本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ALL(Acute Lymphoblastic Leukemia，急性淋巴細(xì)胞白血病)預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法。本發(fā)明還提供了該檢測(cè)方法所使用的引物以及包含該引物的試劑盒。

背景技術(shù)：

ALL是一種起源于B系或T系淋巴祖細(xì)胞的腫瘤性疾病，原始細(xì)胞在骨髓異常增生和聚集并抑制正常造血，導(dǎo)致貧血，血小板減少和中性粒細(xì)胞減少；原始細(xì)胞也可侵及髓外組織，如腦膜、性腺，胸腺、肝、脾，或淋巴結(jié)等，引起相應(yīng)病變。2008年WHO對(duì)ALL的診斷標(biāo)準(zhǔn)是：細(xì)胞形態(tài)、免疫表型，骨髓原始及幼稚淋巴細(xì)胞≥20％，分類為：①前體B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(細(xì)胞遺傳學(xué)亞型)：t(9；22)(q34；q11)，(BCR/ABL)；t(4；11q23)，(MLL重排)；t(1；19)(q23；p13)，(E2A/PBX1)；t(12；21)(p12；q22)，(ETV/CBFα)；②前體T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)；③Burkitt細(xì)胞白血病。

雖然ALL治愈率提高到了90％，但該病一旦復(fù)發(fā)，其結(jié)果常常是致命的。ALL的復(fù)發(fā)率高，成人相對(duì)于兒童預(yù)后不良，應(yīng)依據(jù)疾病危險(xiǎn)分組進(jìn)行個(gè)體化治療，防治感染和出血，以減少?gòu)?fù)發(fā)，延長(zhǎng)無(wú)病生存時(shí)間，因此對(duì)ALL的復(fù)發(fā)及用藥指導(dǎo)非常重要。CREBBP基因編碼轉(zhuǎn)錄共激活因子乙酰轉(zhuǎn)移酶CREB結(jié)合蛋白，在正常血細(xì)胞發(fā)育中起著重要作用，幫助開(kāi)啟和關(guān)閉其他基因，St.Jude兒童研究醫(yī)院的研究人員稱，該基因是復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的潛在指示器，因?yàn)閺?fù)發(fā)患者的CREBBP基因突變頻率高，而且診斷時(shí)就存在的那些變化或復(fù)發(fā)時(shí)白血病細(xì)胞亞群所出現(xiàn)的變化從一開(kāi)始就持續(xù)存在著。研究人員還發(fā)現(xiàn)，基因的重要調(diào)節(jié)區(qū)會(huì)發(fā)生變化，并且這些變化會(huì)影響細(xì)胞功能，比如影響癌癥細(xì)胞對(duì)類固醇類藥物的反應(yīng)，這點(diǎn)在癌癥治療中具有重要意義。綜上所述，CREBBP基因有助于癌癥病毒對(duì)類固醇類藥物治療產(chǎn)生抑制作用，從而助長(zhǎng)ALL的復(fù)發(fā)。

鑒于CREBBP基因在ALL患者及正常組織中的表達(dá)特點(diǎn)，其基因突變情況可能為ALL復(fù)發(fā)及用藥指導(dǎo)提供重要的分析依據(jù)，通過(guò)分析CREBBP基因相關(guān)突變進(jìn)行ALL預(yù)后評(píng)估是具有前景的技術(shù)研究方向。因此，如何快速全面的獲得檢測(cè)對(duì)象ALL預(yù)后CREBBP基因的突變數(shù)據(jù)，成為當(dāng)前需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前ALL預(yù)后評(píng)估的檢測(cè)技術(shù)存在的準(zhǔn)確率和便捷性不足的問(wèn)題，提供了一種新的ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法及相應(yīng)的引物和試劑盒，綜合應(yīng)用PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序技術(shù)，可準(zhǔn)確快速的檢測(cè)出檢測(cè)對(duì)象ALL預(yù)后相關(guān)的CREBBP基因的突變情況，為ALL預(yù)后評(píng)估提供分析依據(jù)。

本發(fā)明實(shí)施例一種ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法，包括步驟如下：

S1.提取基因組DNA檢測(cè)樣本：采集血液，提取其中的基因組DNA作為檢測(cè)樣本；

S2.進(jìn)行PCR擴(kuò)增：使用特異性引物對(duì)所述檢測(cè)樣本中所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP外顯子(Expressed Region,Exon)區(qū)段的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；

S3.擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序：對(duì)S2中獲得的所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果；

S4.基因突變比對(duì)：將所述測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)，獲取基因突變檢測(cè)結(jié)果；

其中，所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子包括：第25號(hào)、第26號(hào)、第27號(hào)和第28號(hào)外顯子。

優(yōu)選的，與所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子區(qū)段對(duì)應(yīng)的特異性引物在序列表中分別為：

CREBBP基因外顯子：

第25號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。

優(yōu)選的，所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子還包括：第4號(hào)、第6號(hào)、第10號(hào)、第14號(hào)、第16號(hào)、第31a號(hào)、第31b號(hào)、第31c號(hào)和第31d號(hào)外顯子。

進(jìn)一步優(yōu)選的，與所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子區(qū)段對(duì)應(yīng)的特異性引物在序列表中分別為：

CREBBP基因外顯子：

第4號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；

第6號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；

第10號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；

第14號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ ID NO.8；

第16號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.9下游引物：SEQ ID NO.10；

第25號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18；

第31a號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.19下游引物：SEQ ID NO.20；

第31b號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.21下游引物：SEQ ID NO.22；

第31c號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.23下游引物：SEQ ID NO.24；

第31d號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.25下游引物：SEQ ID NO.26。

對(duì)步驟S1優(yōu)選的，采集濃度為50～100ng/μL的DNA溶液50μL，使用所述特異性引物配制引物濃度為5pmol/μL的引物使用液用于PCR擴(kuò)增。

優(yōu)選的，執(zhí)行所述步驟S3前對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

對(duì)步驟S3優(yōu)選的，使用3500XL測(cè)序儀對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；對(duì)步驟S3優(yōu)選的，使用Mutation Surveyor軟件和VECTOR NTI軟件將所述測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)分析，尋找發(fā)生突變的基因位點(diǎn)，獲得所述基因突變檢測(cè)結(jié)果。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種用于前述ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法的引物，包括多對(duì)特異性引物，每對(duì)所述特異性引物均包括一上游引物和一下游引物，每對(duì)所述特異性引物均對(duì)應(yīng)一個(gè)所述包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子區(qū)段，所述特異性引物在序列表中的序列分別為：

CREBBP基因外顯子：

第25號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；

第26號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；

第27號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；

第28號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。

優(yōu)選的，所述引物進(jìn)一步包括的特異性引物在序列表中的序列分別為：

CREBBP基因外顯子：

第4號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；

第6號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；

第10號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；

第14號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ ID NO.8；

第16號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.9下游引物：SEQ ID NO.10；

第31a號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.19下游引物：SEQ ID NO.20；

第31b號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.21下游引物：SEQ ID NO.22；

第31c號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.23下游引物：SEQ ID NO.24；

第31d號(hào) 上游引物：SEQ ID NO.25下游引物：SEQ ID NO.26。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種試劑盒，其試劑包含了前述用于所述的ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法的引物。

本發(fā)明應(yīng)用PCR和測(cè)序兩項(xiàng)技術(shù)，主要通過(guò)特異性引物擴(kuò)增基因組DNA中的CREBBP基因的特定外顯子區(qū)段，通過(guò)測(cè)序反應(yīng)對(duì)擴(kuò)增所得到的目的片段進(jìn)行測(cè)序，再通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行比較，檢測(cè)是否存在突變；其有益效果如下：

1.檢測(cè)過(guò)程快速靈敏，操作簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確性高，檢測(cè)結(jié)果明確清晰；

2.檢測(cè)特異性強(qiáng)，采用目前最準(zhǔn)確的基因突變檢測(cè)方法，目的性強(qiáng)；

3.檢測(cè)標(biāo)本采血量少，利于檢測(cè)對(duì)象自身，使用的實(shí)驗(yàn)器材較少，節(jié)約成本。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法的基本流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第4號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第6號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第10號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第14號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第16號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第25號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第26號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第27號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第28號(hào)外顯子突變分析結(jié)果；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例中CREBBP基因第31號(hào)外顯子突變分析結(jié)果，包括31a、31b、31c和31d。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。

本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前ALL預(yù)后評(píng)估的檢測(cè)技術(shù)存在的準(zhǔn)確率和便捷性不足的問(wèn)題，提供了一種新的ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法及相應(yīng)的引物和試劑盒，綜合應(yīng)用了PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序技術(shù)。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法，如圖1所示，包括以下步驟：

S1.提取基因組DNA檢測(cè)樣本：采集血液，提取其中的基因組DNA作為檢測(cè)樣本；

S2.進(jìn)行PCR擴(kuò)增：使用特異性引物對(duì)所述檢測(cè)樣本中包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子區(qū)段的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物；包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子包括第25至28號(hào)，作為優(yōu)選，還可以進(jìn)一步包括第4、6、10、14、16和31a至31d號(hào)；

S3.擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序：對(duì)S2中獲得的所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果；

S4.基因突變比對(duì)：將所述測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)的對(duì)應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)，獲取基因突變檢測(cè)結(jié)果。

本實(shí)施例中，CREBBP基因的基因序列來(lái)源于NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)基因庫(kù)，其NCBI序列號(hào)為NG_009873.1，染色體定位為16p13.3。

CREBBP基因突變見(jiàn)于約19％的復(fù)發(fā)ALL，特別易見(jiàn)于復(fù)發(fā)的超二倍體ALL，該突變可削弱組蛋白乙酰化作用和對(duì)CREBBP靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括糖皮質(zhì)激素反應(yīng)基因。熱點(diǎn)突變區(qū)域位于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)結(jié)構(gòu)域，CREBBP基因突變者對(duì)激素療效差可能是ALL復(fù)發(fā)的原因，用組蛋白去乙?；敢种苿┛赡苡行?。

具體的實(shí)施方式如下：

步驟S1中，采集臨床標(biāo)本確診的ALL患者的血液，提取其中的基因組DNA；提取基因組DNA可使用常規(guī)的試劑盒柱提法，按照所用試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，收集到50μL濃度為50～100ng/μL的DNA溶液，可直接用于檢測(cè)或在-20℃下保存；

步驟S2中，使用所述試劑盒中的特異性引物配制溶液，其中特異性引物濃度為5pmol/μL；每對(duì)所述特異性引物均包括一條上游引物和一條下游引物，用于對(duì)與其對(duì)應(yīng)的包含熱點(diǎn)突變的CREBBP基因外顯子特定區(qū)段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的外顯子具體見(jiàn)下表1：

在滿足PCR引物的設(shè)計(jì)要求的前提下，特異性引物可根據(jù)引物設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)為不同的序列；

步驟S2中可使用上表中第11至18號(hào)引物對(duì)相應(yīng)的CREBBP基因第25至28號(hào)外顯子特定區(qū)段的DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增；作為優(yōu)選的實(shí)施方式，使用上表中全部引物，對(duì)相應(yīng)的CREBBP基因第4、6、10、14、16、25至28、31a至31d號(hào)外顯子特定區(qū)段的DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得更全面的檢測(cè)結(jié)果；

步驟S3中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)下表2：

使用的特異性引物序列參見(jiàn)上表1，PCR擴(kuò)增可使用普通PCR儀，擴(kuò)增反應(yīng)程序見(jiàn)下表3：

為保證PCR擴(kuò)增結(jié)果，可在測(cè)序前先對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，空白對(duì)照為無(wú)擴(kuò)增條帶，如樣本條帶大小正確(參照上表1中記載的擴(kuò)增產(chǎn)物大小)且條帶單一，即可將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送檢測(cè)序；

步驟S3中，使用3500XL測(cè)序儀，依常規(guī)操作方法，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；

步驟S4中，使用Mutation Surveyor軟件和VECTOR NTI軟件對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序所得待測(cè)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)分析，尋找基因突變位點(diǎn)，獲得檢測(cè)結(jié)果。

如圖2至圖11所示為采用本實(shí)施例檢測(cè)方法對(duì)一病例進(jìn)行檢測(cè)得到的ALL預(yù)后CREBBP基因突變的分析譜圖，根據(jù)圖示結(jié)果，若存在一個(gè)雜合點(diǎn)突變，如CREBBP P928，則該對(duì)應(yīng)位置會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)峰，如下圖所示。

通過(guò)對(duì)上述基因突變檢測(cè)結(jié)果的進(jìn)一步分析，可以對(duì)ALL患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

本發(fā)明的另一實(shí)施例還提供了前述技術(shù)方案所述的ALL預(yù)后相關(guān)基因突變檢測(cè)方法中所使用的引物，所述引物包括多對(duì)特異性引物，具體序列參見(jiàn)上表1；作為不同的實(shí)施方式，所述引物可包括表1中第11至18號(hào)共四對(duì)特異性引物，也可以包括表1中全部十三對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的CREBBP基因不同數(shù)量的外顯子區(qū)段。

本發(fā)明的另一實(shí)施例還提供了包含前述技術(shù)方案所述的引物的試劑盒。

本發(fā)明旨在通過(guò)對(duì)CREBBP基因突變的準(zhǔn)確檢測(cè)獲得可供急性淋巴細(xì)胞白血病用藥指導(dǎo)及預(yù)后評(píng)估的分析數(shù)據(jù)，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病用藥指導(dǎo)和預(yù)后評(píng)估具有特異性的指導(dǎo)意義，屬于目前最先進(jìn)的診療手段，可在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重大的作用。

應(yīng)理解，上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于供本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并非具體實(shí)施方式的窮舉，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。