雞新城疫病毒yt毒株、其全基因組序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株分離的雞新城疫病毒毒株、其全基因組序列及其應(yīng)用，屬于雞新城疫病毒毒株的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開(kāi)了分離的雞新城疫病毒毒株的全基因組序列，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明還公開(kāi)了一株雞新城疫病毒YT株，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC?No.8789。免疫原性比較結(jié)果顯示，本發(fā)明所分離的YT株有良好的免疫原性，能提供較La?Sota疫苗更好的臨床保護(hù)率且能有效降低排毒率。交叉血凝抑制實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明YT株抗血清對(duì)YT抗原及La?Sota抗原均有很好的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明雞新城疫病毒YT株及其基因組序列能夠用于制備預(yù)防雞新城疫病毒疫苗和抗雞新城疫病毒的中和抗體。
【專利說(shuō)明】雞新城疫病毒YT毒株、其全基因組序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雞新城疫病毒株，尤其涉及一株雞新城疫病毒毒株及其全基因組序列，本發(fā)明還涉及該雞新城疫病毒毒株及其全基因組序列在制備預(yù)防雞新城疫疫苗和制備抗雞新城疫病毒中和抗體中的應(yīng)用，屬于雞新城疫病毒毒株的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(newcastledisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征，具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)將其列為A類疫病。
[0003]新城疫病毒屬于副粘病毒科、腮腺炎病毒屬的I型禽副粘病毒，為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。整個(gè)基因組長(zhǎng)度約為15kb，包含6個(gè)功能基因:3' -NP-P-M-F-HN-L-5丨，分別編碼6個(gè)主要蛋白質(zhì)(NP蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、HN蛋白和L蛋白)。NDV的血清型只有一種，但是其生物學(xué)特性在不同毒株間差異較大。為了能更好區(qū)分不同毒株間的差異，A.Ballag1-Porddiny等應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行繪制融合糖蛋白(F蛋白)的基因分型和序列分析，把NDV劃分為9個(gè)基因型(I~IX) (A.Ballag1-Pordany, E.ffehmann, J Herczeg, et al.1dentification and grouping of Newcastle disease virusstrains by restriction site analysis of a region from the F gene[J].ArchVirol,1996，141(2):243-261.)。
[0004]目前，在中國(guó) 流行的新城疫毒株主要是以基因VII型為主，同時(shí)也暴發(fā)基因V1、VIII和IX型。中國(guó)現(xiàn)行的疫苗株為I系、II系(BI)、III系(F)、IV系(La Sota)和V4株等，均屬于經(jīng)典型(基因I型、II型)。雖然II型與νπ型同屬一個(gè)血清型，但在遺傳距離上相差較遠(yuǎn)，抗原有一定的差異性。而疫苗株與當(dāng)前流行株之間的基因型和抗原差異性，是導(dǎo)致新城疫免疫失敗的重要原因(秦卓明，徐懷英，劉玉山，黃兵，李玉峰，黃迪海.疫苗免疫壓力下新城疫病毒的動(dòng)態(tài)演化[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47 (02):1-6.)。因此，研制一種針對(duì)新城疫病毒基因VII型的疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一株分離的雞新城疫病毒YT毒株；
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供從該雞新城疫病毒YT毒株中分離的全基因組序列；
[0007]本發(fā)明的目的之三是將所述雞新城疫病毒YT毒株及其全基因應(yīng)用于制備防治雞新城疫疫苗；
[0008]本發(fā)明的目的之四是將所述雞新城疫病毒YT毒株及其全基因應(yīng)用于制備抗雞新城疫病毒中和抗體。
[0009]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明于2011年11月從山東煙臺(tái)某雞場(chǎng)病死雞的腸道、肺臟、腦等組織中分離得到一株雞新城疫病毒YT毒株。本發(fā)明將分離的雞新城疫病毒YT毒株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8789 ;分類命名為:雞新城疫病毒。保藏單位:中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2014年02月14日；保藏地址:中國(guó)北京朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0011]對(duì)雞新城疫病毒YT毒株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，其基因組全長(zhǎng)為15192bp，其基因組核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0012] 本發(fā)明對(duì)蝕斑純化后的病毒YT毒株進(jìn)行了致病力和序列分析，鑒定所分離的YT毒株為普遍流行的新城疫基因VIId型強(qiáng)毒株。
[0013]為了驗(yàn)證本發(fā)明分離的YT毒株的免疫保護(hù)效力，本發(fā)明分別將YT毒株制備成滅活疫苗，將所制備的滅活疫苗與商品化的La Sota疫苗一同進(jìn)行免疫保護(hù)效力測(cè)定。本發(fā)明用同等病毒滴度的La Sota疫苗及YT疫苗免疫雞群后，分別測(cè)定抗體增長(zhǎng)情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，YT疫苗和La Sota疫苗免疫14天后的抗體都達(dá)到新城疫抗體能夠保護(hù)的水平41og2以上。YT疫苗免疫后抗體增長(zhǎng)比較快，而且較La Sota疫苗免疫后的抗體水平高。證明本發(fā)明所分離的YT株有良好的免疫原性。通過(guò)攻毒保護(hù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，YT疫苗和La Sota疫苗都能夠提供90%以上的保護(hù)。La Sota免疫組分別用F48E8標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒、WFD株和基因VII型YT株攻毒后均死亡I只，共死亡3只，而YT免疫組無(wú)雞只死亡。從病毒分離情況可看出，YT免疫組病毒分離率均在25%以下，遠(yuǎn)低于La Sota免疫組58%~75%的病毒分離率。說(shuō)明接種YT疫苗能夠提供更好的臨床保護(hù)率并且能夠降低排毒率。
[0014]La Sota疫苗及YT疫苗免疫后的抗血清分別與YT和La Sota抗原進(jìn)行交叉血凝抑制反應(yīng)。結(jié)果表明，用YT抗原測(cè)定免疫La Sota的血清HI效價(jià)比用La Sota抗原測(cè)定免疫La Sota株的血清HI效價(jià)低，平均低31og2，說(shuō)明La Sota株的抗血清與YT抗原交叉反應(yīng)性較低。YT株抗血清與兩毒株的抗原血凝抑制反應(yīng)效價(jià)也有差異，但HA效價(jià)測(cè)定值都比較高，說(shuō)明與La Sota株抗血清相比,YT株抗血清對(duì)YT抗原及La Sota抗原的交叉反應(yīng)性更好。
[0015]本發(fā)明還提供了雞新城疫病毒YT毒株在制備防治雞新城疫疫苗中的應(yīng)用。
[0016]為此，本發(fā)明提供了一種防治雞新城疫的疫苗組合物，包括:預(yù)防或治療上有效量的本發(fā)明所分離的雞新城疫病毒YT滅活株以及藥學(xué)上可接受的佐劑白油。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備所述預(yù)防雞新城疫的疫苗組合物的方法，該方法包括:
[0018]將雞新城疫病毒YT毒株增殖獲得病毒液；將病毒液滅活后與佐劑混合均勻，乳化，即得。
[0019]優(yōu)選的，按體積比計(jì)，將滅活后的病毒液與白油佐劑按照2:3的比例混合即制備成滅活疫苗。
[0020]本發(fā)明所制備的疫苗能夠有效預(yù)防基因VII型雞新城疫病毒。
[0021]本發(fā)明還提供了雞新城疫病毒全基因在制備預(yù)防雞新城疫病毒疫苗中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步從雞新城疫病毒YT毒株全基因組序列中找到能誘生中和抗體的編碼蛋白的基因片段，表達(dá)和純化該編碼蛋白，該編碼蛋白可用于制備疫苗，預(yù)防雞新城疫病毒。
[0023]本發(fā)明還提供了雞新城疫病毒全基因在制備抗雞新城疫病毒中和抗體中的應(yīng)用，包括:從雞新城疫病毒YT毒株全基因組序列中找到能誘生中和抗體的編碼蛋白的基因片段，表達(dá)和純化該編碼蛋白，免疫BALB/c小鼠。純化后的編碼蛋白能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出中和抗體。通過(guò)單克隆抗體技術(shù)可以制備抗雞新城疫病毒的中和抗體。
[0024]本發(fā)明還提供了一種抗體，抗分離的雞新城疫病毒YT毒株。該抗體具有較好的交叉反應(yīng)，不僅對(duì)基因VII型毒株的攻擊產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，而且也對(duì)基因II型常用疫苗毒株有一定保護(hù)作用。
[0025]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)定義
[0026]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0027]術(shù)語(yǔ)“新城疫”意指由新城疫病毒引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。
[0028]術(shù)語(yǔ)“基因組”意指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。
[0029]術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”意指DNA或RNA中堿基的排列順序。
[0030]術(shù)語(yǔ)“疫苗”意指將病原微生物(如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。
[0031]術(shù)語(yǔ)“佐劑”意指非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。
[0032]術(shù)語(yǔ)“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒價(jià)，衡量病毒滴度的單位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半數(shù)致死量(LD50)。
[0033]術(shù)語(yǔ)“免疫”意指機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別自身與異己物質(zhì)，并通過(guò)免疫應(yīng)答排除抗原性異物，以維持機(jī)體生理平衡的功能。
[0034]術(shù)語(yǔ)“抗體”意指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。
[0035]術(shù)語(yǔ)“中和抗體”意指當(dāng)病原微生物侵入機(jī)體時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病原微生物黏附靶細(xì)胞受體，防止侵入細(xì)胞。
[0036]術(shù)語(yǔ)“抗原”意指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生(特異性)免疫應(yīng)答,并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)(特異性反應(yīng))的物質(zhì)。
[0037]術(shù)語(yǔ)“免疫原性”意指能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力，即指抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性,也指抗原刺激機(jī)體后,機(jī)體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋巴細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)。
[0038]術(shù)語(yǔ)“抗血清”意指一種含有多克隆抗體的血清。
[0039]術(shù)語(yǔ)“SPF雞”意指生長(zhǎng)在屏障系統(tǒng)或隔離器中、無(wú)國(guó)際、國(guó)內(nèi)(尤其是國(guó)內(nèi))流行的主要雞傳染病病原的雞群。
[0040]術(shù)語(yǔ)“血凝現(xiàn)象”意指有血凝素(HA)的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞。
[0041] 術(shù)語(yǔ)“血凝抑制實(shí)驗(yàn)”意指相應(yīng)抗體與病毒結(jié)合后，阻止病毒表面血凝素(HA)與紅細(xì)胞結(jié)合，血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為分離的雞新城疫病毒YT毒株接種CEF細(xì)胞后顯微鏡下的空斑圖。
[0043]圖2為用RT-PCR方法對(duì)分離的雞新城疫病毒YT毒株進(jìn)行鑒定的電泳圖，其中M:DL2000DNA marker ;泳道I~5分別代表用不同的擴(kuò)增引物對(duì)樣品的擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道I表示用H5亞型禽流感(簡(jiǎn)稱H5)特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道2表示用H9亞型禽流感(簡(jiǎn)稱H9)特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道3表示ND (樣品)擴(kuò)增結(jié)果；泳道4表示用傳染性支氣管炎病毒(簡(jiǎn)稱IB)特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道5表示用傳染性法氏囊病病毒(簡(jiǎn)稱IBD)特異性引物擴(kuò)增結(jié)果)。
[0044]圖3為雞新城疫病毒YT毒株F基因的擴(kuò)增，其中M:Marker2000 ;1和2為擴(kuò)增的F基因片段。
[0045]圖4為雞新城疫病毒YT毒株的F基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析。
[0046]圖5為雞新城疫病毒YT毒株的F基因同源性比較分析。
[0047]圖6為L(zhǎng)a Sota疫苗及YT疫苗免疫后抗體增長(zhǎng)情況。
[0048]圖7為用La Sota和YT疫苗免疫后的抗血清分別與YT和La Sota抗原進(jìn)行交叉血凝抑制反應(yīng)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050]1、實(shí)驗(yàn)材料及動(dòng)物
[0051]新城疫WFD株由華都詩(shī)華生物制品有限公司研發(fā)部分離鑒定；NDV La Sota株和F48E8株均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(NDV La Sota株的商品編號(hào)為AV1615 ;F48E8株的商品編號(hào)為AV1611) ;SPF雞胚購(gòu)自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6周齡SPF雞，購(gòu)自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雞胚成纖維細(xì)胞；雛雞(I日齡)；非免疫雞胚；RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；GoTaqMix購(gòu)自Promega公司。
[0052]實(shí)施例1雞新城疫病毒YT株的分離及純化
[0053]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0054]1.1病料采集及處理
[0055]2011年11月山東煙臺(tái)某雞場(chǎng)爆發(fā)以神經(jīng)癥狀為主要特征的傳染性疾病，解剖發(fā)現(xiàn)病死雞除嗉囊有大量粘液以外，無(wú)典型病變。采集病死雞的腸道、肺臟、腦、氣管、肝臟、腎臟、脾臟，_20°C保存。
[0056]在生物安全柜中將每種病料取大約2g加入到滅菌研磨器中；研磨器中加入4ml滅菌PBS液，手動(dòng)研磨約5分鐘；將研磨好的病料懸濁液倒入離心管中，4°C 5000rpm離心IOmin ;在生物安全柜中將離心后的病料上清液吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中；一管上清液凍存于_20°C作為備份，另一管存于4~8°C以備接種。
[0057]1.2病毒YT株的分離
[0058]在生物安全柜中將病料上清液用0.2 μ m濾膜無(wú)菌過(guò)濾；經(jīng)尿囊腔接種9~11日齡的SPF雞胚，每胚0.2mL ;37°C孵化，每日照蛋2次，將24h內(nèi)死亡的雞胚棄掉；24h后，每3~5h照蛋I次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至120h ;不論死亡或存活，取出所有雞胚，氣室向上直立，置2~8°C冰箱冷卻8~16h，收獲尿囊液。
[0059]1.3分尚病毒YT株的空斑純化
[0060]將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在6孔板中培養(yǎng)成單層，吸棄營(yíng)養(yǎng)液，用Hanks’液洗2次。用不含血清的維持液將收獲的尿囊液作10倍連續(xù)稀釋，分別取10_5，IO-6,10_73個(gè)稀釋度接種雞胚成纖維細(xì)胞，接種后置37°C感作I小時(shí)，吸出病毒液，每孔加3mL的瓊脂糖-MEM(50mL離心管中加入20mL2XMEM、20mLl.6%的瓊脂糖、6mL7.5% NaHCO3混勻并立即放入45°C水浴鍋中待用)覆蓋，將板置于室溫放置，待瓊脂糖凝固后，將板倒置于37°C，5%CO2的溫箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，直到出現(xiàn)空斑。連續(xù)純化3次，即得到純化的雞新城疫病毒YT毒株。
[0061]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0062]采集病死雞的腸道、肺臟、腦等組織，將每種病料研磨離心，將病料上清液經(jīng)尿囊腔接種SPF雞胚，收集尿囊液，即獲得分離的病毒YT株。將分離的病毒YT株接種到狀態(tài)良好的CEF細(xì)胞上，經(jīng)孵育得到了大小均一的空斑，在顯微鏡下觀察到形成的空斑周圍的細(xì)胞由于病毒的侵染而死亡(圖1)。如此經(jīng)CEF細(xì)胞純化3次后，得到了純凈的雞新城疫病毒YT毒株。
[0063]實(shí)驗(yàn)例I雞新城疫病毒YT株的基因型分析
[0064]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0065]1.1病毒YT株的PCR鑒定
[0066]病毒基因組RNA提取按照Omega Total RNA KIT II提取試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。以所提取的RNA樣品為模板，采用RT-PCR方法合成單鏈cDNA。以此cDNA為模板，利用下述引物(該引物為新城疫病毒的特異性鑒別引物，用此引物可以鑒別是否是新城疫病毒)，在Taq酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。
[0067]引物序列為:
[0068]上游引物:5’-ACGGGTAGAAGGTGTGAA-3’ ；
[0069]下游引物:5，-CCTTGCTGCATRTACTT-3，。
[0070]PCR反應(yīng)體系:
[0071 ] dNTP (2.5pmol/ μ L) 4.0 μ L
[0072]10XPCR buffer5.0 μ L
[0073]Taq DNA 聚合酶0.5 μ L
[0074]上游引物2.0yL
[0075]下游引物2.0yL
[0076]模版cDNA2.0 μ L
[0077]ddH20up to50 μ L
[0078]PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，循環(huán)32次；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0079]1.2病毒YT株的基因型分析
[0080]病毒基因組RNA提取按照Omega Total RNA KIT II提取試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。RNA 的反轉(zhuǎn)錄按照如下體系進(jìn)行:5XBuffer4 μ L ；2.5mMdNTPs6 μ L ；RP2 μ L ；AMV1 μ L。將混合液在漩渦儀上混勻，經(jīng)掌上離心機(jī)短暫離心，甩下管蓋及管壁上的液體。常溫放置5min后；然后42°C水浴Ih即反轉(zhuǎn)成cDNA。
[0081]根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的F基因核甘酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，
[0082]Pl:5，-TTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA ；
[0083]P2:5， -ACAAARTGRTGCATCTTCCC。
[0084]按如下的順序加樣進(jìn)行PCR 反應(yīng):Promega go Taq(Mix) 12.5 μ L ；ddH209.5 μ L ；Pll μ L ；Ρ21 μ L ；TemPlatel μ L?；靹蚝?，稍微離心迅速置于冰上，進(jìn)行下列循環(huán)反應(yīng):94°C反應(yīng)3min使模板變性。循環(huán)為30個(gè)，在每一循環(huán)中，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，循環(huán)結(jié)束后，終延伸為94°C，10min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后序列用DNA Star Lasergene5.1進(jìn)行比對(duì)。
[0085]1.3病毒YT株的全基因組測(cè)序
[0086]提取病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)雞新城疫病毒YT株進(jìn)行全基因序列測(cè)定。
[0087]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0088]2.1病毒YT株的PCR鑒定
[0089]提取病毒YT株的RNA，采用RT-PCR法，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出了預(yù)期目的片段，凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。
[0090]2.2病毒YT株的基因型分析
[0091]病毒基因組RNA經(jīng)RT-PCR成功擴(kuò)增出約500bp的F基因片段(圖3)。將片段進(jìn)行純化測(cè)序，經(jīng)序列分析，該毒株具有NDV強(qiáng)毒株特征性序列(112-R-R-Q-K-R-F-117)，且具有NDV基因VII型的特征性氨基酸，即101位的K和121位的V。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該毒株為基因VIId型毒株(圖4)，為現(xiàn)階段中國(guó)最普遍流行的毒株，可以作為普遍流行的基因VII型毒株的代表來(lái)進(jìn)行相關(guān)疫苗研究。
[0092]2.3病毒YT株的全基因組測(cè)序
[0093]對(duì)雞新城疫病毒YT株的全基因序列測(cè)定已經(jīng)完成，基因組全長(zhǎng)為15192bp，其基因組核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0094]實(shí)驗(yàn)例2雞新城疫病毒YT株的致病力測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0095]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0096]1.1病毒YT株的MDT測(cè)定
[0097]將40枚雞胚分為兩組，每組20枚，分別標(biāo)記為“A”組和“B”組。將病毒YT株稀釋為10_7，10Λ IO-9的稀釋度接種雞胚，首先接種“A”組，8h后接種“B”組，尿囊腔接種9~11日齡雞胚，0.1mL/枚,每個(gè)稀釋度接種5枚。24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，統(tǒng)計(jì)能夠?qū)㈦u胚全部致死的最大稀釋度的死亡時(shí)間，計(jì)算病毒的最小致死量的平均死亡時(shí)間。公式為MDT =
(X小時(shí)Xx小時(shí)死胚數(shù)+y小時(shí)Xy小時(shí)的死胚數(shù)+z小時(shí)Xz小時(shí)的死胚數(shù)+..../死
亡雞胚總數(shù)。
[0098]按照雞新城疫病毒YT株的MDT方法測(cè)定了 F48E8、La Sota株的MDT數(shù)據(jù)。
[0099]1.2腦內(nèi)接種致病指數(shù)ICPI的測(cè)定
[0100]雛雞(I日齡)10只，腦內(nèi)接種10倍稀釋后的病毒液0.05mL，另外10只雛雞注射同等劑量的生理鹽水作對(duì)照。接種24h后，觀察雛雞死亡情況，24h內(nèi)死亡視為非特異性死亡。每24h觀察一次，連續(xù)觀察8天。每次觀察應(yīng)給雞打分。打分標(biāo)準(zhǔn)如下:正常雞計(jì)為O分，發(fā)病一只雞記錄為I分，死亡一只雞記錄2分。每天記錄一次(如第一天死亡，則連續(xù)6天,每天記錄各2分)。ICPI值=每只雞在8天內(nèi)的所有分?jǐn)?shù)的總和/(10只雞X8天)。
[0101]1.3靜脈接種致病指數(shù)IVPI的測(cè)定
[0102]用0.1mL/羽翅靜脈接種6周齡SPF雞10只。另外10只雞注射同等劑量的生理鹽水作對(duì)照。每日觀察雞的發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10d。根據(jù)每只雞的癥狀用數(shù)字方法每天進(jìn)行記錄:正常雞計(jì)為0，病雞(雞只蜷縮在一起不愿運(yùn)動(dòng)，不愿采食或飲水，但無(wú)明顯的翅、腿麻痹表現(xiàn))計(jì)為1，重病雞(翅、腿明顯不協(xié)調(diào)，翅膀下垂)計(jì)為2，死亡雞計(jì)為3。
[0103]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0104]2.1病毒YT株的MDT測(cè)定
[0105]病毒YT株的最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT)為45.8h，F(xiàn)48E8的MDT為43.2h，La Sota 株的 MDT 為 101.2h。
[0106]2.2腦內(nèi)接種致病指數(shù)ICPI的測(cè)定
[0107]所有經(jīng)腦內(nèi)接種NDV毒株的I日齡雛雞大多在I~2天內(nèi)死亡，而生理鹽水對(duì)照組在觀察8天內(nèi)全部正常。接毒組的部分雛雞在接毒后開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，發(fā)病急，精神極度委靡，呆立，進(jìn)而呼吸困難、伸頸，進(jìn)而死亡。病毒YT株的ICPI值為1.96，證明YT毒株為新城疫強(qiáng)毒株。
[0108]2.3靜脈接種致病指數(shù)IVPI的測(cè)定
[0109]靜脈接毒后發(fā)病雞開(kāi)始表現(xiàn)為呆立，精神不振。進(jìn)而有閉目嗜睡，頭頸震顫，伸頸呼吸，翅下垂，癱瘓等癥狀，并有雞只死亡。死亡雞喙發(fā)紺，眼部有分泌物、眼瞼粘連，嗉囊脹氣。經(jīng)計(jì)算靜脈接種致病指數(shù)為2.59，證明本發(fā)明所分離的新城疫YT毒株為嗜神經(jīng)型強(qiáng)毒。
[0110]實(shí)驗(yàn)例3 NDV基因VII型YT株和WFD株致病力試驗(yàn)及其效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0111]一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> [0112]本發(fā)明在分離新城疫(NDV)基因VII型YT株的過(guò)程中，同時(shí)分離了一株雞新城疫基因VII型毒株WFD株，本實(shí)驗(yàn)將YT株和WFD株致病力的致病力和效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定。
[0113]二、實(shí)驗(yàn)材料及方法
[0114]I 材料
[0115]1.1攻毒種毒
[0116]1.1.1批號(hào)、數(shù)量和分裝:新城疫實(shí)驗(yàn)室試制產(chǎn)品。
[0117]表1
[0118]
【權(quán)利要求】
1.編碼雞新城疫病毒(Newcastledisease virus) YT株的全基因,其特征在于:所述全基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
2.一株分離的雞新城疫病毒(Newcastle disease virus)毒株,其特征在于:其微生物保藏編號(hào)為:CGMCC N0.8789。
3.按照權(quán)利要求2所述的雞新城疫病毒毒株，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的全基因。
4.權(quán)利要求1所述的全基因在制備預(yù)防雞新城疫疫苗中的用途。
5.權(quán)利要求2或3所述的雞新城疫病毒毒株在制備預(yù)防雞新城疫疫苗中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的全基因在制備抗雞新城疫病毒中和抗體試劑或藥物中的用途。
7.權(quán)利要求2或3所述的雞新城疫病毒毒株在制備抗雞新城疫病毒中和抗體試劑或藥物中的用途。
8.一種防治雞新城疫的疫苗組合物，其特征在于，包括:權(quán)利要求2或3所述的預(yù)防或治療上有效量的雞新城疫病毒滅活株以及藥學(xué)上可接受的佐劑。
9.一種抗體，其 特征在于:抗權(quán)利要求2或3所述的雞新城疫病毒毒株。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK103937817SQ201410194093
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】楊國(guó)良, 丁春宇, 張凌云, 張?zhí)? 王亞麗, 孫豐廷, 張紅 申請(qǐng)人:北京華都詩(shī)華生物制品有限公司