨根的濃度，銨根濃度等于轉(zhuǎn)化后得到的1-氰基環(huán)己基乙酸的濃度。

根據(jù)以下3個(gè)原則篩選突變體：1)突變體相較于出發(fā)菌株，活力沒(méi)有明顯的降低；2)突變體的區(qū)域選擇性沒(méi)有下降，即對(duì)于1-氰基環(huán)己基乙酸沒(méi)有水解活力；3)45℃保溫前后，突變體水解1-氰基環(huán)己基乙腈的活力下降速度相較于出發(fā)菌株慢。利用液相色譜復(fù)篩驗(yàn)證后，送至杭州擎科生物公司測(cè)序分析。確定熱穩(wěn)定性提高的突變體為t201l、q339k、q343k，其核苷酸序列分別為seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5。

實(shí)施例3：定點(diǎn)突變及篩選

以表達(dá)質(zhì)粒pet-28b(+)-acn-f168v為模版，通過(guò)全質(zhì)粒擴(kuò)增進(jìn)行定點(diǎn)突變。pcr體系(50μl)為：模版0.5～20ng，引物t201-f及t201-r(序列見(jiàn)表1)各10-15pmol，5×primestarbuffer(mg²⁺plus)，0.2mmdntp，1.25uprimestarhsdnapolymerase。pcr條件(1)98℃預(yù)變性3min；(2)98℃變性10s；(3)55℃退火5s；(4)72℃延伸6.3min，步驟(2)～(4)共30個(gè)循環(huán)；(5)最后72℃延伸5min，4℃保存。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，利用dpni消化后導(dǎo)入e.colibl21(de3)，涂布至含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，得到單克隆。此輪定點(diǎn)飽和突變，一共產(chǎn)生200-300個(gè)單克隆，經(jīng)過(guò)測(cè)序，包含了所有20種天然氨基酸。

利用實(shí)施例2中的顯色反應(yīng)，初步檢測(cè)突變體的熱穩(wěn)定性、活力及區(qū)域選擇性，隨后利用液相色譜復(fù)篩驗(yàn)證。最終確定熱穩(wěn)定性提高突變體為t201i，t201f，t201w，核苷酸序列分別為seqidno.6，seqidno.7和seqidno.8所示。并且，利用同樣的方法，構(gòu)建組合突變體t201f/q343k/q339k，其核苷酸序列如序列表seqidno.9所示。

實(shí)施例4：腈水解酶突變體的表達(dá)

實(shí)施例2和實(shí)施例3中得到的突變體轉(zhuǎn)化子e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和組合突變體e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v接種到lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，按體積接種量2％接種至含有卡那霉素(終濃度50mg/l)的lb培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(37℃)。待培養(yǎng)液的od600為0.6-0.8之間，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mm，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時(shí)。培養(yǎng)液離心收集菌體，用生理鹽水清洗2次，得到濕菌體。

實(shí)施例5：腈水解酶突變體蛋白的純化

(1)向?qū)嵤├?中收集到的濕菌體中加入50mmnah2po4，300mmnacl緩沖液(ph8.0)，重懸菌體后超聲波破碎(400w,15min,1s破碎1s暫停)。破碎產(chǎn)物離心(12000×g,20min)后取上清液作為粗酶液，準(zhǔn)備分離純化。

(2)預(yù)裝好20mlni-nta親和層析柱后，使用平衡緩沖液(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)進(jìn)行平衡，流速為2ml/min。

(3)清洗8-10個(gè)柱體積后將所得到的粗酶液以1ml/min的流速通過(guò)ni-nta柱，目的蛋白則掛載在層析柱上。上樣后大量未吸附的雜蛋白不與樹(shù)脂結(jié)合，將直接被除去。

(4)使用洗脫緩沖液(50mmnah2po4，300mmnacl，50mm咪唑，ph8.0)洗脫弱吸附的雜蛋白，流速為2ml/min。

(5)使用蛋白洗脫緩沖液(50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph8.0)洗脫并收集目的蛋白，流速為2ml/min。

(6)收集的酶液使用透析袋(economicalbiotechmembrane，14kd，34mmwidth，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司)，透析液為質(zhì)量濃度0.9％氯化鈉水溶液，取截留液即為純化后的蛋白。

(7)通過(guò)sds-page分析純化后的蛋白，蛋白電泳結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例6：腈水解酶活力的測(cè)定

對(duì)實(shí)施例5中純化后的蛋白進(jìn)行酶活的測(cè)定。腈水解酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系(10ml)：緩沖液磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(100mm,ph7.0)，200mm1-氰基環(huán)己基乙腈，50-100mg純酶(優(yōu)選75mg)。反應(yīng)液于45℃預(yù)熱10min后，150rpm反應(yīng)10min。取樣500μl上清，加入500μl2m的hcl終止反應(yīng)后，利用液相色譜(島津lc-16)外標(biāo)法測(cè)定轉(zhuǎn)化液1-氰基環(huán)己基乙酸轉(zhuǎn)化率。色譜柱為c-18column(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為緩沖液(0.58g/l磷酸氫二銨，1.83g/l高氯酸鈉，高氯酸調(diào)節(jié)ph為1.8)∶乙腈＝76∶24(v/v)，流速為1ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，柱溫40℃。酶活定義(u)：在45℃、ph7.0，100mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液條件下，每分鐘催化生成1μmol1-氰基環(huán)己基乙酸所需要的酶量定義為1u。

實(shí)施例7：含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌活力測(cè)定

對(duì)實(shí)施例4中重組大腸桿菌進(jìn)行活力的測(cè)定。含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌活力檢測(cè)反應(yīng)體系(10ml)：緩沖液磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(200mm,ph7.0)，終濃度200mm1-氰基環(huán)己基乙腈，0.1g濕菌體。反應(yīng)液于45℃預(yù)熱10min后，150rpm反應(yīng)10min。取樣1ml，12000rpm離心3min后取上清，反應(yīng)液用高效液相色譜分析產(chǎn)物濃度。高效液相色譜分析條件如實(shí)施例6中所述。

實(shí)施例8：腈水解酶突變體45℃下溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

對(duì)實(shí)施例5中純化后的蛋白進(jìn)行熱穩(wěn)定性的測(cè)定。取一定量的蛋白于50ml無(wú)菌聚丙烯離心管中，保存于45℃恒溫水浴鍋中。于不同時(shí)間取出蛋白，按照實(shí)施例6的方法，測(cè)定蛋白的活力。以未保存時(shí)，蛋白的活力為對(duì)照，計(jì)算各時(shí)間下，蛋白的相對(duì)殘余活力(residualactivity，簡(jiǎn)稱ra)。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，相對(duì)殘余活力的自然對(duì)數(shù)(ln(ra))為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得出斜率k。根據(jù)一級(jí)失活動(dòng)力學(xué)的公式可以得到酶蛋白的半衰期t1/2。

經(jīng)測(cè)定，原始腈水解酶acn-f168v的半衰期為12.5h，突變體acn-t201w的半衰期為135h，突變體acn-t201l的半衰期為119h，突變體acn-t201i的半衰期為55h，突變體acn-t201f的半衰期為163h，突變體acn-q343k的半衰期為22.8h，突變體acn-q339k的半衰期為16.4h，組合突變體acn-t201f/q339k/q343k的半衰期為180h。

表2腈水解酶突變體在45℃下的半衰期

實(shí)施例9：含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌活力的測(cè)定

將實(shí)施例4中培養(yǎng)得到的含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v進(jìn)行活力的測(cè)定。腈水解酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系(10ml)：緩沖液磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(200mm,ph7.0)，終濃度100mm1-氰基環(huán)己基乙腈，重組大腸桿菌濕菌體10g/l。反應(yīng)液于45℃預(yù)熱10min后，150rpm反應(yīng)10min。取樣500μl上清，利用液相色譜(島津lc-16)外標(biāo)法測(cè)定轉(zhuǎn)化液1-氰基環(huán)己基乙酸轉(zhuǎn)化率。液相檢測(cè)條件如實(shí)施例6中所述，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

實(shí)施例10：含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌45℃下溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將實(shí)施例4中培養(yǎng)得到的含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201l，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201i，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-q339k和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v靜息細(xì)胞用緩沖液磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(200mm,ph7.0)配置成20g/l的菌懸液，保存于45℃恒溫水浴鍋中。于不同時(shí)間取出菌懸液，按照實(shí)施例9的方法，測(cè)定靜息細(xì)胞的活力。以未保存時(shí)，靜息細(xì)胞的活力為對(duì)照，計(jì)算各時(shí)間下，靜息細(xì)胞的相對(duì)殘余活力，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。同樣條件下測(cè)試實(shí)施例5獲得的腈水解酶突變體純化蛋白在45℃下溫度穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

實(shí)施例11：使用含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化750mm1-氰基環(huán)己基乙腈

分別稱取0.5g實(shí)施例4方法獲得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v濕菌體懸浮于10ml磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中(200mm，ph＝7.0)，加入1.125g1-氰基環(huán)己基乙腈(終濃度750mm)，45℃恒溫水浴反應(yīng)。于不同時(shí)間取樣，12000rpm離心，棄去沉淀。處理后的反應(yīng)液用高效液相色譜分析產(chǎn)物濃度。高效液相色譜分析條件如實(shí)施例6中所述。

經(jīng)測(cè)定，如圖5所述，突變體e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k均可在60min內(nèi)將底物反應(yīng)完全，遠(yuǎn)快于e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

實(shí)施例12：使用含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化1m1-氰基環(huán)己基乙腈

分別稱取0.5g實(shí)施例4方法獲得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201w以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v濕菌體懸浮于10ml磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中(200mm，ph＝7.0)，加入1.5g1-氰基環(huán)己基乙腈(終濃度1m)，45℃恒溫水浴反應(yīng)。于不同時(shí)間取樣，12000rpm離心，棄去沉淀。處理后的反應(yīng)液用高效液相色譜分析產(chǎn)物濃度。高效液相色譜分析條件如實(shí)施例6中所述。

經(jīng)測(cè)定，如表3所述，突變體e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f和e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k均可在2-2.5h內(nèi)將底物反應(yīng)完全，遠(yuǎn)優(yōu)于e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

表3含有腈水解酶突變體的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化1m1-氰基環(huán)己基乙腈

a：數(shù)據(jù)來(lái)源于xue,y.p.,etal.(2015).catalysiscommunications,66,121-125.

實(shí)施例13：使用含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化丙二腈和丁二腈

分別稱取0.1g實(shí)施例4方法獲得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v濕菌體懸浮于10ml磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中(200mm，ph＝7.0)，分別加入終濃度為50mm的丙二腈，丁二腈，45℃恒溫水浴反應(yīng)。于不同時(shí)間取樣，12000rpm離心，棄去沉淀。處理后的反應(yīng)液使用高效液相色譜測(cè)定。液相檢測(cè)方法如下，色譜柱為chromolithspeedrodrp-18column50×4.6mm(merck)，流動(dòng)相為乙腈/水/磷酸＝20:80:0.1％(v/v)，流速為2ml/min。

結(jié)果如表4所述，突變株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f及e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k在區(qū)域選擇性上與原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v相同，在催化丙二腈、丁二腈時(shí)，主要產(chǎn)物為單腈酸，且突變株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f及e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k的反應(yīng)速度均快于原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v。

表4使用含腈水解酶突變體的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化其他的α,ω-雙腈

實(shí)施例14：使用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化1m1-氰基環(huán)己基乙腈

分別稱取2g實(shí)施例4方法獲得的e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k，以及原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v濕菌體懸浮于20ml磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中(200mm，ph＝7.0)，加入0.006g/ml硅藻土，室溫?cái)嚢?h。隨后加入3％(v/v)聚乙烯亞胺(5％(w/w))，室溫?cái)嚢?h。最后加入1％(v/v)戊二醛(25％(w/w))，攪拌1h，真空抽濾獲得固定化細(xì)胞。

將上述得到的全部固定化細(xì)胞懸浮于20ml磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液體系中(200mm，ph＝7.0)，加入3g1-氰基環(huán)己基乙腈(終濃度1m)，45℃恒溫水浴反應(yīng)。其中由原始菌株e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-f168v制得的固定化細(xì)胞每批次反應(yīng)7-8小時(shí)，由e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f，e.colibl21(de3)/pet28b(+)-acn-t201f/q339k/q343k制得的固定化細(xì)胞，每批反應(yīng)時(shí)間2.5-3.5小時(shí)。每批反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行真空抽濾固液分離，反應(yīng)液用高效液相色譜分析產(chǎn)物濃度(見(jiàn)實(shí)施例6)，固定化細(xì)胞則投入下一批次反應(yīng)。結(jié)果如表5所示。

表5使用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化1m1-氰基環(huán)己基乙腈

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>腈水解酶突變體及其應(yīng)用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

acctccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>2

<211>369

<212>prt

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

metvalsertyrasnserlyspheleualaalathrvalglnalaglu

151015

provaltrpleuaspalaaspalathrileasplysserileglyile

202530

ilegluglualaalaglnlysglyalaserleuilealapheproglu

354045

valpheileproglytyrprotyrtrpalatrpleuglyaspvallys

505560

tyrserleuserphethrserargtyrhisgluasnserleugluleu

65707580

glyaspaspargmetargargleuglnleualaalaargargasnlys

859095

ilealaleuvalmetglytyrsergluargglualaglyserargtyr

100105110

leuserglnvalpheileaspgluargglygluilevalalaasnarg

115120125

arglysleulysprothrhisvalgluargthriletyrglyglugly

130135140

asnglythrasppheleuthrhisaspphealapheglyargvalgly

145150155160

glyleuasncystrpgluhispheglnproleuserlysphemetmet

165170175

tyrserleuglygluglnvalhisvalalasertrpproalametser

180185190

proleuglnproaspvalpheglnthrserileglualaasnalathr

195200205

valthrargsertyralailegluglyglnthrphevalleucysser

210215220

thrglnvalileglyproseralailegluthrphecysleuasnasp

225230235240

gluglnargalaleuleuproglnglycysglytrpalaargiletyr

245250255

glyproaspglysergluleualalysproleualagluaspalaglu

260265270

glyileleutyralagluileaspleugluglnileleuleualalys

275280285

alaglyalaaspprovalglyhistyrserargproaspvalleuser

290295300

valglnpheaspproargasnhisthrprovalhisargileglyile

305310315320

aspglyargleuaspvalasnthrargserargvalgluasnphearg

325330335

leuargglnalaalagluglngluargglnalaserlysargleugly

340345350

thrlysleuphegluglnserleuleualaglugluprovalproala

355360365

lys

<210>3

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

ctgtccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>4

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

acctccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtaaagca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>5

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

acctccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaaaaagaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>6

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

atttccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>7

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

ttttccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>8

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

tggtccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtcaggca1020

gcagaacaggaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110

<210>9

<211>1110

<212>dna

<213>unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

atggtatcttacaactccaaatttctggctgctaccgtacaggctgaaccggtttggctg60

gacgcggacgcaactatcgataaatctattggtatcatcgaggaggcggcccagaaaggt120

gcgtctctgattgccttcccggaagttttcatccctggttacccgtattgggcctggctg180

ggtgacgtaaagtactccctgtccttcacctcccgttaccacgaaaactccctggaactg240

ggtgacgaccgtatgcgccgtctgcaactggctgcgcgtcgtaacaaaatcgcgctggtt300

atgggttacagcgagcgtgaggcaggcagccgctacctgtcccaggtctttatcgacgaa360

cgtggtgaaatcgttgctaaccgtcgtaaactgaaaccaactcacgttgaacgtacgatt420

tatggtgaaggcaacggtaccgactttctgacgcatgacttcgcatttggtcgtgttggt480

ggtctgaactgctgggagcactttcagccgctgtccaaattcatgatgtactccctgggt540

gaacaggtacacgtcgcttcttggccggctatgtccccgctgcaaccggacgtgtttcaa600

ttttccatcgaggctaatgcgaccgtaacccgctcctatgctattgaaggccaaaccttc660

gttctgtgctctacgcaggttatcggtccgtctgcaattgaaaccttctgtctgaacgat720

gagcaacgtgcactgctgccgcagggttgcggttgggcgcgtatctacggcccggacggc780

agcgaactggccaagccgctggctgaagacgcagagggtattctgtacgcagaaatcgat840

ctggaacagattctgctggccaaggctggcgctgatccggttggtcactacagccgccct900

gatgtcctgtccgtgcagttcgacccgcgtaaccacaccccggtacaccgcattggtatc960

gatggccgtctggatgttaacacgcgttcccgtgtagaaaactttcgcctgcgtaaagca1020

gcagaaaaagaacgtcaggccagcaaacgtctgggcacgaaactgtttgaacagtctctg1080

ctggcggaggagccggtaccagccaaatag1110