一個(gè)玉米紋枯病抗病相關(guān)基因grmzm2g315431及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個(gè)玉米抗紋枯病相關(guān)基因GRMZM2G315431的功能驗(yàn)證和應(yīng)用，利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將GRMZM2G315431基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中花11。GRMZM2G315431基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明GRMZM2G315431基因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用。
【專利說(shuō)明】-個(gè)玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 GRMZM2G315431及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一個(gè)玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 GRMZM2G315431的功能驗(yàn)證，GRMZM2G315431基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)紋枯 病菌的抗性明顯增強(qiáng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病 毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果：（1)病原體成功的在寄主植物內(nèi) 繁殖，引起相關(guān)病癥；（2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基 因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。參與植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 類：（1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和（2)抗病相關(guān)基因。
[0004] 根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直 接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑（Tang等，1996， Science 274:2060-2063 ;Baker 等，1997, Science 276:726-733 ;Jia 等，2000, EMBO J. 19:4004-4014;Dangl 和 Jones，2001，Nature 411:826-833 ;Nimchuk 等，2001，Curr. Opin. Plant Biol. 4:288-294)。抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于 下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的資源有限，如目前知道 的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗 病基因也只有大約40個(gè)；（2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有 限；（3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
[0005] 抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與 合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參與信號(hào)傳導(dǎo)或參與防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病 原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差 異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因（Maleck等，2000, Nature Genet. 26 :403-410 ;Schenk 等，2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science in China 45:449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基 因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開(kāi)發(fā)的基 因資源：（1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因 是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參與的抗病反應(yīng)沒(méi)有病原特異性， 因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；（3)這類基因的資源豐富。
[0006] 植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長(zhǎng)期以來(lái)研究者們對(duì)這兩大類抗病 反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性（Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New York)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性（Ou 等，1975， Phytopathology 65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性（Parlevliet，1979，Annu. Rev. Phytopathol. 1:203-222)。質(zhì)量抗性（或垂直抗性或完全抗性）是抗病基因介導(dǎo)的抗病反 應(yīng)。數(shù)量抗性（或水平抗性或部分抗性）是由數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus， QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無(wú)病原特異性，而且抗性持久（Roumen，1994, Rice Blast Disease, Zeigler 等編著，CAB International, Cambridge, UK, ρρ· 245-265) 〇 目前，人 們對(duì)植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如水稻 抗白葉枯病 QTL(Li 等，1999, Mol. Gen. Genet. 261 :58-63)、抗稻瘟病 QTLCWang 等，1994， Genetics 136:1421-1434 ;Chen 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2544-2549)、抗 紋枯病 QTL (Li 等，1995, Theor. Appl. Genet. 91:382-388)和抗病毒病 QTL (Albar 等，1998， Theor. Appl. Genet. 97:1145-1154)等，但這些抗性QTL沒(méi)有被很好地用于植物抗病性的改 良。
[0007] 近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)，提示這些 抗病相關(guān)基因可能就是相對(duì)應(yīng)的QTL?？共∠嚓P(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng) 這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻（Xiong等，2002,中國(guó)科學(xué)45:518-526 ; Ramalingam 等，2003，Mol. Plant-Microbe Interact. 16:14-24 ;Wen 等，2003，Mol. Gen.Genomics 269:331-339;Chu 等，2004, Mol.Gen.Genomics 271:111-120)、小 麥（Faris 等，1999, Theor. Appl.Genet. 98:219-225)、豆類（Geffroy 等，2000, Mol. Plant-Microbe Interact. 13:287-296)和馬鈴薯（Trognitz 等，2002，Μ〇1· Plant-Microbe Interact. 15:587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因 提供了依據(jù)。
[0008] 玉米和水稻是世界上重要的糧食作物，但紋枯病常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降， 并且玉米和水稻紋枯病菌可以互相侵染。因此，了解紋枯病的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途 徑改良玉米和水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來(lái)的損失。分離 克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)玉米和水稻抗病機(jī)理研究的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗 病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過(guò)超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行玉 米和水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī) 植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。因此如何利用玉米抗病基因的克隆獲得抗病植株成為 亟待解決的問(wèn)題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一個(gè)從玉米中分離克隆出的抗 病相關(guān)基因 GRMZM2G315431完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用其改良玉米和水稻抵御病害的 能力，其基因的序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，編碼序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，編 碼氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示。GRMZM2G315431基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn) 化水稻對(duì)紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對(duì)由紋枯病菌所 引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
[0010] 發(fā)明人首先提供了一個(gè)從玉米中分離克隆出的抗病相關(guān)基因 GRMZM2G315431完 整編碼區(qū)段的DNA片段，其基因的序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，編碼序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，編碼氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 獲得了這一片段之后，將其與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植 物，發(fā)現(xiàn)GRMZM2G315431基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)紋枯病菌的抗性明顯增 強(qiáng)，證明GRMZM2G315431基因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用，因此證實(shí)了超量表達(dá)該基 因后可以賦予植物對(duì)由紋枯病菌所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
[0012] 該基因片段來(lái)源于玉米B73,其通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增玉米B73CDNA獲得，其中 所述的引物包括引物1，5< -ATGCCGCCGCCTCCACCA-3'其序列如序列表SEQ IDN0. 4所示， 引物2,5^ -CTATAGCACGCGAACGACACGCT-3'其序列如序列表SEQ ID NO. 5所示，之后利用 強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將GRMZM2G315431基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種中 花11。GRMZM2G315431基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)， 證明GRMZM2G315431基因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用。
[0013] 之所以采用上述的方法，主要是由于將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有 助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗性基因，而不會(huì) 產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列。而抗病相關(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種 不能植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問(wèn)題的前提。
[0014] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國(guó)際上首次驗(yàn)證了一個(gè)玉米抗病相關(guān)基因的功能， 利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對(duì)由紋枯病菌所引起的病害產(chǎn)生抗 病反應(yīng)，獲得高抗病植株。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1.接種紋枯病菌YWK62和YWK196后GRMZM2G315431基因的表達(dá)檢測(cè)；
[0016] 結(jié)果表明，接種紋枯病菌后GRMZM2G315431被誘導(dǎo)表達(dá)，在接種4h后表達(dá)達(dá)到峰 值隨后逐漸降低；
[0017] 圖2. GRMZM2G315431量表達(dá)T1代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種紋枯病菌YWK1967天后結(jié)果 示意圖；
[0018] 圖3為圖2中結(jié)果的柱狀圖；
[0019] 圖中，超量表達(dá)T1代遺傳轉(zhuǎn)化植株（pCXUN : :GRMZM2G315431-3、5和6)接種紋枯 病菌YWK1967天后形成的病斑明顯比水稻品種中花11 (對(duì)照）的短；
[0020] 中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0022] 實(shí)施例I :GRMZM2G315431基因接種紋枯病菌后的表達(dá)模式
[0023] 為了檢測(cè)GRMZM2G315431基因受紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)模式，利用qRT-PCR檢測(cè)了這 個(gè)基因接種病原菌后的表達(dá)，所用引物為引物3,5' -CGCGGTGCTCATCAACAG-3'其序列如 序列表SEQ ID NO. 6所示，引物4,5< -CGTCGGTCTGGTCGAACAG-3'其序列如序列表SEQ ID NO. 7所示。分析結(jié)果表明，GRMZM2G315431基因能夠受YWK196和YWK62的誘導(dǎo)（圖1)，說(shuō) 明其基因參與了玉米對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)。
[0024] 實(shí)施例2 :分離克隆GRMZM2G315431基因
[0025] 發(fā)明人根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)GRMZM2G315431基因序列設(shè)計(jì)引物（引物1， 5 ' -ATGCCGCCGCCTCCACCA-3 '其序列如序列表 SEQ ID NO. 4 所示，引物 2， 5 ^ -CTATAGCACGCGAACGACACGCT-3 '其序列如序列表SEQ ID NO. 5所示）用來(lái)獲得 GRMZM2G315431基因。提取玉米B73RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA作為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；
[0026] 反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94°C5min，變性94°C40s，退火54°C40s，延伸72°C I. 5min， 反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，后延伸72°C 7min ;
[0027] 結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片 段連接至載體pGEM-Τ中（Promega公司），轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆提 質(zhì)粒，測(cè)序由華大基因完成，獲得長(zhǎng)度為2097bp的GRMZM2G315431片段，具有序列表SEQ ID NO. 2的DNA序列。
[0028] 實(shí)施例3 :GRMZM2G315431基因的功能驗(yàn)證
[0029] 將上述純化的cDNA片段通過(guò)TA克隆連入超量表達(dá)載體pCXUN，熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后對(duì)重組子進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，重組子中包含有與目的 片段大小相同的條帶。將鑒定好的重組子擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序后與原序列比 對(duì)，連入的片段為全長(zhǎng)cDNA并且沒(méi)有堿基突變和缺失，證明GRMZM2G315431超量表達(dá)載體 pCXUN : :GRMZM2G315431 構(gòu)建成功。
[0030] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Lin和Zhang,Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice,2005, Plant Cell Rep. 23:540-547)將超量表達(dá)載體導(dǎo)入水稻品種中花11。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為 pCXUN: :GRMZM2G315431。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株12株，其中陽(yáng)性植株為8株。分別 對(duì)T1代3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系pCXUN: :GRMZM2G315431-3、5、6的10個(gè)單株進(jìn)行玉米紋枯病菌的 接種鑒定。結(jié)果表明，接種紋枯病菌YWK1967天后，超量表達(dá)GRMZM2G315431的轉(zhuǎn)基因植株 與野生型相比平均病斑縮短了 3. llcm、3. 59cm和1.70cm(表1，圖2)，說(shuō)明GRMZM2G315431 參與了水稻對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)。
[0031] 表1GRMZM2G315431超量表達(dá)植株接種YWK1967天后的病斑長(zhǎng)度
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 GRMZM2G315431，其特征在于：其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 GRMZM2G315431在作物改良提高對(duì)紋枯 病抗性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104278042SQ201410563304
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】?jī)?chǔ)昭輝, 丁新華, 李寧 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)