普通小麥抗病序列的全基因組ssr特異分子標(biāo)記及開發(fā)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法，尤其設(shè)及小麥分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)方法， 具體為普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標(biāo)記及開發(fā)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為我國(guó)傳統(tǒng)的主糧作物，其生產(chǎn)關(guān)乎國(guó)家糧食安全和人民生活水平，然而 由病原菌入侵引起的白粉病、誘病等小麥病害在我國(guó)各大麥區(qū)均常年發(fā)生，導(dǎo)致小麥嚴(yán)重 減產(chǎn)。W白粉病為例，1990年和1991年全國(guó)白粉病大爆發(fā)造成當(dāng)年1.44億噸和0.77億 噸小麥產(chǎn)量的損失。小麥抗病分子育種可大大縮短育種年限，使育成種能盡快用于生產(chǎn) 減少損失，是防治小麥病害最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法。育種過程中用于抗病基因定位和 輔助選擇的分子標(biāo)記主要是SSR(SimpleSequenceRepeats)標(biāo)記，該類標(biāo)記為第二代 分子標(biāo)記，變異豐富而且成本低廉。在小麥測(cè)序草圖未公布之前，有專利技術(shù)（申請(qǐng)?zhí)?201310579379. 1)利用現(xiàn)有SSR標(biāo)記引物比對(duì)小麥片段重疊群來擴(kuò)充標(biāo)記數(shù)量，從而加密 遺傳圖譜。但由于小麥具有龐大的基因組(為水稻的40倍，玉米的6. 6倍)和高度重復(fù)的序 列（80%W上)，使得利用序列片段開發(fā)的SSR標(biāo)記常存在多位點(diǎn)現(xiàn)象，加之用于分子標(biāo)記輔 助選擇（MAS,MarkerAssistedSelection)的SSR標(biāo)記與目標(biāo)基因遺傳距離大都在IcMW 上，極容易造成MAS過程中標(biāo)記所跟蹤信息的丟失，導(dǎo)致育種失敗。該專利方法雖然增加了 SSR標(biāo)記的多態(tài)性，但由于其自身方法存在的局限性，仍無法解決SSR標(biāo)記本身存在的位點(diǎn) 多W及與目的基因距離遠(yuǎn)的問題。而目前雖然研發(fā)出了高精準(zhǔn)度的商業(yè)化SNP標(biāo)記忍片， 卻因成本較高，不能大規(guī)模用于實(shí)際生產(chǎn)。
[0003] 植物中的抗病基因能通過編碼不同的保守蛋白結(jié)構(gòu)來抵御病原菌入侵，如蛋白激 酶（proteinkinase,PK)、跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembranedomain,TM)和核巧酸結(jié)合位點(diǎn) (nucleotidebindingsite,NBS)等，其中NBS類基因是植物中數(shù)量最多的一類抗病基 因。在目前已克隆的13個(gè)小麥抗病基因中，/?泌、你光、巧??·?/、/?必·、化Zr7、化 義5>甘5運(yùn)10個(gè)基因均為NBS類抗病基因，其余3個(gè)為ΡΚ類（/?。厶ZrJ仿和TM類（/?泌） 抗病基因。隨著2014年小麥測(cè)序草圖的公布，使得在全基因組范圍內(nèi)分離小麥抗病序列成 為可能?；谛←溈共⌒蛄虚_發(fā)的SSR標(biāo)記，不但保留了豐富多態(tài)性，而且具有極高的特異 性W及與抗性的連鎖程度，并且成本低廉，可廣泛用于小麥抗性基因定位、候選基因篩選、 遺傳圖譜構(gòu)建W及分子標(biāo)記輔助育種等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決目前現(xiàn)有的小麥抗病育種SSR標(biāo)記存在點(diǎn)位多、與目的基因距離較遠(yuǎn) 的問題，提供一種普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標(biāo)記及開發(fā)方法。 陽(yáng)0化]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子 標(biāo)記開發(fā)方法，包括W下操作步驟： 1) 、本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建：下載普通小麥品種蛋白數(shù)據(jù)和全基因組數(shù)據(jù)，建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)； 2) 、目的序列獲得及檢測(cè)：利用已克隆抗病類家族基因得到的隱馬爾可夫模型文件檢 索小麥蛋白數(shù)據(jù)，所得序列經(jīng)結(jié)構(gòu)域檢測(cè)篩選出包含目標(biāo)抗病結(jié)構(gòu)的完整編碼蛋白序列， 根據(jù)小麥蛋白序列的染色體分布圖選出位于某一染色體上的序列，將運(yùn)些序列檢索本地全 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到相應(yīng)的基因組序列片段（即scafTold); 3) 、SSR位點(diǎn)確定及標(biāo)記開發(fā)：檢測(cè)每條scafTold序列上的簡(jiǎn)單重復(fù)序列位點(diǎn)，在SSR 位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，合成核巧酸序列，得到相應(yīng)的SSR分子標(biāo)記。
[0006] 第一步利用小麥蛋白數(shù)據(jù)和全基因組數(shù)據(jù)建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，便于后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢 索。第二步利用現(xiàn)有技術(shù)中可下載得到的已克隆抗病類基因家族的模型文件檢索本地蛋白 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得包含完整目標(biāo)結(jié)構(gòu)的蛋白序列；為方便下一步染色體特異標(biāo)記的開發(fā)，W單條 染色體臂為單位，將每條臂上所有目標(biāo)蛋白序列檢索基因數(shù)據(jù)庫(kù)，得到對(duì)應(yīng)的基因組序列 片段，完成目標(biāo)蛋白序列向基因序列的轉(zhuǎn)化。第Ξ步將得到的基因序列檢索得到SSR位點(diǎn)， 在位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，送至公司合成相應(yīng)的核巧酸序列，即得到本發(fā)明方法開發(fā)的SSR分 子標(biāo)記。
[0007] 本發(fā)明還可W包括W下操作步驟：4)、特異標(biāo)記篩選缺體-四體和雙端體材料 的基因組DNA作為模板，所合成SSR標(biāo)記為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)8% 非變性聚丙締酷胺凝膠電泳后用銀染法染色，于燈箱上觀察并拍照記錄。拍照結(jié)果顯示，標(biāo) 記在某個(gè)缺體-四體中擴(kuò)增不出目標(biāo)帶，表明該標(biāo)記位于此缺體-四體所缺失的染色體上， 標(biāo)記在雙端體中擴(kuò)增不出目標(biāo)帶，表明該標(biāo)記不在此雙端體染色體臂上，而是位于其對(duì)應(yīng) 的另外一半染色體臂上。
[000引本發(fā)明在保留了現(xiàn)有SSR標(biāo)記技術(shù)變異類型豐富和成本低廉的基礎(chǔ)上，還具有W下有益效果：1、位置明確、特異性強(qiáng)；本方法中開發(fā)的每個(gè)分子標(biāo)記均具有明確的基因組 位置，并且經(jīng)過中國(guó)春缺體-四體和雙端體材料篩選，標(biāo)記具有極高的特異性，大大減少了 基因定位過程中小麥A、B、D亞基因組之間的誤差；2、與抗病候選基因距離極其緊密；本方 法中開發(fā)的每個(gè)分子標(biāo)記均與小麥抗病序列位于同一條scafTold序列上，當(dāng)某個(gè)抗病序 列被確定為抗病基因時(shí)，其最近的SSR標(biāo)記與之緊密連鎖，幾乎不發(fā)生交換，可W作為共分 離標(biāo)記使用，極大的提高了育種過程中分子標(biāo)記輔助選擇的效率。
【附圖說明】
[0009] 圖1為小麥2AL染色體上NBS-SSR標(biāo)記開發(fā)流程圖； 圖2為小麥TaNBS蛋白序列的染色體分布； 圖3為小麥NBS-SSR標(biāo)記的特異性篩選圖； 圖4為小麥NBS-SSR特異標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 為了使本發(fā)明的技術(shù)方案更加清楚明白，接下來W普通小麥品種中國(guó)春2A染色 體長(zhǎng)臂上NBS-SSR標(biāo)記開發(fā)為例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0011] 基于小麥NBS抗病序列的全基因組SSR特異分子標(biāo)記開發(fā)方法： 1)、本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建：從URGI數(shù)據(jù)庫(kù) 〇ittps://urgi·Versailles,inra.fr/)中 下載普通小麥品種中國(guó)春蛋白數(shù)據(jù)（Ta.IWGSC2.25.p巧.all.fa)和全基因組數(shù)據(jù)（Ta.IWGSC2. 25.化a.c虹ο. 2AL.fa),利用NCBI本地BLAST工具建立本地全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，所用 命令為i^ormatdb-iTa.IWGSC2. 25.化a.C虹0. 2AL.fa-pF-〇t; 2)、目的序列獲得及檢測(cè)J:從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp://pfam. sanger. ac.址/)中下載 NBS家族(登錄號(hào)為PF00931)的隱馬爾可夫模型文件NB-ACR.hmm，在Hmmer3.0軟件中 通過hmmsearch程序檢索小麥蛋白數(shù)據(jù)包，獲得3982條蛋白序列，之后用SMART服務(wù)器 化t1:p://sma;rt. embl-heide化erg. de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測(cè)，E值設(shè)為0,從中篩選出2406條 包含NBS結(jié)構(gòu)的完整蛋白序列，根據(jù)序列編號(hào)選出位于2AL染色體上的56條NBS序列巧曰 圖2所示，2AL染色體上包含56條NBS序列)，將運(yùn)些序列檢索本地全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到相 應(yīng)的基因組序列片段（scaffold),檢索命令為：〉blas1:all.exe -p憂lastn -i pep. fas -d Ta. IWGSC2. 25. dna. c虹o. 2AL. fa -ofile. fa -v5 -b5 -m8 -a4; 3) 、SSR位點(diǎn)確定及標(biāo)記開發(fā)：使用SSRHunter軟件檢測(cè)小麥2AL染色