一種利用植物抗病基因富集簇的分子育種方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物抗病育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用植物抗病基因富集簇的分子育 種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于植物病害每年給農(nóng)、林生產(chǎn)帶來巨大的損失，合理有效地防治植物病害是保 障農(nóng)、林可持續(xù)發(fā)展所必須解決的關(guān)鍵問題之一。大量實踐證明，開發(fā)和利用已有的植物抗 病種質(zhì)資源是防治植物病害最為有效的方法之一，其中又以植物抗病基因的開發(fā)與利用最 為經(jīng)濟有效。
[0003] 但到目前為止，國際、國內(nèi)傳統(tǒng)的抗病育種主要有兩種途徑：途徑一，常規(guī)育種方 法，即將優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種與抗病性強的材料雜交，然后通過不斷的回交選育，最后得到抗病 且優(yōu)質(zhì)的新品種。這一過程盡管有效，但極其耗時，因此當(dāng)新品種培育出來之后，極可能對 病原菌新進化產(chǎn)生的株系或小種表現(xiàn)為感病。途徑二：利用基因定位、克隆、轉(zhuǎn)基因的途徑， 目前利用最多的克隆方式為經(jīng)典的圖位克隆方法，即將抗病和感病的品種雜交，然后對大 量的分離后代接種病菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，最后在精確遺傳定位的基礎(chǔ)上進行克??； 這種方法雖然取得了一定的效果，但同樣存在克隆周期長、費時費力、分離和鑒定困難，難 于找到用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有效基因。以水稻抗稻瘟病基因為例，到目前為止，全世界共克隆了 20多個抗稻瘟病基因，且尚無用于生產(chǎn)實際的報道。追溯其主要原因，我們認為，缺乏對植 物抗病基因抗病機制及田間持久抗性機制的認知所致。
[0004] 植物抗病基因是植物與病原菌長期相互作用的結(jié)果，在植物的進化過程中扮演著 十分重要的角色。近年來，植物抗病分子機制的研究取得了突破性進展，但從生產(chǎn)實踐的 角度看，目前植物抗病基因的研究存在三個根本問題：一是能否發(fā)現(xiàn)抗病基因的高效克隆 方法；二是究竟能否找到廣譜高抗的基因；三是多少抗病基因才能使一個品種具有田間抗 性，從而使這些基因用于育種實踐。由于克隆的抗病基因數(shù)量太少，因而尚不知道一個基因 組有多少抗病基因？在高抗品系中是否存在廣譜高抗的基因？決定品種抗性的究竟是幾 個主效抗病基因，還是許多個抗不同病菌小種基因的組合？這些基本問題不清楚，就不知 道抗病基因抗性變化及其在基因組中分布的規(guī)律性，很難實現(xiàn)抗病基因的實用化。
[0005] 我們另辟新徑，提出了以植物與病菌共進化為基礎(chǔ)的抗病基因克隆方法，專利申 請?zhí)枺?01210453400. 9。該方法的基本假設(shè)為，為了對付快速進化的病菌，寄主的抗病基因 位點的進化也更快。反之，植物對付進化較慢的病菌（或病菌的基因），其相應(yīng)抗病基因進 化也較慢。我們以水稻稻瘟病的抗性為例進行了研究，通過各種遺傳參數(shù)的計算，從而估計 每一個基因位點的進化速度，在水稻基因組500多個NBS-LRR基因位點中，選出了 130多個 進化快的位點；在10個高抗品系中系統(tǒng)的克隆這些位點的基因，共克隆了約1000個候選抗 病基因；通過遺傳轉(zhuǎn)化到感病品系，最后用不同小種的稻瘟病菌鑒定其抗性。最終，我們一 共獲得168個功能性抗稻瘟病基因，其中含27個抗譜廣、抗性強的抗稻瘟病基因。
[0006] 通過對抗病基因在各個品種基因組的遺傳定位分析，發(fā)現(xiàn)多個高抗廣譜的基因位 于某個高抗品種的同一個基因簇中，即抗稻瘟病基因的富集簇。這些抗病基因的富集簇，不 僅為指導(dǎo)我們利用抗病基因富集簇進行分子抗病育種提供了理論基礎(chǔ)，同時由于我們非常 清楚這些富集簇的染色體位置、序列、來源品系等，為我們進行快速的抗病育種提供了可靠 的原材料。
[0007] 目前克隆的基因，還沒有用于生產(chǎn)的成功例子。一個突出的問題是：從抗性很好的 水稻供體品系中克隆的基因，其抗譜和抗性均欠佳。抗稻瘟病的基因Pi2/9就是突出的例 子，其供體抗譜很廣，但克隆的pi2/9單個基因的抗性則相對有限。這種現(xiàn)象暗示，一個抗 病品種中可能含有多個抗稻瘟病基因。要使抗稻瘟病基因用于實際生產(chǎn)，不僅需要一定數(shù) 量的廣譜高抗基因，而且需要把他們組合到一起。因此，定位育成的品種，多了 5-10個廣譜 高抗的基因，抗性強或抗性得到加強，使之可以在生產(chǎn)上繼續(xù)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種稻瘟病性強的利用植物抗病基因富集簇 的分子育種方法及其應(yīng)用。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明提供了一種利用植物 抗病基因富集簇的分子育種方法，包括如下步驟：
[0010] (1)抗稻瘟病基因富集簇的挖掘與功能驗證：篩選含抗稻瘟病基因的候選基因 簇，選擇15-20個高抗稻瘟病的水稻品系；
[0011] 對候選富集簇的每一個基因進行克隆，通過遺傳轉(zhuǎn)化這些基因到感病品系，最后 用不同小種的稻瘟病菌鑒定其抗性；篩選2個或多于2個抗病基因的富集簇，其中包括廣譜 尚抗的基因；
[0012] (2)挑選抗病基因位點：挑選可靠的抗病基因富集簇，只需一個標(biāo)記，即一個單 位，就代表了 2個或更多的抗病基因，選擇1個或多個富集簇作為導(dǎo)入對象；
[0013](3)培育中介品種：每一個富集簇，都來源于一個特定抗源品系，不同的富集簇， 來源于同一抗源或來自不同抗源；
[0014] 這些抗源與數(shù)個具備優(yōu)良農(nóng)藝性狀的水稻品種雜交獲得"中介品種"，使每一個中 介品種含有1個或多個富集簇，平均5個以上抗稻瘟病基因；
[0015] 中介品種的富集簇區(qū)段要保證純合，其余則無需純合，可以自交繁殖；
[0016] 對中介品種和抗源親本均需全基因組測序來獲取高密度標(biāo)記；
[0017] 優(yōu)良的中介品種也可直接作為抗病的優(yōu)良品種；
[0018] (4)篩選目的品種：在廣泛推廣的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)但抗稻瘟病欠佳；或開始喪失抗性的 優(yōu)良品種中；或在區(qū)試中表型優(yōu)異但抗稻瘟病欠佳的品系中，選擇數(shù)十個目的品種作為抗 病性改造對象，對每一個目的品種全基因組測序并與中介品種比較，從而在每一個Mb的染 色體上找到3-5個特定遺傳標(biāo)記；
[0019] (5)定位選育抗病品種：對每一個目的品種都與1-2個中介品種雜交并回交，對回 交子代幼苗提取DNA，用PCR檢測96遺傳標(biāo)記，大約每3個Mb -個標(biāo)記；
[0020] 選擇具有富集簇標(biāo)記，但其余標(biāo)記均為目的品種的株系；再回交1-2次，用更多標(biāo) 記進行檢測，保證除了富集簇標(biāo)記而外，均為目的品種的遺傳標(biāo)記；
[0021] 同時，觀察育成品種優(yōu)良農(nóng)藝性狀是否保持；最后，觀察育成品種的表型是否抗性 變強。
[0022] 進一步地，在步驟（1)中，篩選含抗稻瘟病基因的候選基因簇，根據(jù)NBS-LRR基因 簇數(shù)量、進化速率、品種間同一基因簇拷貝數(shù)量變化及核苷酸差異度遺傳特征來進行挑選。
[0023] 進一步地，在步驟（1)中，水稻品系為Tetep，谷梅2號，Moroberekan、LAC23或PAI KAN TA0〇
[0024] 更進一步地，在步驟（3)中，挑選具備優(yōu)良性狀的水稻品種，將其與含富集簇的抗 源品系進行雜交，得到富集簇區(qū)段純合的中介品種。
[0025] 進一步地，在步驟（4)中，目的品種和中介品種每Mb染色體上為特定遺傳標(biāo)記。
[0026] 本發(fā)明所述的含多個抗病基因的富集簇，其包含的稻瘟病抗性基因的核苷酸序列 分別如SEQIDN0:1-15所示。
[0027] 本發(fā)明含有所述的稻瘟病抗性基因的載體。
[0028] 本發(fā)明所述的稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0:16-30。
[0029] 本發(fā)明所述的稻瘟病抗性基因在制備轉(zhuǎn)基因抗稻瘟病水稻的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明所述的載體用于轉(zhuǎn)化水稻從而制備轉(zhuǎn)基因抗稻瘟病水稻中的應(yīng)用。
[0031] 有益效果：本發(fā)明的分子育種方法得到的水稻的稻瘟病性強并能保持優(yōu)良農(nóng)藝性 狀，選育成的僅含富集簇標(biāo)記和目的品種遺傳標(biāo)記的抗病品種，最終育成的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗 病的新水稻品系。利用植物抗病基因富集簇的分子育種，可望與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種相結(jié)合，避開 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，實現(xiàn)作物抗病育種方法的突破，形成一套全新、高效的作物育種體系?？梢怨?其他農(nóng)藝性狀精準(zhǔn)定位育種借鑒與應(yīng)用；抗病基因在育