本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今，在普遍采用的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,ipscells)分離和培養(yǎng)體系中，很大程度上依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞和血清，它們對(duì)于ipscells的自我更新和多能性的維持起著重要的作用(zhouetal.,2015)。
飼養(yǎng)層細(xì)胞在多潛能細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用由來(lái)已久，早在畸胎瘤細(xì)胞(embryoniccarcinomacells,ecc)體外培養(yǎng)時(shí)就開始了利用失去有絲分裂能力的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblasts,mefs)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，并且一直在小鼠、人類胚胎干細(xì)胞中沿用(zwakaandthomson，2005)。目前常用的小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞包括兩種：mefs和sto細(xì)胞。飼養(yǎng)層細(xì)胞在維持多潛能細(xì)胞自我更新和多能性上可能起著兩方面的作用，一是提供各種細(xì)胞因子，二是提供黏附面，比如飼養(yǎng)層細(xì)胞和多潛能細(xì)胞的直接接觸或者飼養(yǎng)層細(xì)胞提供的細(xì)胞外基質(zhì)與多潛能細(xì)胞的接觸。在小鼠胚胎干細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，已經(jīng)可以不需要飼養(yǎng)層細(xì)胞，只添加相應(yīng)的細(xì)胞因子即可。但是對(duì)于ipscells，這一問(wèn)題尚未得到完全解決，單獨(dú)添加白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，lif)或者堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf)不能支持細(xì)胞重編程的完成，也不能維持ipscells的自我更新和多能性狀態(tài)。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多種由飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，作為開發(fā)無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的候選者，比如fgf超家族和tgf超家族中的某些成員(raoetal.,2005)。另一方面，科學(xué)家也在積極尋找一些非飼養(yǎng)層分泌的物質(zhì)來(lái)直接抑制胚胎干細(xì)胞的自我分化，比如wnt信號(hào)的激活劑bio可以維持小鼠和人類胚胎干細(xì)胞的自我更新，這些物質(zhì)的尋找和應(yīng)用將使胚胎干細(xì)胞向臨床應(yīng)用邁出一大步。同時(shí)，有些科學(xué)家放棄小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，而選用來(lái)自人類的體細(xì)胞作為飼養(yǎng)層(duetal.,2015),但是，這對(duì)ipscells的純化帶來(lái)一些麻煩，安全隱患不能完全消除。
除了對(duì)飼養(yǎng)層細(xì)胞的依賴外，ipscells在分離和培養(yǎng)的過(guò)程中，容易出現(xiàn)自發(fā)分化，這很可能是由于培養(yǎng)基中的血清含有各種各樣的生長(zhǎng)因子和激素，可以誘導(dǎo)ipscells的分化，同時(shí)，不同批次的血清對(duì)細(xì)胞重編程效率和ipscells培養(yǎng)的影響差異很大，所以無(wú)血清培養(yǎng)勢(shì)在必行。目前分離ipscells普遍就采用血清替代品(knockoutserumreplacement)來(lái)替代原來(lái)培養(yǎng)系統(tǒng)中的血清。遺憾的是血清替代品中，仍然含有異源的清蛋白，而且具體成分及其含量由于商業(yè)關(guān)系尚不十分明確。
正是由于飼養(yǎng)層細(xì)胞和血清是來(lái)自其它動(dòng)物，其成分非常復(fù)雜，組成不明，而且品質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致現(xiàn)今的ipscells培養(yǎng)體系不僅存在著安全隱患，難以大規(guī)模培養(yǎng)ipscells供臨床應(yīng)用，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋也帶來(lái)了不少麻煩。
總之，人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipscells)分離培養(yǎng)的體系很大程度上依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞和血清，這種分離培養(yǎng)體系存在著安全隱患，難以大規(guī)模培養(yǎng)ipscells供臨床應(yīng)用。
因此，為了ipscells分離培養(yǎng)體系的改進(jìn)，本發(fā)明開發(fā)出無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞，無(wú)血清的分離培養(yǎng)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明將建立一種化學(xué)成分明確且不含飼養(yǎng)層和血清的人類ipscells分離培養(yǎng)方法，該方法不需要飼養(yǎng)層細(xì)胞和血清，培養(yǎng)基成分明確，操作簡(jiǎn)單，能夠高效穩(wěn)定地分離人類ipscells，維持其自我更新和多能性，為最終建立臨床應(yīng)用級(jí)別的人類ipscells分離培養(yǎng)體系打下良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的重編程培養(yǎng)基，包括：
dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(11330-032,gibco),47.75ml；n-2supplement(17502-048,gibco),0.5ml；b-27supplement(17504-044,gibco),1ml；memnon-essentialaminoacidsolution(11140-050,gibco),0.25ml；gluamax-i(100x)(35050-061,gibco),0.25ml；beta-mercaptoethnol(21985-023,gibco),90.9μl；100ng/mlbfgf,159.1μl。
一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括：tesrtm-e8tmkitforhesc/hipscmaintenance(貨號(hào)：05940，stemcelltechnologies)。
一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
1、分離人類外周血單核細(xì)胞，并在體外進(jìn)行擴(kuò)增；
2、構(gòu)建episomol載體，包含oct-4,nanog,klf-4和l-myc四種轉(zhuǎn)錄因子；
3、將episomol載體電轉(zhuǎn)染到人類外周血單核細(xì)胞；
4、在無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的重編程培養(yǎng)基中接種電轉(zhuǎn)染后的人類外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)20天后，進(jìn)行細(xì)胞重編程效率檢測(cè)，篩選出符合要求的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；
5、將篩選出的符合要求的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-21天，然后對(duì)ipscells樣集落進(jìn)行挑取和傳代；
6、對(duì)ipscells進(jìn)行鑒定和特異表達(dá)基因檢測(cè)，并進(jìn)行體外分化試驗(yàn)和體內(nèi)分化試驗(yàn)。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟1中，利用免疫磁珠法分離人類外周血單核細(xì)胞。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟4中，利用堿性磷酸酶染色法進(jìn)行細(xì)胞重編程效率檢測(cè)。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述鑒定包括ipscells的核型鑒定和多能性鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，利用熒光原位雜交方法進(jìn)行核型鑒定，每隔10代對(duì)ipscells的核型進(jìn)行鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，利用堿性磷酸酶染色、免疫組織化學(xué)、畸胎瘤形成、擬胚體(eb)分化和實(shí)時(shí)定量pcr(polymerasechainreaction)的方法進(jìn)行多能性鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，通過(guò)免疫熒光和rt-pcr檢測(cè)ipscells特異表達(dá)的基因，特異表達(dá)的基因包括oct-4、nanog、ssea-3、ssea-4、tra-1-60和tra-1-81。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述體外分化試驗(yàn)利用擬胚體(eb)的自發(fā)分化，檢測(cè)來(lái)源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的分化細(xì)胞。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述體內(nèi)分化試驗(yàn)利用畸胎瘤和組織切片方法檢測(cè)畸胎瘤中來(lái)源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的分化細(xì)胞。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明建立一種化學(xué)成分明確的不含飼養(yǎng)層和血清的人類ipscells分離培養(yǎng)體系，這種體系可以不需要利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mefs)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，也不需要血清作為添加劑，其培養(yǎng)基成分明確，操作簡(jiǎn)單，能高效穩(wěn)定地分離和培養(yǎng)人類ips細(xì)胞，維持其自我更新和多能性，為最終建立臨床應(yīng)用級(jí)別的人類ips細(xì)胞分離培養(yǎng)體系打下良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。
附圖說(shuō)明
本發(fā)明有如下附圖：
圖1本發(fā)明的方法流程示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的重編程培養(yǎng)基，包括：
dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(11330-032,gibco),47.75ml；n-2supplement(17502-048,gibco),0.5ml；b-27supplement(17504-044,gibco),1ml；memnon-essentialaminoacidsolution(11140-050,gibco),0.25ml；gluamax-i(100x)(35050-061,gibco),0.25ml；beta-mercaptoethnol(21985-023,gibco),90.9μl；100ng/mlbfgf,159.1μl。
一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括：tesrtm-e8tmkitforhesc/hipscmaintenance(貨號(hào)：05940，stemcelltechnologies)。
如圖1所示，一種無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
1、分離人類外周血單核細(xì)胞，并在體外進(jìn)行擴(kuò)增；
2、構(gòu)建episomol載體，包含oct-4,nanog,klf-4和l-myc四種轉(zhuǎn)錄因子；
3、將episomol載體電轉(zhuǎn)染到人類外周血單核細(xì)胞；
4、在無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的重編程培養(yǎng)基中接種電轉(zhuǎn)染后的人類外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)20天后，進(jìn)行細(xì)胞重編程效率檢測(cè)，篩選出符合要求的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；
5、將篩選出的符合要求的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)層無(wú)血清的人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14-21天，然后對(duì)ipscells樣集落進(jìn)行挑取和傳代；
6、對(duì)ipscells進(jìn)行鑒定和特異表達(dá)基因檢測(cè)，并進(jìn)行體外分化試驗(yàn)和體內(nèi)分化試驗(yàn)。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟1中，利用免疫磁珠法分離人類外周血單核細(xì)胞。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟4中，利用堿性磷酸酶染色法進(jìn)行細(xì)胞重編程效率檢測(cè)。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述鑒定包括ipscells的核型鑒定和多能性鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，利用熒光原位雜交方法進(jìn)行核型鑒定，每隔10代對(duì)ipscells的核型進(jìn)行鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，利用堿性磷酸酶染色、免疫組織化學(xué)、畸胎瘤形成、擬胚體(eb)分化和實(shí)時(shí)定量pcr(polymerasechainreaction)的方法進(jìn)行多能性鑒定。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，通過(guò)免疫熒光和rt-pcr檢測(cè)ipscells特異表達(dá)的基因，特異表達(dá)的基因包括oct-4、nanog、ssea-3、ssea-4、tra-1-60和tra-1-81。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述體外分化試驗(yàn)利用擬胚體(eb)的自發(fā)分化，檢測(cè)來(lái)源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的分化細(xì)胞。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟6中，所述體內(nèi)分化試驗(yàn)利用畸胎瘤和組織切片方法檢測(cè)畸胎瘤中來(lái)源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的分化細(xì)胞。
本說(shuō)明書中未做詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。