一種從植物葉片快速提取dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用葉片組織快速提取甜菜總DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甜菜栽培種包括葉用甜糖、飼料甜菜、食用甜菜以及糖用甜菜，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛應(yīng)用。
[0003]糖甜菜是重要的糖料作物之一，葉用甜菜及食用甜菜具有極高的食用及醫(yī)用價(jià)值，飼料甜菜是優(yōu)良的動(dòng)物飼料之一。生物工程及生物技術(shù)手段應(yīng)用于甜菜種質(zhì)資源的分子遺傳育種及品種改良離不開甜菜DNA的提取。
[0004]目前包括甜菜屬在內(nèi)的植物DNA提取常用的方法源于經(jīng)典的SDS法，CTAB法，磁珠法等方法經(jīng)過改良或修飾，但這些方法存在步驟多，樣品前期處理復(fù)雜，操作時(shí)間長；化學(xué)試劑多，離不開苯酚、飽和酚、巰基乙醇、異硫氰酸胍等對人體有害的有毒試劑，有些方法還要附加蛋白酶K、RNA酶、DTT等價(jià)格昂貴的試劑，而且所需組織材料量多；使用商品化試劑盒提取植物DNA雖然步驟明顯簡化也沒有本發(fā)明方法簡單，購買試劑盒不僅成本高，而且其含有的強(qiáng)變性劑成分對皮膚有傷害作用。
[0005]本發(fā)明只使用提取液、分離液、沉淀液3種溶劑，3次離心，從葉片中快速獲得甜菜總DNA。高溫水浴及2次分離液分離過程，高速離心，有效的去除了蛋白及多糖等雜質(zhì)，_20°C預(yù)冷沉淀液加速DNA沉淀效果。本方法樣品前期處理簡單，只需少量葉片(5mg-50mg)直接在離心管中研磨即可，使用有毒化學(xué)試劑成分少，避免了試驗(yàn)操作過程中巰基乙醇、酚等化學(xué)試劑對人體危害及環(huán)境污染；獲得的甜菜DNA純度好，瓊脂糖電泳帶型清晰，熒光分光光度計(jì)檢測0D260/0D280為1.75-1.82之間，0D260/0D230為2.05-2.16之間，可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)應(yīng)用于分子標(biāo)記、指紋圖譜等分子生物學(xué)試驗(yàn)，為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)分子育種及分子生物學(xué)領(lǐng)的研宄提供了前期DNA核酸基礎(chǔ)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有植物DNA提取方法存在樣品處理復(fù)雜、步驟多、時(shí)間長、對環(huán)境及人體有毒化學(xué)試劑成分多、試劑價(jià)格高等問題，而提供了利用少量葉片組織快速提取甜菜總DNA的方法。
[0007]本發(fā)明的一種從植物葉片快速提取DNA的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0008]一、取植物葉片置于離心管內(nèi)，直接在離心管內(nèi)研磨葉片；
[0009]二、向步驟一中研磨完葉片后的離心管中加入5?8倍葉片體積的提取緩沖液，得葉片組織混合液；在水浴溫度為55°C?65°C的條件下處理15?30min，然后加入與葉片混合液等體積的分離液，進(jìn)行高速離心，取上清液加入等體積的分離液，再進(jìn)行高速離心；取上清液加入2/3體積的沉淀液，直接進(jìn)行低速離心，去上清收集沉淀；
[0010]三、將步驟二收集的沉淀加入滅菌水或TE緩沖液保存于-20°C中，即完成所述的從甜菜葉片快速提取DNA;
[0011]其中，提取緩沖液配方為:濃度為lOOmmol/L的Tris *C1溶液，濃度為20mmol/L的Na2EDTA.2H20溶液，濃度為1.6mol/L的NaCl溶液，質(zhì)量百分含量為2.0 %的CTAB溶液；
[0012]分離液為氯仿\異戊醇按體積比為25:1的比例混合后的混合液；
[0013]DNA沉淀液為在_20°C預(yù)冷不小于20min的異丙醇溶液。
[0014]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0015]本發(fā)明的方法快速省時(shí)，只需30分鐘，試驗(yàn)所需器材、藥品少，成本低，易于操作，實(shí)驗(yàn)效果良好。獲得DNA包括核基因組DNA、線粒體DNA以及葉綠體DNA、可直接用于PCR擴(kuò)增細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中基因片段，也可應(yīng)用于分子標(biāo)記、指紋圖譜等分子生物學(xué)試驗(yàn)，為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中分子育種及分子生物學(xué)領(lǐng)域后續(xù)目的基因的克隆、轉(zhuǎn)化研宄的進(jìn)行提供了 DNA核酸基礎(chǔ)材料。
[0016]本發(fā)明只需要取少量(5mg?50mg)葉片即可完成DNA提取，本發(fā)明將取到的葉片放入1.2ml EfTendorf離心管內(nèi)研磨后，即可進(jìn)行后續(xù)操作，不需要再更換離心管，減少了研缽、試管等耗材用量及一些不必要地污染，樣品處理簡單、快速、成本低，適合大批量樣品DNA的快速提取試驗(yàn)。另外，本發(fā)明在采用液氮研磨葉片時(shí)，是將裝有葉片的蓋蓋離心管從裝有液氮的容器中取出后迅速進(jìn)行研磨，而不是將液氮倒入離心管或研缽內(nèi)直接接觸葉片樣品，防止了液氮中雜質(zhì)污染葉片組織，同時(shí)避免了液氮接觸樣品瞬間揮發(fā)對操作者皮膚的傷害；本發(fā)明采用14000r/min?16000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘進(jìn)行DNA分離，即可，而并非采用常規(guī)的低速離心，致使分離效果差，殘留少量蛋白質(zhì)；本發(fā)明采用-20°C冰箱中充分冷凍的沉淀液直接沉淀DNA，不需要沉淀時(shí)間，直接進(jìn)行下一步操作，節(jié)省時(shí)間且效果好。
[0017]此外，本發(fā)明分離液只有氯仿\異戊醇，并不含有酚，提取液中不含有巰基乙醇，因此，不存在強(qiáng)毒性地物質(zhì)，對人體造成傷害并污染環(huán)境，從而也省去了后續(xù)的一些去除這些化學(xué)物質(zhì)的操作步驟。
【附圖說明】
[0018]圖1為提取的甜菜DNA瓊脂糖電泳結(jié)果圖；其中，M:DL2000 Marker ;泳道I?3分別為三種不同的栽培甜菜。
【具體實(shí)施方式】
[0019]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一種從植物葉片快速提取DNA的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的:
[0020]一、取植物葉片置于離心管內(nèi)，直接在離心管內(nèi)研磨葉片；
[0021]二、向步驟一中研磨完葉片后的離心管中加入5?8倍葉片體積的提取緩沖液，得葉片組織混合液；在水浴溫度為55°C?65°C的條件下處理15?30min，然后加入與葉片混合液等體積的分離液，進(jìn)行高速離心，取上清液加入等體積的分離液，再進(jìn)行高速離心；取上清液加入2/3體積的沉淀液，直接進(jìn)行低速離心，去上清收集沉淀；
[0022]三、將步驟二收集的沉淀加入滅菌水或TE緩沖液保存于_20°C中，即完成所述的從甜菜葉片快速提取DNA;
[0023]其中，提取緩沖液配方為:濃度為lOOmmol/L的Tris *C1溶液，濃度為20mmol/L的Na2EDTA.2H20溶液，濃度為1.6mol/L的NaCl溶液，質(zhì)量百分含量為2.0 %的CTAB溶液；
[0024]分離液為氯仿\異戊醇按體積比為25:1的比例混合后的混合液；
[0025]DNA沉淀液為在-20°C預(yù)冷不小于20min的異丙醇溶液。
[0026]本實(shí)施方式所述的DNA包括細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA以及細(xì)胞質(zhì)中DNA ;例如線粒體DNA,葉綠體DNA。
[0027]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中所述的植物葉片來源于生長期及器官部位的葉片組織。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:所述的生長期及器官部位的葉片組織為營養(yǎng)生長階段時(shí)期的葉片、生殖生長階段抽薹花枝上葉片或塊狀根頂部葉片。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0029]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:所述的葉片組織為子葉的葉片、真葉的葉片、新葉的葉片、老葉的葉片、干葉的葉片或凍葉的葉片。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0030]本實(shí)施方式中所述的新葉指各生長時(shí)期的新鮮嫩葉片，老葉指營養(yǎng)生長后期外部萎蔫葉片及采摘后室溫儲(chǔ)藏的萎蔫葉片。
[0031]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:所述的植物葉片為甜菜葉片。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0032]本實(shí)施方式所述的甜菜為甜菜(Beta)屬內(nèi)的所有種和亞種，以及所有種類的栽培甜菜和野生甜菜；其中，栽培甜菜分為4組:葉用甜菜(Ieafbeet)，飼料甜菜(fodderbeet)，食用甜菜(garden beet)以及糖用甜菜(sugar beet)。
[0033]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟二中在水浴溫度為58°C?65°C的條件下處理15min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0034]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟二中在水浴溫度為60°C的條件下處理15min。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0035]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟二中加分離液離心的條件為在轉(zhuǎn)速為14000r/min?16000r/min的條件下離心5?10分鐘。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0036]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:Tris ?Cl溶液的pH =8.0o其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0037]【具體實(shí)施方式】十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:Na2EDTA.2H20溶液的PH = 8.0ο其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0038]【具體實(shí)施方式】^^一:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一